CN105018550A - 一种高nad积累量发酵液的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:S1、制备豆粕蛋白溶出物;S2、制备甘薯糖化液;S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入维生素复合液混匀得到溶液B,灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,升温至28-34℃,保温48-60h得到高NAD积累量发酵液。本发明大大增加了发酵液中NAD的积累量,NAD的积累量达到4.7-6.4g/l,原料廉价易得,成本低,操作简单,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域,尤其涉及一种高NAD积累量发酵液的生产方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷(NAD)是有机体必不可少的多功能小分子,主要作为氧化还原酶的重要辅酶和NADP的来源。NAD(H)参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系,糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的。NAD+、NADP、NADH和NADPH共同作为氢化物的受体和供体,在细胞的能量代谢中起着关键的作用,在医药领域具有巨大应用价值。
目前NAD生产主要通过两种途径:(1)生物催化合成,现代的生物催化技术模拟了生物体内利用酶来完成的反应,这种的模拟条件是严格根据生物体内的代谢特征来进行的,所以条件苛刻、产量低、价格昂贵;(2)酵母直接发酵合成,以葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵等配制的培养基经过发酵获得酵母菌,然后经过破壁等工艺分离获得,发酵罐中NAD的产量约为1g/l,NAD含量低也是导致目前NAD市场价格高昂的重要原因。
豆粕是用大豆榨取豆油后得到的一种副产品。因为榨油只是把大豆中的油脂提取出来,而豆粕中含有很多蛋白质等营养物质。作为一种高蛋白质,豆粕是制作牲畜与家禽饲料的主要原料,还可以用于制作糕点食品,健康食品以及化妆品和抗菌素原料。
甘薯主要以肥大的块根供食用,其根茎富含淀粉,在中国分布很广,以淮海平原、长江流域和东南沿海各省最多产量大,市场价格低,应用成本低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题,本发明提出了一种高NAD积累量发酵液的生产方法,本发明以豆粕、甘薯为原料,廉价易得,成本低,大大增加了发酵液中NAD的积累量,NAD的积累量达到4.7-6.4g/l,且操作简单,适合工业化生产。
本发明提出的一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为8-10wt%的枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀,升温至54-58℃,保温5-6h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,豆粕和枯草杆菌中性蛋白酶溶液的重量比为1:10-20;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至70-75℃,保温50-60min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温30-40min,升温至80-90℃,保温90-100min,降温至55-56℃,加糖化液,保温50-60min,调节可溶性糖浓度至10-15wt%得到甘薯糖化液;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入维生素复合液混匀得到溶液B,灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,升温至28-34℃,保温48-60h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:50-70,维生素复合液与溶液A的体积比为1-2:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5-7:100。
优选地,S1中,枯草杆菌中性蛋白酶溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液,其中,磷酸盐缓冲液含有125-135mmol/l的NaCl、3-3.4mmol/l的KCl、2-3mmol/l的NaH2PO4和9-11mmol/l的Na2HPO4。
优选地,S2中,甘薯粉与水的重量比为1:3-4,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.004-0.006,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.06-0.08。
优选地,S2中,糖化液是糖化酶活性为2000-3000IU/g的溶液。
优选地,S3中,将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入维生素复合液混匀得到溶液B,升温至125-130℃,保温20-25min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度为100-150rpm的摇床上,升温至28-30℃,保温52-56h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:55-65,维生素复合液与溶液A的体积比为1.3-1.7:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5.5-6.5:100。
优选地,S3中,发酵菌种采用酿酒酵母。
优选地,S3中,活化酿酒酵母,将种子培养基置于速度为200-250rpm的摇床上,室温至31-33℃,保温40-50h扩大培养得到发酵菌种,其中,种子培养基含有60-80g/l的葡萄糖、30-50g/l的酵母膏、30-50g/l的蛋白胨和6-12g/l的硫酸铵。
优选地,S3中,维生素复合液含有0.02-0.03g/l的维生素H、0.4-0.6g/l的烟酸、0.1-0.4g/l的烟碱、8-12g/l的肌醇、0.2-0.3g/l的对氨基苯甲酸、2.5-3g/l的硫胺素和3-4g/l的吡哆醇。
上述枯草杆菌中性蛋白酶的活性为50000IU/g,α-淀粉酶活性为5000-8000IU/g,糖化酶的活性为150000-200000IU/g。
上述酿酒酵母来自中国工业微生物菌种保藏管理中心,菌株保藏编号为
本发明用枯草杆菌中性蛋白酶水解豆粕得到的蛋白溶出物中含有大量色氨酸,色氨酸是合成NAD的主要前提物质;选用的甘薯粉含有丰富的淀粉,经液化、糖化得到甘薯淀粉水解糖作为发酵生产NAD的碳源;发酵时,维生素复合液中的硫胺素和吡哆醇是酵母合成NAD中间产物的类似物,能够高效刺激合成NAD关键酶烟酸磷酸核糖转移酶NAPRTase的过量表达,在发酵过程中能够有效促进NAD的大量积累;各物质相互配合,在合适的工艺条件下大大增加了发酵液中NAD的积累量,NAD的积累量达到4.7-6.4g/l;豆粕和甘薯廉价易得,成本低,增加了本发明的经济;操作简单,适合工业化大生产。
具体实施方式
