CN105018549A - 一种nad发酵液的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀，酶解，过滤，取上清液干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物；S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，加α-淀粉酶进行液化后，加糖化液进行糖化得到木薯糖化液；S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入维生素复合液混匀得到溶液B，灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，升温至28-32℃，保温36-48h得到NAD发酵液。本发明大大增加了发酵液中NAD的积累量，NAD的积累量达到4.5-6.5g/l，原料廉价易得，成本低，操作简单，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种NAD发酵液的生产方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷(NAD)是有机体必不可少的多功能小分子，主要作为氧化还原酶的重要辅酶和NADP的来源。NAD(H)参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系，糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的。NAD+、NADP、NADH和NADPH共同作为氢化物的受体和供体，在细胞的能量代谢中起着关键的作用，在医药领域具有巨大应用价值。
目前NAD生产主要通过两种途径：(1)生物催化合成，现代的生物催化技术模拟了生物体内利用酶来完成的反应，这种的模拟条件是严格根据生物体内的代谢特征来进行的，所以条件苛刻、产量低、价格昂贵；(2)酵母直接发酵合成，以葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵等配制的培养基经过发酵获得酵母菌，然后经过破壁等工艺分离获得，发酵罐中NAD的产量约为1g/l，NAD含量低也是导致目前NAD市场价格高昂的重要原因。
福寿螺属软体动物，外观与田螺极其相似，个体大、食性广、适应性强、生长繁殖快、产量高。1981年引入中国，目前已被列入中国首批外来入侵物种。在广东、广西等地都有大量分布，严重威胁水稻等农作物的种植，每年为杀死福寿螺所需的农药人工等成本数亿元。食用未充分加热的福寿螺，可能引起广州管圆线虫等寄生虫在人体内感染，可引起头痛、发热、颈部僵硬等症状，严重者可致痴呆，甚至死亡。因此，合理开发，高价值利用福寿螺资源具有重要的经济效益和社会效益。
木薯属于非粮作物，其根茎富含淀粉，是灌木状多年生作物，适应性强，耐旱耐瘠，在旱地农业中起着日益重要的作用，在我国广西、海南以及广东农村种植广泛，产量大，市场价格低，应用成本低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种NAD发酵液的生产方法，本发明以福寿螺、木薯为原料，廉价易得，成本低，缓解了福寿螺带来的生态问题，保护环境，大大增加了发酵液中NAD的积累量，NAD的积累量达到4.5-6.5g/l，且操作简单，适合工业化生产。
本发明提出的一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀，酶解，过滤，取上清液干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，加α-淀粉酶进行液化后，加糖化液进行糖化得到木薯糖化液；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入维生素复合液混匀得到溶液B，灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，升温至28-32℃，保温36-48h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：30-50，维生素复合液与溶液A的体积比为0.8-1.2：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3-5：100。
优选地，S1中，将福寿螺软组织碎末和浓度为4-6wt％的枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀，升温至50-54℃，保温6-7h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，福寿螺软组织碎末和枯草杆菌中性蛋白酶溶液的重量比为1：20-30。
优选地，S1中，枯草杆菌中性蛋白酶溶液的溶剂为pH＝7.0-7.3的磷酸盐缓冲液，其中，磷酸盐缓冲液含有130-140mmol/l的NaCl、2.4-3mmol/l的KCl、1-2mmol/l的NaH2PO4和7-9mmol/l的Na2HPO4。
优选地，S2中，将木薯粉与水混匀，升温至75-80℃，保温30-40min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温20-25min，升温至93-95℃，保温70-80min，降温至55-56℃，加糖化液，保温45-50min，调节可溶性糖浓度至10-15wt％得到木薯糖化液。
优选地，S2中，木薯粉与水的重量比为1：4-5，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.003-0.005，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.03-0.04。
优选地，S2中，糖化液是糖化酶活性为4000-6000IU/g的溶液。
优选地，S3中，将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入维生素复合液混匀得到溶液B，升温至121-125℃，保温15-20min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为150-200rpm的摇床上，升温至28-32℃，保温40-44h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：35-45，维生素复合液与溶液A的体积比为0.9-1.1：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3.5-4.5：100。
优选地，S3中，发酵菌种采用酿酒酵母。
优选地，S3中，活化酿酒酵母，将种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至28-32℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种，其中，种子培养基含有40-60g/l的葡萄糖、10-30g/l的酵母膏、10-30g/l的蛋白胨和4-8g/l的硫酸铵。
优选地，S3中，维生素复合液含有0.03-0.04g/l的维生素H、0.5-0.8g/l的烟酸、0.2-0.5g/l的烟碱、10-15g/l的肌醇、0.1-0.15g/l的对氨基苯甲酸、1.5-2g/l的硫胺素和1.5-3g/l的吡哆醇。
上述枯草杆菌中性蛋白酶的活性为50000IU/g，α-淀粉酶活性为5000-8000IU/g，糖化酶的活性为150000-200000IU/g。
上述酿酒酵母来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为
本发明用枯草杆菌中性蛋白酶水解福寿螺软组织得到的蛋白溶出物中含有大量色氨酸，色氨酸是合成NAD的主要前提物质；选用的木薯粉含有丰富的淀粉，经液化、糖化得到木薯淀粉水解糖作为发酵生产NAD的碳源；发酵时，维生素复合液中的硫胺素和吡哆醇是酵母合成NAD中间产物的类似物，能够高效刺激合成NAD关键酶烟酸磷酸核糖转移酶NAPRTase的过量表达，在发酵过程中能够有效促进NAD的大量积累；各物质相互配合，在合适的工艺条件下大大增加了发酵液中NAD的积累量，NAD的积累量达到4.5-6.5g/l；福寿螺是农田重要的有害生物，本发明合理利用福寿螺，缓解了福寿螺带来的生态问题，保护了环境，且福寿螺和木薯廉价易得，成本低，增加了本发明的经济和社会效益；操作简单，适合工业化大生产。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和浓度为4wt％的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1：30混匀，升温至50℃，保温7h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，磷酸盐缓冲液的pH＝7.0，含有140mmol/l的NaCl、2.4mmol/l的KCl、2mmol/l的NaH2PO4和7mmol/l的Na2HPO4；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，升温至80℃，保温30min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温25min，升温至93℃，保温80min，降温至55℃，加糖化酶活性为6000IU/g的糖化液，保温45min，调节可溶性糖浓度至15wt％得到木薯糖化液，其中，木薯粉与水的重量比为1：4，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.005，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.03；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入含有0.04g/l的维生素H、0.5g/l的烟酸、0.5g/l的烟碱、10g/l的肌醇、0.15g/l的对氨基苯甲酸、1.5g/l的硫胺素和3g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B，升温至122℃，保温20min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为150rpm的摇床上，升温至32℃，保温36h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：50，维生素复合液与溶液A的体积比为0.8：200，发酵菌种与溶液B的体积比为5：100，发酵菌种是活化酿酒酵母，将含有40g/l的葡萄糖、30g/l的酵母膏、10g/l的蛋白胨和8g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至28℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种。
