CN105038766B - 一种可视可逆的比率荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可视可逆荧光探针，其含有花菁荧光基团和苯并噻唑基团，通式为。本发明的可逆荧光探针的制备方法包括步骤：（1）向水杨醛与多聚甲醛中滴加三氯氧磷反应得产物1；（2）产物1与环六亚甲基四胺反应得到产物2；（3）将产物2与2‑氨基苯硫醇室温反应得产物3；（4）产物3与化合物4反应即得。本发明比率荧光探针在自然光下或紫外灯下都可看出明显的颜色变化，只需在自然光或是一个手提式紫外灯下就可以实现二氧化硫气体的定性检测，操作简单，方便快捷，效果显著；本发明荧光探针能有效避免样品中其他杂质的干扰，选择性好，同时样品也不需要繁琐的预处理过程，检测效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能化可视可逆荧光探针及其制备方法与用途，特别涉及一种微量气体污染物的可视可逆的荧光检测探针及其制备方法。
背景技术
近十几年来，我国的经济发生了翻天覆地的变化，科学技术也取得了巨大的进步，但也引起了一系列的环境污染问题。其中的大气污染是当前最突出的问题之一，EPA(Environment Protection Agency)规定的六种标准污染物中，二氧化硫就是其中的第一大污染物。二氧化硫一般通过呼吸道进入人体，由于其易溶于水，很多被阻塞在上呼吸道，进而形成其衍生物如亚硫酸、硫酸盐等，更加刺激了呼吸道，从而引发一系列的呼吸道疾病。亚硫酸氢盐和亚硫酸盐可作为食品添加剂，但是过量摄入将导致不良反应如低血压、腹泻、荨麻疹等。综上所述，实现二氧化硫及其衍生物的检测对环境保护和食品安全具有重要的意义。近些年来，荧光传感技术已经越来越广泛地应用于阴离子、重金属、生物小分子以及一些有害气体的检测。与传统的分析检测方法相比，如分光光度法、色谱分析法和电化学分析法等，荧光光谱技术具有其独特的优点，如灵敏度高，选择性好，响应速度快，操作简便，最重要的一点是，荧光光谱技术可用于生物体内细胞成像及目标物的实时检测。目前已经开发的荧光探针主要包括有机分子，生物分子以及纳米材料等。
利用荧光光谱分析技术来检测目标物主要是基于荧光强度和波长的变化来实现，总共有三种模式，包括荧光淬灭，荧光增强以及比率荧光。其中荧光淬灭和荧光增强都是基于单一的荧光强度变化，易受到环境条件、探针浓度以及仪器误差的影响，干扰较大；而比率荧光探针则以同样环境下测定的两个波长处荧光强度的比值作为信号参量，能够抵消掉因环境、样品本身及仪器设备等因素引起的数据失真，从而得到更准确的结果。
黄德建、王素华等人(Anal.Chem.2014,86,9381-9385)曾报道了一种检测二氧化硫及其衍生物的探针，该探针利用对羧基苯甲醛分别连接了花菁染料和碳点，由于荧光共振能量转移，该探针在溶液中荧光强度低，二氧化硫及其衍生物可通过亲核加成反应使探针原来的荧光共振能量转移消失，碳点的蓝色荧光恢复，从而实现了检测二氧化硫及其衍生物的目的。该探针能选择性地检测二氧化硫气体，但是该探针是基于单一的荧光强度变化，易受环境等其他因素的影响，且无法多次使用。
有机反应中的氧化还原反应类型主要包括:得电子-失电子反应、脱氢-加氢反应、加氧-脱氧反应以及巯基与二硫键的相互转化等。因此，可逆荧光探针的设计也遵循这些反应原理，以适应氧化还原反应的特点。目前关于可逆化的比率荧光探针来检测二氧化硫及其衍生物还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可视可逆地检测空气中二氧化硫气体及其衍生物的比率荧光化学探针，所要解决的技术问题是利用红色荧光的花菁基团和蓝色荧光的苯并噻唑基团设计成比率荧光探针以实现可视可逆地检测气体污染物二氧化硫及其衍生物。具体来说是红色荧光的花菁染料和蓝色荧光的苯并噻唑组成比率荧光探针可逆化、可视化地定性和定量地检测二氧化硫及其衍生物的荧光传感器及其制备方法。