下面,通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为10wt%的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1:10混匀,升温至58℃,保温5h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,磷酸盐缓冲液含有135mmol/l的NaCl、3mmol/l的KCl、3mmol/l的NaH2PO4和9mmol/l的Na2HPO4;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至75℃,保温50min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温40min,升温至80℃,保温100min,降温至55℃,加糖化酶活性为3000IU/g的糖化液,保温50min,调节可溶性糖浓度至15wt%得到甘薯糖化液,其中,甘薯粉与水的重量比为1:3,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.006,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.06;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入含有0.03g/l的维生素H、0.4g/l的烟酸、0.4g/l的烟碱、8g/l的肌醇、0.3g/l的对氨基苯甲酸、2.5g/l的硫胺素和4g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B,升温至125℃,保温25min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度100rpm的摇床上,升温至34℃,保温48h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:70,维生素复合液与溶液A的体积比为1:200,发酵菌种与溶液B的体积比为7:100,发酵菌种是活化酿酒酵母,将含有60g/l的葡萄糖、50g/l的酵母膏、30g/l的蛋白胨和12g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为200rpm的摇床上,室温至30℃,保温40h扩大培养得到发酵菌种。
实施例2
一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为8wt%的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1:20混匀,升温至54℃,保温6h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,磷酸盐缓冲液含有125mmol/l的NaCl、3.4mmol/l的KCl、2mmol/l的NaH2PO4和11mmol/l的Na2HPO4;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至70℃,保温60min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温30min,升温至90℃,保温90min,降温至56℃,加糖化酶活性为2000IU/g的糖化液,保温60min,调节可溶性糖浓度至10wt%得到甘薯糖化液,其中,甘薯粉与水的重量比为1:4,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.004,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.08;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入含有0.02g/l的维生素H、0.6g/l的烟酸、0.1g/l的烟碱、12g/l的肌醇、0.2g/l的对氨基苯甲酸、3g/l的硫胺素和3g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B,升温至130℃,保温20min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度150rpm的摇床上,升温至28℃,保温60h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:50,维生素复合液与溶液A的体积比为2:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5:100,发酵菌种是活化酿酒酵母,将含有80g/l的葡萄糖、30g/l的酵母膏、50g/l的蛋白胨和6g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为250rpm的摇床上,室温至28℃,保温50h扩大培养得到发酵菌种。
实施例3
一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为9.5wt%的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1:12混匀,升温至57℃,保温5.3h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,磷酸盐缓冲液含有132mmol/l的NaCl、3.1mmol/l的KCl、2.7mmol/l的NaH2PO4和9.5mmol/l的Na2HPO4;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至74℃,保温52min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温37min,升温至82℃,保温98min,降温至55℃,加糖化酶活性为2800IU/g的糖化液,保温52min,调节可溶性糖浓度至14wt%得到甘薯糖化液,其中,甘薯粉与水的重量比为1:3.2,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.0055,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.065;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入含有0.028g/l的维生素H、0.45g/l的烟酸、0.3g/l的烟碱、9g/l的肌醇、0.28g/l的对氨基苯甲酸、2.6g/l的硫胺素和3.7g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B,升温至126℃,保温24min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度120rpm的摇床上,升温至33℃,保温52h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:65,维生素复合液与溶液A的体积比为1.3:200,发酵菌种与溶液B的体积比为6.5:100,发酵菌种是活化酿酒酵母,将含有65g/l的葡萄糖、45g/l的酵母膏、35g/l的蛋白胨和10g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为220rpm的摇床上,室温至30℃,保温42h扩大培养得到发酵菌种。
实施例4
一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为8.5wt%的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1:18混匀,升温至55℃,保温5.7h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,磷酸盐缓冲液含有128mmol/l的NaCl、3.3mmol/l的KCl、2.3mmol/l的NaH2PO4和10.5mmol/l的Na2HPO4;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至72℃,保温58min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温33min,升温至88℃,保温92min,降温至56℃,加糖化酶活性为2200IU/g的糖化液,保温58min,调节可溶性糖浓度至12wt%得到甘薯糖化液,其中,甘薯粉与水的重量比为1:3.8,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.0045,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.075;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入含有0.022g/l的维生素H、0.55g/l的烟酸、0.2g/l的烟碱、11g/l的肌醇、0.22g/l的对氨基苯甲酸、2.8g/l的硫胺素和3.3g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B,升温至128℃,保温22min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度130rpm的摇床上,升温至31℃,保温56h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:55,维生素复合液与溶液A的体积比为1.7:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5.5:100,发酵菌种是活化酿酒酵母,将含有75g/l的葡萄糖、35g/l的酵母膏、45g/l的蛋白胨和8g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为230rpm的摇床上,室温至28℃,保温48h扩大培养得到发酵菌种。
