CN105018616A - 一种抑制nema从头dna合成现象的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制切克内切酶介导等温扩增(NEMA)从头DNA合成现象的方法及相应试剂盒。所述方法为，在试剂盒中使用合适的切克内切酶，增大切克内切酶和dNTP的使用量，添加甜菜碱和海藻糖等辅助因子，从而达到在保证有效扩增的前提下抑制从头DNA合成导致结果无法判定现象。本方法相应试剂盒含有上述反应试剂。本方法实现NEMA扩增结果的有效判定，消除从头DNA合成对反应产生的抑制作用，提高了等温扩增技术的可信度。且操作简单，成本低廉，可用于等温扩增检测手段中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学等温检测领域，具体涉及一项抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法。
背景技术
最早的从头合成的概念指的是生物体内用简单的前体物质合成生物分子的途径。通常大家熟知的是：游离的碱基和自由的核苷经过简单反应合成是核苷酸合成的主要来源，此过程称为重新利用(或者补救合成)途径(Salvage Pathway)。早在1948年，Buchanan等采用同位素示踪技术搞清楚了嘌呤核苷酸的在鸽子体内的合成过程，即为补救合成途径。然而，体内最主要的核苷酸合成途径是从头合成途径(de novo synthesis)：氨基酸、核糖核苷、一碳单位以及二氧化碳等简单物质做为原料合成核苷酸的复杂转变过程。
切刻内切酶具有高度的酶切活性，加上链置换活性强的Bst DNA聚合酶的参与，Nadezhda V.Zyrina等在2007年的实验中同时使用了该两种酶并提出了两种酶能够参与催化“de novo synthesis”的观点。研究中发现，当把N.BspD6I DNA切刻内切酶(-GAGTCNNNN-)加入到)加入到含有dNTP和Bst DNA大片段聚合酶的混合体系中时，即是不存在模板和引物的情况下，大量的DNA合成物也会产生。而且，N.BspD6I DNA切刻内切酶的活性同“从头DNA”的大量合成是呈正相关性的，在其最大活性值时，“从头DNA”的量达到最大浓度。电子显微镜数据显示，大多数从头合成的DNA分子有一个分支结构，而且包括大量短的重复序列，像是真核细胞中的随行DNA，这些序列显示了含有4-36bp的重复长度的准回文结构。实验通过合成片段的克隆和排序证实了从头合成的DNA产物主要是由多重的六核苷酸非回文串联重复结构构成，这个结构中包含有多处切刻内切酶的识别位点。一种可能的机理就是：dNTP原料依赖的DNA合成物是由N.BspD6I DNA切刻内切酶激发产生的。它来源于一个“消化-延长”的高效的指数扩增的循环：包含有多个限制性酶切位点的回文结构的DNA链被消化为短片段，这些短片段作为模板用于延伸出更长的DNA产物。
实验发现，在一种嗜热限制性内切酶(普遍为切刻内切酶)存在时，即使不添加任何的模板和引物核苷酸的情况下，嗜热的DNA聚合酶在恒温条件下便会高效合成和扩增DNA。1个小时内1Μ的DNA聚合酶能够合成超过10μg的DNA，而且这个反应会持续到可获得的dNTP消耗完为止。另有文章提出，Bst大片段DNA聚合酶在N.BspD61切刻内切酶和dNTP存在时表现出一种十分高效的模板依赖的DNA合成性。实验数据还表明，10Μ的N.BspD61 切刻酶添加量条件下＞200bp的DNA产物主要是在1小时恒温中合成的，反而随着恒温时间的增长会导致短片段(＜200bp)的积累。“从头DNA”能够在55-75℃温度范围内合成，最佳温度范围是65-70℃。在较低温度时(＜60℃)，反应相对减慢而且合成的是较长的DNA分子(＞1knt)；在较高温度时(＞75℃)，少量的(或者是几乎没有)DNA合成。
切刻内切酶介导等温扩增技术(Nicking-mediated isothermal amplification,NEMA)是依赖切刻内切酶和链置换DNA聚合酶的等温扩增技术，在分子生物检测领域，尤其是现场快速检测领域具有强大的应用潜力。然而NEMA技术中不可避免地存在从头DNA合成现象，这一现象对扩增结果的判断具有干扰作用。专利200610057262.7中介绍了NEMA的相关技术，但没有针对NEMA从头DNA合成现象的抑制研究，其余关于等温扩增反应体系优化也没有对这一现象的研究(详见专利201180035890.4，201210179864.5，200980145201.8)，因此需要寻找新的反应体系或增强剂能够显著提高NEMA的可信度。