本发明的一种可视可逆荧光探针，其中含有花菁荧光基团和苯并噻唑荧光基团，其结构通式为：
其中R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸、溴丙酸或1,3-丙磺酸内酯等基团。
本发明的上述所述可逆荧光探针的制备方法，包括下述步骤：
(1)将水杨醛与多聚甲醛加入到浓盐酸中，于1小时内滴加完三氯氧磷，室温反应18-20小时，过滤，洗涤所得固体并干燥得产物1；
(2)将产物1与环六亚甲基四胺溶于乙酸溶液中，加热回流反应1小时后再加入浓盐酸，继续反应5-6分钟后降温到0℃，过滤收集沉淀得到产物2；
(3)将产物2与2-氨基苯硫醇溶于溶剂中，室温反应12-14小时后脱除溶剂得产物3；
(4)将产物3与化合物4溶于溶剂中，加入哌啶催化，通氮气并回流反应60-80分钟后脱除溶剂即得；所述化合物4的结构式如下：
式中R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸、溴丙酸或1,3-丙磺酸内酯基团。
本发明具体反应过程如下：
步骤(1)所述洗涤是将过滤所得固体分别用1wt％-5wt％的NaHCO3稀溶液和水洗涤各1-3次，优选用3wt％的NaHCO3稀溶液洗涤3次后，再水洗3次；步骤(1)所述浓盐酸作为溶剂。
步骤(1)中，多聚甲醛、水杨醛、三氯氧磷的摩尔比为1:1-2:2-3。
步骤(2)中，产物1、环六亚甲基四胺、浓盐酸的摩尔比为1:1-1.5:5.2-5.8；步骤(2)中，加入浓盐酸是为了中止反应，乙酸溶液作为溶剂，乙酸溶液浓度优选40wt％-60wt％，更优选50wt％。
步骤(3)中，产物2和2-氨基苯硫醇的摩尔比为1:1；步骤(3)脱除溶剂后过硅胶色谱柱纯化，洗脱剂为体积比2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液。
步骤(4)中，产物3、化合物4、哌啶的摩尔比为1:1.2-1.5:1.2-1.5。步骤(4)脱除溶剂后过硅胶色谱柱纯化，洗脱剂为体积比10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液。化合物4的分子式RC11H13N，式中R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸、溴丙酸或1,3-丙磺酸内酯等基团，当R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸或1,3-丙磺酸内酯时，其制备方法参见文献：solid-phase methods forthe synthesis of cyanine dyes.Mason,S.J.；Hake,J.L.；Nairne,J.Cummins,W.J.；Balasubramanian,S.J.Org.Chem.2005,70,2939-2949.；当R为溴乙酸或溴丙酸时，其制备参见文献：synthesis and evaluation of polyhydroxylated near-infraredcarbocyanine molecular probes.Zongren Zhang and Samuel Achilefu，Ogr.Lett.2004,6(12),2067-2070.所述溴丙酸包括2-溴丙酸、3-溴丙酸。
步骤(3)和步骤(4)所述溶剂为C1-C4的低级醇。
本发明所述可逆荧光探针可应用于检测二氧化硫及其衍生物如亚硫酸氢根离子、亚硫酸根离子，具体可将二氧化硫及其衍生物置于比率荧光探针溶液中，在自然光或紫外光下观察探针颜色变化即可；
本发明比率荧光探针的可逆回收是将向上述颜色变化稳定后的比率荧光探针溶液中加入活性氧，在自然光或紫外光下观察探针颜色变化即可；所述活性氧为过氧化钾(KO2)、过氧化氢(H2O2)、叔丁基过氧化氢(TBHP)或次氯酸钠(NaClO)。