实施例5
一种高NAD积累量发酵液的生产方法,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为9wt%的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1:15混匀,升温至56℃,保温5.5h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,磷酸盐缓冲液含有130mmol/l的NaCl、3.2mmol/l的KCl、2.5mmol/l的NaH2PO4和10mmol/l的Na2HPO4;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至73℃,保温55min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温35min,升温至85℃,保温95min,降温至56℃,加糖化酶活性为2500IU/g的糖化液,保温55min,调节可溶性糖浓度至13wt%得到甘薯糖化液,其中,甘薯粉与水的重量比为1:3.5,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.005,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.07;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入含有0.025g/l的维生素H、0.5g/l的烟酸、0.3g/l的烟碱、10g/l的肌醇、0.25g/l的对氨基苯甲酸、2.7g/l的硫胺素和3.5g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B,升温至127℃,保温23min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度125rpm的摇床上,升温至32℃,保温54h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:60,维生素复合液与溶液A的体积比为1.5:200,发酵菌种与溶液B的体积比为6:100,发酵菌种是活化酿酒酵母,将含有70g/l的葡萄糖、40g/l的酵母膏、40g/l的蛋白胨和9g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为225rpm的摇床上,室温至29℃,保温45h扩大培养得到发酵菌种。
利用酶循环法测定实施例1-5得到的发酵液中的NAD含量。测定结果如下:
实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
NAD含量g/l | 4.7 | 6.0 | 5.1 | 6.4 | 5.6 |
由上表可以看出,本发明可以大大增加发酵液中NAD的积累量。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、制备豆粕蛋白溶出物:将豆粕和浓度为8-10wt%的枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀,升温至54-58℃,保温5-6h后,过滤,取上清液,喷雾干燥得到豆粕蛋白溶出物,其中,豆粕和枯草杆菌中性蛋白酶溶液的重量比为1:10-20;
S2、制备甘薯糖化液:将甘薯粉与水混匀,升温至70-75℃,保温50-60min,保温过程中不停搅拌,加α-淀粉酶,保温30-40min,升温至80-90℃,保温90-100min,降温至55-56℃,加糖化液,保温50-60min,调节可溶性糖浓度至10-15wt%得到甘薯糖化液;
S3、发酵:将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入维生素复合液混匀得到溶液B,灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,升温至28-34℃,保温48-60h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:50-70,维生素复合液与溶液A的体积比为1-2:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5-7:100。
2.根据权利要求1所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S1中,枯草杆菌中性蛋白酶溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液,其中,磷酸盐缓冲液含有125-135mmol/l的NaCl、3-3.4mmol/l的KCl、2-3mmol/l的NaH2PO4和9-11mmol/l的Na2HPO4。
3.根据权利要求1或2项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S2中,甘薯粉与水的重量比为1:3-4,甘薯粉与α-淀粉酶的重量比为1:0.004-0.006,甘薯粉和糖化液的重量比为1:0.06-0.08。
4.根据权利要求1-3任一项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S2中,糖化液是糖化酶活性为2000-3000IU/g的溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S3中,将豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液混匀得到溶液A,加入维生素复合液混匀得到溶液B,升温至125-130℃,保温20-25min进行灭菌,冷却至室温,加入发酵菌种,置于速度为100-150rpm的摇床上,升温至28-30℃,保温52-56h得到高NAD积累量发酵液,其中,豆粕蛋白溶出物与甘薯糖化液的重量比为1:55-65,维生素复合液与溶液A的体积比为1.3-1.7:200,发酵菌种与溶液B的体积比为5.5-6.5:100。
6.根据权利要求1-5任一项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S3中,发酵菌种采用酿酒酵母。
7.根据权利要求1-6任一项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S3中,活化酿酒酵母,将种子培养基置于速度为200-250rpm的摇床上,室温至31-33℃,保温40-50h扩大培养得到发酵菌种,其中,种子培养基含有60-80g/l的葡萄糖、30-50g/l的酵母膏、30-50g/l的蛋白胨和6-12g/l的硫酸铵。
8.根据权利要求1-7任一项所述高NAD积累量发酵液的生产方法,其特征在于,S3中,维生素复合液含有0.02-0.03g/l的维生素H、0.4-0.6g/l的烟酸、0.1-0.4g/l的烟碱、8-12g/l的肌醇、0.2-0.3g/l的对氨基苯甲酸、2.5-3g/l的硫胺素和3-4g/l的吡哆醇。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151104 |