甜菜碱作为一种核酸扩增增强剂，最常参与推进的等温反应便是环介导等温扩增技术(LAMP)。甜菜碱可以减少碱基堆积，抑制核酸二级结构的形成，从而维护正常的扩增秩序促进DNA扩增效率。即便是高浓度的甜菜碱对多种酶及其他生物大分子也不会产生大的影响，甚至有保护作用。海藻糖由于其特有的物理和化学性质导致了它特有的抗性作用，该作用使其具有异常的水合能力、对环境变化的质构敏感性，所以海藻糖对生物大分子具有良好的保护作用，能够在较高温度下稳定酶的空间构象，提高酶的热稳定性。此前曾有研究利用海藻糖提高某些核酸内切酶和逆转录酶的反应温度，从而在逆转录反应(Reverse transcription)的中合成更长的目的互补链。对于两种酶存在的NEMA体系，海藻糖还能够有效缩短两种酶最适反应的温度差，从而辅助NEMA完成高效的等温扩增过程。
发明内容
切克内切酶为该等温扩增技术的特征酶，切刻内切酶是一种限制性内切酶，它能够识别特异性的核苷酸序列，并且在序列内部或首尾处发生单链切割；该过程对底物DNA没有要求，即不需要有任何化学修饰。与常见的核酸内切酶相同，切刻内切酶也通过辨认特异的核苷酸序列来切割双链DNA的特定位点。切刻内切酶的特点是：并不同时切断核酸双链，而只是根据特异的位点序列选择切断双链中的一条链。
常用的切克内切酶包括Nb.BsaI,Nb.BspD6I,Nt.Bst9I,Nb.BstNBI,Nb.BspQI,Nb.BsrDI等。他们所识别序列的碱基数目由4到7个不等。
切克内切酶介导等温核酸扩增技术(Nicking Enzyme Mediated Amplification，NEMA)是在SDA的基础上发展而来的不依赖于特殊化学修饰的等温方法。反应体系中使用的切克内切 酶(又称为切口酶)，是一种能够识别特异性的位点并发生自然单链切割产生缺口的酶，切克内切酶的这种功能克服了传统SDA反应中需要添加化学修饰的非标准核苷酸的缺陷，简化了反应体系提高了反应效率。切克内切酶介导等温核酸扩增技术的基本原理分为“切割单链形成切口”和“链置换剥离旧链”两个过程。NEMA的反应体系包括两对引物(剥离引物B1/B2，切割引物S1/S2)、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、一种能够识别特异性切割位点的切克内切酶、额外添加的镁离子以及适宜的缓冲溶液。
PCR反应的增强剂的作用是从增加特异产物和减少非特异产物两个方面入手，提高反应的扩增效率。目前PCR体系中尝试使用过许多核酸扩增增强剂，其原理各不相同，当然也各自适用于不同的核酸扩增反应中。根据其作用和原理，核酸扩增增强剂可以大致分为三类：(1)参与高GC％含量，易形成复杂二级结构的模板(共溶剂)体系(2)保护DNA聚合酶的活性和稳定性(3)优化引物和模板的退火。借鉴其他的等温核酸扩增反应的体系，NEMA的反应增强剂应该选择保护DNA聚合酶的活性和稳定性和优化引物和模板的结合两个方面的。
海藻糖由于其特有的物理和化学性质导致了它特有的抗性作用，该作用使其具有异常的水合能力、对环境变化的质构敏感性，所以海藻糖对生物大分子具有良好的保护作用，能够在较高温度下稳定酶的空间构象，提高酶的热稳定性。有人曾利用海藻糖提高某些核酸内切酶和逆转录酶的反应温度，从而在逆转录反应(Reverse transcription)的中合成更长的目的互补链。对于两种酶存在的NEMA体系，海藻糖还能够有效缩短两种酶最适反应的温度差，从而辅助NEMA完成高效的等温扩增过程；甜菜碱作为一种核酸扩增增强剂，最常参与推进的等温反应便是环介导等温扩增技术(LAMP)。甜菜碱可以减少碱基堆积，抑制核酸二级结构的形成，从而维护正常的扩增秩序促进DNA扩增效率。有研究表明，即便是高浓度的甜菜碱对多种酶及其他生物大分子也不会产生大的影响，甚至有保护作用。
本发明提供一种抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)合理添加Nt.BstNBI切克内切酶和dNTP，特别添加海藻糖、甜菜碱在原有反应体系中；
(2)扩增反应温度58-60℃，反应时间1h；
(3)通过凝胶电泳判断抑制效果。
切克内切酶及其用量的选择是在若干种商业化切克内切酶中选择产生的。不同切克内切酶对反应中从头DNA合成现象的贡献不同，这与其特异性识别位点有关，还与其识别位点的长度有关；抑制从头DNA合成现象明显的切克内切酶不一定对扩增反应有利，选择 Nt.BstNBI是在考虑抑制从头DNA合成现象与扩增反应的综合决定。使用Nt.BstNBI的反应非特异带状弥散大多出现在1500bp以上，能够与目的产物明显的区分，可清除的判别扩增情况。
添加海藻糖和甜菜碱的作用为提高扩增效率，抑制非特异扩增，减少碱基堆积，抑制核酸二级结构形成。
该方法使用凝胶电泳判断抑制效果，若泳道背景信号显著减弱，则证明该方法能够成功抑制从头DNA合成现象。
本发明还设计关于抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的试剂盒，主要包括以下试剂：
dNTP，海藻糖，甜菜碱的预混液；
Nt.BstNBI切克内切酶。
该试剂盒的使用方法如下：
(1)合理添加Nt.BstNBI切克内切酶至预混液中，共同加入原有原有反应体系中；
(2)扩增反应温度58-60℃，反应时间40min-1h；
(3)通过凝胶电泳判断抑制效果。
本发明实现的有益效果：