将本发明有机比率荧光探针溶于乙醇中制备荧光探针储备液，在荧光检测时，取一定量的荧光探针储备液分散到磷酸盐缓冲液(PB)中，得到最终浓度为20μM和50μM的荧光探针溶液分别用于荧光检测和紫外吸收检测。所述的磷酸盐缓冲液浓度为50mM，pH为7.0。
向配制的荧光探针溶液中加入含有亚硫酸氢钠的待测样品，随着待测样品浓度的不断增加，越来越多的比率荧光探针分子与亚硫酸氢根发生反应，导致荧光探针的荧光强度和荧光峰位置逐渐发生改变，红色荧光峰强度不断降低，同时蓝色荧光峰强度升高，而其他的阴离子则对探针的荧光强度和波长不产生明显的影响。在自然光下，我们可以直接观察到荧光探针的颜色由红色变为无色；而在紫外灯的辅助下，通过肉眼可观察到亚硫酸氢根加入前后，荧光探针的荧光明显由红色变为蓝色，这种颜色变化可作为亚硫酸氢根定性检测的依据。建立两个荧光峰强度间的比值与亚硫酸氢根浓度的线性曲线关系，我们就可以实现亚硫酸氢根的定量检测。二氧化硫的检测是用注射器向配制的荧光探针溶液中注入含有二氧化硫气体的待测样品，随着待测二氧化硫浓度的不断增加，越来越多的比率荧光探针分子与二氧化硫发生反应，其反应机理为二氧化硫溶于溶液中后形成亚硫酸氢根，亚硫酸氢根与探针发生反应，具体情况类似于上述的亚硫酸氢钠的检测。本发明比率荧光探针对一些常见气体如CO、CO2、H2S、NO2和NH3都没有明显的响应，而对二氧化硫无论是在自然光下，或是紫外灯下，都可以看出明显的颜色变化，因此本发明比率荧光探针对二氧化硫气体有非常好的选择性。
当向反应溶液中加入与亚硫酸氢根等摩尔量的过氧化氢并在35-40℃水浴中反应60min后，该比率探针可以被氧化回到原来的结构，再次用于亚硫酸氢根的检测，且此可逆反应可至少重复4次，从而实现了二氧化硫及其衍生物的可逆化检测。
本发明比率荧光探针具有两个荧光基团，即发红色荧光的花菁基团和发蓝色荧光的苯并噻唑基团，亚硫酸氢根可通过亲和加成反应将花菁基团上的碳碳双键破坏掉，使花菁基团的荧光逐渐降低，而苯并噻唑的蓝色荧光逐渐增强。本发明比率荧光探针有两个主要吸收，分别为390nm和520nm,在激发波长为390nm时，其发射波长有两个，为450nm和590nm，在激发波长为520nm时，其发射峰为590nm。
在本发明比率荧光探针溶液中加入二氧化硫或其衍生物后，本发明比率荧光探针的荧光颜色呈现出由红色到蓝色的比率变化，并且其荧光强度变化与二氧化硫或其衍生物的浓度间呈现出良好的线性关系，因而可以实现目标物的定性定量检测。
与已有的技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明首次合成含有苯并噻唑和花菁染料的荧光基团，利用此荧光探针可实现二氧化硫及其衍生物的比率检测，亚硫酸氢根的检测限达到了0.338μM，二氧化硫气体的检测限为1.60ppm，灵敏度高。
本发明比率荧光探针具有可逆性，活性氧能将探针氧化回到原来的结构，可多次重复使用，在一定程度上节约了资源，减少了环境的污染。
本发明比率荧光探针在自然光下或紫外灯下都可看出明显的颜色变化，只需在自然光或是一个手提式紫外灯下就可以实现二氧化硫气体的定性检测，操作简单，方便快捷，效果显著；本发明荧光探针能有效避免样品中其他杂质的干扰，选择性好，同时样品也不需要繁琐的预处理过程，检测效率高。
附图说明
图1是本发明比率荧光探针的荧光光谱图，从图1可以看出本发明比率荧光探针的激发波长有两个，一个是在390nm，另一个激发峰较宽，在490-530nm。当激发波长为390nm时，本发明比率荧光探针的发射峰有两个，分别在450nm和590nm；当在520nm激发时，本发明比率荧光探针的发射峰只有一个，在590nm处。
图2是本发明比率荧光探针的光稳定性图，从图2可以看出，在紫外灯连续扫描20分钟，本发明比率荧光探针在450nm和590nm的发射峰一直保持稳定的状态，荧光强度基本没有变化。因此本发明比率荧光探针的稳定性非常好。
图3是溶液中亚硫酸氢根检测的荧光变化图。
图4是加入亚硫酸氢根前后的荧光峰强度比值和亚硫酸氢根浓度之间的线性关系图。从图3、图4中可以看出，当激发波长为520nm时，随着亚硫酸氢根浓度的增加，本发明比率荧光探针的荧光发生明显的变化，590nm处的荧光峰强度逐渐降低，且加入亚硫酸氢根前后的荧光强度比值(F0/F)与亚硫酸氢根浓度之间呈现良好的线性关系，因此可以用作亚硫酸氢根的定量检测。
图5是溶液中二氧化硫检测的荧光变化图。
图6是注入二氧化硫气体后450nm处荧光峰强度与590nm处荧光峰强度比值(F450/F590)和亚硫酸氢根浓度之间的线性关系图。由图5、图6中可以看出，当激发波长为390nm时，随着二氧化硫气体浓度的增加，本发明比率荧光探针的荧光发生明显的变化，590nm处的荧光峰强度逐渐降低，而450nm处的荧光峰强度则是逐渐增强，且两个荧光峰强度的比值与二氧化硫气体浓度呈现良好的线性关系，因此本发明比率荧光探针可以用作二氧化硫气体的定量检测。
图7是本发明比率荧光探针的可逆性检测图，从图7中可以看出，各种反应活性氧即氧化剂如过氧化钾(KO2)、过氧化氢(H2O2)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、次氯酸钠(NaClO)对氧化回二氧化硫反应后的比率荧光探针显示出不同的效果，其中过氧化氢的回收率最高，可达到92％。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
比率荧光探针5-1(R为丙磺酸)的制备，结构式如下
取5mL的水杨醛和2.35g的多聚甲醛于250mL的含有20mL的浓盐酸的圆底烧瓶中，混合液混合均匀后，开始逐滴加入1.5mL的POCl3，在1小时内加完，混合液在室温下反应18小时后过滤出沉淀，并用3％NaHCO3和超纯水分别洗三遍后放到真空干燥箱中烘干，再用石油醚重结晶即得到产物1，质谱分析ESI-MS：m/z(％):169.59(M--1)。
在含有13mL50％的乙酸溶液中分别加入12.5mmol产物1和16.2mmol环六亚甲基四胺，加热到120℃，使反应液回流，1小时后再加入6mL浓盐酸，溶液变为黄色，继续搅拌5分钟后冰水浴，粗产物沉淀出来，过滤，真空烘干得淡黄色产物2，质谱分析ESI-MS：m/z(％):149.03(M--1)。
25mL的圆底烧瓶中，以10mL乙醇作为溶剂，加入5mmol的2-氨基苯硫醇和5mmol的产物2，混合液在室温下反应12小时后，旋干溶剂，粗产物再经过体积比为2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得产物3，质谱分析ESI-MS：m/z(％):254.01(M--1)。
在两口的圆底烧瓶中，以乙醇作为溶剂，加入0.7mmol化合物4(C14H19NO3S)和0.5mmol产物3，以0.7mmol哌啶作为催化剂，通氮气加热到回流(80℃)，反应1小时后旋蒸掉溶剂，并以体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得目标产物5-1。
本实施例制备的比率荧光探针的荧光光谱图见图1。
质谱分析：ESI-MS：m/z(％):519.18(M++1)
核磁分析：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.11(s,1H),8.18(d,J＝7.6Hz,1H),8.06(s,1H),7.93(d,J＝8.1Hz,1H),7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.71(d,J＝7.6Hz,1H),7.41(d,J＝7.8Hz,1H),7.35–7.26(m,2H),7.06(q,J＝7.8Hz,1H),6.81(m,4.9Hz,1H),6.42(d,J＝2.5Hz,1H),6.35(d,J＝2.5Hz,1H),5.10(s,1H),4.35(t,J＝7.1Hz,2H),2.50(t,J＝8.2Hz,2H),2.27(dd,J＝15.2,7.1Hz,2H),1.18(s,6H).