本发明从方法学角度对切克内切酶介导等温扩增进行优化，通过优化切克内切酶及添加其他反应增强剂，扩增过程中的从头DNA合成现象受到极大抑制，大大增加了该等温扩增技术的可信度。该方法简单实用，可操作性行强，大大降低电泳检测的背景信号，为切克内切酶介导等温扩增提供了改进的空间。
附图说明
图1为不同切克内切酶的从头DNA合成效果图。从左至右依次为Nb.BbvCI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nt.BsrDI。
图2为不同切克内切酶的NEMA。从左至右依次为Nb.BbvCI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nt.BsrDI。
图3(a)为添加甜菜碱前后的NEMA；图3(b)为添加海藻糖前后的NEMA。图左侧两个泳道为未加相应物质的NEMA，右侧两个泳道为添加相应物质的NEMA
图4为抑制从头合成现象的NEMA。(a)-(d)分别表示切克内切酶，dNTP，海藻糖，甜菜碱优化的NEMA，从左至右其添加量逐渐升高。
具体实施方式
本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅参照较佳实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当清楚，可以对发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
利用蜡样芽孢杆菌为模板进行切克内切酶介导等温扩增技术的研究。
实施例1切克内切酶的选择
在已经确定聚合酶使用Bst DNA聚合酶后，主要探讨不同的切刻内切酶产生的不同“从头DNA”合成的效率，从而大致确定反应优化的温度范围，以及最佳酶切位点的选择。不同的切克内切酶对从头DNA合成的影响不同，对Nb.BbvCI和Nb.BsrDI这两种酶来说，反应的温度和缓冲溶液等条件并不利于其回文形状的复杂DNA复合物的形成，前者的弥散长度主要集中在＜100bp的短片段区域，后者除了少量二聚体生成无明显“从头DNA”产物，如图1所示。。而在NEMA反应体系中，Nt.BspQI和Nt.BstNBI参与反应目的条带的扩增效率不相上下，同时背景值在反应中也没有明显区别。考虑到Nt.BstNBI的最适反应温度55℃相较于Nt.QspI的50℃，更接近Bst扩增酶的最适反应温度65℃且弥散背景长度更长，故采用Nt.BstNBI作为抑制从头DNA合成的最佳切刻内切酶，如图2所示。
实施例2蜡样芽孢杆菌基因组提取
(1)取菌体培养液1-5mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清。
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
(3)如果需要去除RNA，可加入4μL RNase A(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。
(4)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(5)加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(6)加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(10)重复操作步骤(9)。
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。或者向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL无菌水，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
实施例3蜡样芽孢杆菌NEMA扩增引物设计
选取蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,ATCC 11778)的16S rDNA片段序列(SEQ ID No 1)为模板，设计了用于NEMA扩增的切割引物和剥离引物，
剥离引物B1:5'-CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'(SEQ ID No 2)
剥离引物B2:5'-GTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTA-3'(SEQ ID No 3)
切割引物S1:5'-ATGAATAGTCGGTTACTTGAGTCTCCGCAATGGACGAAAGTCT-3'(SEQ ID No 4)
切割引物S2:5'-ATGAATAGTCGGTTACTTGAGTCCTTGCCACCTACGTATTACC-3'(SEQ ID No 5)
其中，带有下划线“GAGTC”为Nt.BstNBI切克内切酶的特异性识别位点。