13C NMR(400MHz,CDCl3)δ175.69,167.95,159.95,151.77,146.72,141.75,140.82,136.02,134.43,132.06,130.88,128.76,126.47,126.30,126.04,123.56,123.18,122.52,121.26,117.67,113.77,101.99,50.76,47.96,48.24,26.06,21.60.
实施例2
比率荧光探针5-2(R为3-溴丙酸)的制备，结构式如下
取5mL的水杨醛和2.35g的多聚甲醛于250mL的含有20mL的浓盐酸的圆底烧瓶中，混合液混合均匀后，开始逐滴加入1.5mL的POCl3，在1小时内加完，混合液在室温下反应18小时后过滤出沉淀，并用3％NaHCO3和超纯水分别洗三遍后放到真空干燥箱中烘干，再用石油醚重结晶即得到产物1。
在含有13mL50％的乙酸溶液中分别加入12.5mmol产物1和16.2mmol环六亚甲基四胺，加热到120℃，使反应液回流，1小时后再加入6mL浓盐酸，溶液变为黄色，继续搅拌5分钟后冰水浴，粗产物沉淀出来，过滤后得到淡黄色产物2，真空烘干后备用。
25mL的圆底烧瓶中，以10mL乙醇作为溶剂，加入5mmol的2-氨基苯硫醇和5mmol的产物2，混合液在室温下反应12小时后，旋干溶剂，粗产物再经过体积比为2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得产物3。
在两口的圆底烧瓶中，以乙醇作为溶剂，加入0.7mmol化合物4(C14H18BrNO2)和0.5mmol产物3，以0.7mmol哌啶作为催化剂，通氮气加热到回流(80℃)，反应1小时后旋蒸掉溶剂，并以体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得目标产物5-2。
本实施例制备的比率荧光探针的荧光光谱图见图1
质谱分析：ESI-MS：m/z(％):549.10(M++1)
核磁分析：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(s,7H),8.18(s,7H),8.16(s,7H),8.05(s,6H),7.55(dd,J＝14.2,6.0Hz,28H),7.29(s,5H),7.21(s,7H),6.95(s,7H),6.79(s,4H),6.18(s,7H),5.31(s,7H),4.22(s,5H),3.94(s,5H),2.76(s,10H),1.44(s,42H).13C NMR(400MHz,CDCl3)δ174.90,173.17,167.95,159.95,151.77,146.72,141.75,140.82,137.02,135.46,131.97,130.95,127.77,126.57,126.30,125.84,123.49,123.18,121.92,121.26,117.87,114.07,101.99,48.46,47.20,38.24,26.06.
实施例3
比率荧光探针5-3(R为溴乙酸)的制备，结构式如下
取5mL的水杨醛和2.35g的多聚甲醛于250mL的含有20mL的浓盐酸的圆底烧瓶中，混合液混合均匀后，开始逐滴加入1.5mL的POCl3，在1小时内加完，混合液在室温下反应18小时后过滤出沉淀，并用3％NaHCO3和超纯水分别洗三遍后放到真空干燥箱中烘干，再用石油醚重结晶即得到产物1。
在含有13mL50％的乙酸溶液中分别加入12.5mmol产物1和16.2mmol环六亚甲基四胺，加热到120℃，使反应液回流，1小时后再加入6mL浓盐酸，溶液变为黄色，继续搅拌5分钟后冰水浴，粗产物沉淀出来，过滤后得到淡黄色产物2，真空烘干后备用。
25mL的圆底烧瓶中，以10mL乙醇作为溶剂，加入5mmol的2-氨基苯硫醇和5mmol的产物2，混合液在室温下反应12小时后，旋干溶剂，粗产物再经过体积比为2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得产物3。
在两口的圆底烧瓶中，以乙醇作为溶剂，加入0.7mmol化合物4(C13H16BrNO2)和0.5mmol产物3，以0.7mmol哌啶作为催化剂，通氮气加热到回流(80℃)，反应1小时后旋蒸掉溶剂，并以体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得目标产物5-3。
本实施例制备的比率荧光探针的荧光光谱图见图1
质谱分析：ESI-MS：m/z(％):535.09(M++1)
核磁分析：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,2H),8.18(s,2H),8.12(s,2H),8.02(s,2H),7.52(dd,J＝14.1,6.0Hz,8H),7.34(s,1H),7.03(d,J＝76.1Hz,4H),6.84(s,1H),5.78(s,2H),5.32(s,2H),4.60(s,2H),4.45(s,2H),1.54(s,12H).
13C NMR(400MHz,CDCl3)δ168.05,167.56,162.47,160.03,151.76,146.72,142.57,139.07,136.02,135.09,132.08,130.95,128.63,127.56,126.30,126.04,123.49,123.15(d,J＝18.2Hz),121.26,117.75,113.42,102.11,52.36,47.98,26.96.
实施例4
比率荧光探针5-4(R为碘乙烷)的制备，结构式如下
取5mL的水杨醛和2.35g的多聚甲醛于250mL的含有20mL的浓盐酸的圆底烧瓶中，混合液混合均匀后，开始逐滴加入1.5mL的POCl3，在1小时内加完，混合液在室温下反应18小时后过滤出沉淀，并用3％NaHCO3和超纯水分别洗三遍后放到真空干燥箱中烘干，再用石油醚重结晶即得到产物1。
在含有13mL50％的乙酸溶液中分别加入12.5mmol产物1和16.2mmol环六亚甲基四胺，加热到120℃，使反应液回流，1小时后再加入6mL浓盐酸，溶液变为黄色，继续搅拌5分钟后冰水浴，粗产物沉淀出来，过滤后得到淡黄色产物2，真空烘干后备用。
25mL的圆底烧瓶中，以10mL乙醇作为溶剂，加入5mmol的2-氨基苯硫醇和5mmol的产物2，混合液在室温下反应12小时后，旋干溶剂，粗产物再经过体积比为2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得产物3。
在两口的圆底烧瓶中，以乙醇作为溶剂，加入0.7mmol化合物4(C13H18IN)和0.5mmol产物3，以0.7mmol哌啶作为催化剂，通氮气加热到回流(80℃)，反应1小时后旋蒸掉溶剂，并以体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为洗脱剂通过硅胶色谱柱分离提纯后可得目标产物5-4。
本实施例制备的比率荧光探针的荧光光谱图见图1
质谱分析：ESI-MS：m/z(％):553.03(M++1)
核磁分析：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(s,2H),8.16(s,2H),8.24(s,2H),8.04(s,2H),7.52(dd,J＝14.2,6.0Hz,8H),7.29(s,1H),7.02(d,J＝76.1Hz,4H),6.85(s,1H),5.58(s,1H),5.47(s,2H),3.76(s,2H),3.66(s,2H),1.43(d,J＝12.0Hz,17H).
13C NMR(400MHz,CDCl3)δ174.81,167.78,160.02,151.77,146.72,141.76,141.45,136.02,133.93,132.88,131.15,128.86,126.78,126.05(d,J＝1.7Hz),123.49,123.18,122.33,121.26,117.09,114.05,101.99,48.46,43.10,26.04,15.29.