实施例4蜡样芽孢杆菌NEMA扩增
将引物稀释成10μM的储备液，置于4℃保存。NEMA的25μL反应体系分为Mix A和Mix B。Mix A(12μL)体系为：0.1μM切割引物(S/F，S/R)，0.8μM剥离引物(B/F,B/R)，1μL缓冲液1xThermolPol buffer(含20mMTris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100)和DNA模板。体系Mix A首先加热至95℃变性5min，后取出自然降温到室温。Mix B(13μL)体系为：1.5μL缓冲液1xThermolPol buffer，0.4mMdNTP，2mMMgSO4，1％BSA，4M Bst polymerase large fragment，5ΜNt.BstNBI，ddH2O补足。NEMA反应程序为：在58℃反应60min。通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增情况。
实施例5蜡样芽孢杆菌NEMA体系优化
(1)在B部分中改变dNTP和Nt.BstNBI的使用量，进行NEMA扩增反应，通过琼脂 糖凝胶电泳观察抑制效果。
(2)B部分中分别添加海藻糖和甜菜碱，并调整其使用量，通过琼脂糖凝胶电泳观察抑制效果。
由图3(a)所示，添加海藻糖后对从头DNA合成有明显的抑制；由图3(b)所示，添加甜菜碱后对从头DNA合成有明显的抑制。
由图4(a)所示，不同切克内切酶使用量对从头DNA合成抑制现象呈现逐渐增强的效果；由图4(b)所示，不同dNTP使用量对从头DNA合成抑制现象呈现逐渐减弱的效果；由图4(c)所示，不同海藻糖使用量对从头DNA合成抑制现象呈现逐渐增强的效果；由图4(d)所示，不同甜菜碱使用量对从头DNA合成抑制现象呈现逐渐增强的效果。
因此，合理的添加切克内切酶和dNTP，单独添加海藻糖和甜菜碱能够显著抑制等温扩增过程中的从头DNA合成现象。
Claims (9)
1.一项抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，方法包含如下步骤：
(1)添加Nt.BstNBI切克内切酶和dNTP，特别添加海藻糖、甜菜碱在原有反应体系中；
(2)扩增反应温度58-60℃，反应时间40min-1h；
(3)通过凝胶电泳判断抑制效果。
2.如权利要求1所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，不同切克内切酶对反应中从头DNA合成现象的贡献不同，这与其特异性识别位点有关，还与其识别位点的长度有关；抑制从头DNA合成现象明显的切克内切酶不一定对扩增反应有利，选择Nt.BstNBI是在考虑抑制从头DNA合成现象与扩增反应的综合决定。
3.如权利要求1所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，虽然本方法选择Nt.BstNBI作为最合适切克内切酶，但其他新出现的以此研究思路筛选出的切克内切酶也在本专利保护范围。
4.如权利要求1所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，Nt.BstNBI的最适添加范围为6-8U/25μL；不同切克内切酶的最适添加量不同，其他新出现的以此研究思路优化出的切克内切酶最适使用量也在本专利保护范围。
5.如权利要求1所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，dNTP的最适添加范围为0.3mM-0.5mM；dNTP的添加量应首先满足扩增反应需要，根据实际情况加以调整；任何以该研究思路优化的有于抑制等温扩增从头DNA合成现象的dNTP使用量也在本专利保护范围。
6.如权利要求1所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，海藻糖和甜菜碱等辅助因子的添加范围分别为50-70mM和0.8-1.2M。任何以本研究思路优化的有助于抑制等温扩增从头DNA合成现象的海藻糖和甜菜碱使用量也在本专利保护范围之内。
7.如权利要求3所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，根据所选择切克内切酶，本方法在切克内切酶介导等温扩增中的最佳反应温度范围为58℃-60℃。
8.如权利要求7所述的抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法，其特征在于，反应试剂不应经历高温变性步骤。
9.一项抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的试剂盒，包括以下试剂：Nt.BstNBI切克内切酶，dNTP，海藻糖和甜菜碱的预混液。
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