实施例5(比率荧光探针在二氧化硫及其衍生物的检测中应用)
本实施例以实施例1所制备的比率荧光探针来进行二氧化硫及其衍生物的检测。其他实例2-4所得荧光探针应用同此方法。
1、取5.18mg实施例1所制备的比率荧光探针溶于1mL的无水乙醇中，混合均匀，得到浓度为10mmol/L的比率荧光探针储备液，放于冰箱中4℃保存。
2、取10.4mg的亚硫酸氢钠溶于1mL的超纯水中，混合均匀，得到浓度为0.1mol/L的亚硫酸氢钠储备液，再稀释成10mmol/L的储备液，备用。
3、取4μL的比率荧光探针储备液分散到2mL磷酸盐缓冲溶液(PB，pH值为7.0，浓度为50mM)的比色皿中，得到最终浓度为20μmol/L的比率荧光探针溶液。
4、向步骤3配制的比率荧光探针溶液中加入不同量的亚硫酸氢钠储备液，使亚硫酸氢钠的浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM和50μM。本发明比率荧光探针在自然光下为红色，在紫外灯下为红色荧光，随着亚硫酸氢根离子的加入，在自然光下，探针的颜色逐渐变为无色，在紫外灯下，探针颜色则由粉红色荧光逐渐变为蓝色荧光，且颜色变化很明显，因此本发明比率荧光探针可以用作亚硫酸氢根的定性检测，如图3、图4所示；
(步骤4若向配制的比率荧光探针溶液中注入不同量的二氧化硫气体，使二氧化硫的浓度分别为0ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm和500ppm。随着比率荧光探针溶液中二氧化硫或亚硫酸氢钠浓度的不断增加，荧光探针的荧光性质逐渐发生变化，最终由红色荧光变为蓝色荧光。根据荧光颜色的变化以及两个荧光峰强度的比值与二氧化硫及其衍生物浓度间建立的线性关系从而可实现二氧化硫及其衍生物的定性定量检测，如图5、图6所示。)
5、向步骤4检测后的溶液中(20μM的探针和50μM的亚硫酸氢根的反应液)加入与亚硫酸氢根等摩尔量的反应活性氧：过氧化钾(KO2)、过氧化氢(H2O2)、叔丁基过氧化氢(TBHP)和次氯酸钠(NaClO)，并在37℃中反应，做空白对照，分别在0.5h、1h、1.5h、2.0h紫外光下观察探针颜色的变化，不同反应活性氧对氧化回与亚硫酸氢根反应后的荧光探针有不同的回收效果，其中以过氧化氢的回收率最高，1h后的荧光恢复比率可达到92％，并可再次用于亚硫酸氢根的检测，因此实现了本发明比率荧光探针的可逆性，即可回收重复利用。
Claims (9)
1.一种可视可逆的比率荧光探针，结构式如下：
其中，式中R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸、溴丙酸或1,3-丙磺酸内酯基团。
2.权利要求1所述可视可逆的比率荧光探针的制备方法，包括下述步骤：
(1)将水杨醛与多聚甲醛加入到浓盐酸中，于1小时内滴加完三氯氧磷，室温反应18-20小时，过滤，洗涤所得固体并干燥得产物1；
(2)将产物1与环六亚甲基四胺溶于40-60wt％的乙酸溶液中，加热回流反应1小时后再加入浓盐酸，继续反应5-6分钟后降温到0℃，过滤收集沉淀得到产物2；
(3)将产物2与2-氨基苯硫醇溶于溶剂中，室温反应12-14小时后脱除溶剂得产物3；
(4)将产物3与化合物4溶于溶剂中，加入哌啶催化，通氮气并回流反应60-80分钟后脱除溶剂即得；所述化合物4的结构式如下：
式中R为碘甲烷、碘乙烷、溴乙酸、溴丙酸或1,3-丙磺酸内酯基团；步骤(3)和步骤(4)中，所述溶剂为C1-C4的低级醇。
3.如权利要求2所述可视可逆的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，多聚甲醛、水杨醛、三氯氧磷的摩尔比为1:1-2:2-3。
4.如权利要求2所述可视可逆的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，产物1、环六亚甲基四胺、浓盐酸的摩尔比为1:1-1.5:5.2-5.8。
5.如权利要求2所述可视可逆的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，产物2和2-氨基苯硫醇的摩尔比为1：1；脱除溶剂后过硅胶色谱柱纯化，洗脱剂为体积比2:1的二氯甲烷/石油醚混合溶液。
6.如权利要求2所述可视可逆的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，产物3、化合物4、哌啶的摩尔比为1:1.2-1.5:1.2-1.5；脱除溶剂后过硅胶色谱柱纯化，洗脱剂为体积比10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
7.权利要求1所述可视可逆的比率荧光探针或者权利要求2-6任一项所述制备方法得到的可视可逆的比率荧光探针在检测二氧化硫及其衍生物中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，将二氧化硫及其衍生物置于比率荧光探针溶液中，在自然光或紫外光下观察探针颜色变化。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，向颜色变化稳定后的比率荧光探针溶液中加入活性氧反应，然后在自然光或紫外光下观察探针颜色变化；所述活性氧为过氧化钾、过氧化氢、叔丁基过氧化氢或次氯酸钠。
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