实施例2
一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和浓度为6wt％的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1：20混匀，升温至54℃，保温6h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，磷酸盐缓冲液的pH＝7.3，含有130mmol/l的NaCl、3mmol/l的KCl、1mmol/l的NaH2PO4和9mmol/l的Na2HPO4；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，升温至75℃，保温40min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温20min，升温至95℃，保温70min，降温至56℃，加糖化酶活性为4000IU/g的糖化液，保温50min，调节可溶性糖浓度至10wt％得到木薯糖化液，其中，木薯粉与水的重量比为1：5，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.003，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.04；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入含有0.03g/l的维生素H、0.8g/l的烟酸、0.2g/l的烟碱、15g/l的肌醇、0.1g/l的对氨基苯甲酸、2g/l的硫胺素和1.5g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B，升温至125℃，保温15min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为200rpm的摇床上，升温至28℃，保温48h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：30，维生素复合液与溶液A的体积比为1.2：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3：100，发酵菌种是活化酿酒酵母，将含有60g/l的葡萄糖、10g/l的酵母膏、30g/l的蛋白胨和4g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至32℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种。
实施例3
一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和浓度为4.5wt％的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1：28混匀，升温至51℃，保温6.8h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，磷酸盐缓冲液的pH＝7.1，含有138mmol/l的NaCl、2.6mmol/l的KCl、1.7mmol/l的NaH2PO4和7.5mmol/l的Na2HPO4；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，升温至79℃，保温32min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温24min，升温至93.5℃，保温78min，降温至55℃，加糖化酶活性为5500IU/g的糖化液，保温46min，调节可溶性糖浓度至14wt％得到木薯糖化液，其中，木薯粉与水的重量比为1：4.2，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.0045，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.032；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入含有0.038g/l的维生素H、0.6g/l的烟酸、0.4g/l的烟碱、11g/l的肌醇、0.14g/l的对氨基苯甲酸、1.6g/l的硫胺素和2.5g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B，升温至123℃，保温19min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为160rpm的摇床上，升温至31℃，保温40h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：45，维生素复合液与溶液A的体积比为0.9：200，发酵菌种与溶液B的体积比为4.5：100，发酵菌种是活化酿酒酵母，将含有45g/l的葡萄糖、25g/l的酵母膏、15g/l的蛋白胨和7g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至29℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种。
实施例4
一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和浓度为5.5wt％的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1：22混匀，升温至53℃，保温6.2h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，磷酸盐缓冲液的pH＝7.2，含有132mmol/l的NaCl、2.8mmol/l的KCl、1.3mmol/l的NaH2PO4和8.5mmol/l的Na2HPO4；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，升温至76℃，保温38min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温21min，升温至94.5℃，保温72min，降温至56℃，加糖化酶活性为4500IU/g的糖化液，保温49min，调节可溶性糖浓度至11wt％得到木薯糖化液，其中，木薯粉与水的重量比为1：4.8，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.0035，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.038；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入含有0.032g/l的维生素H、0.7g/l的烟酸、0.3g/l的烟碱、14g/l的肌醇、0.11g/l的对氨基苯甲酸、1.9g/l的硫胺素和2g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B，升温至124℃，保温16min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为190rpm的摇床上，升温至29℃，保温44h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：35，维生素复合液与溶液A的体积比为1.1：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3.5：100，发酵菌种是活化酿酒酵母，将含有55g/l的葡萄糖、15g/l的酵母膏、25g/l的蛋白胨和6g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至31℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种。
实施例5
一种NAD发酵液的生产方法，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和浓度为5wt％的枯草杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲液按重量比为1：25混匀，升温至52℃，保温6.5h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，磷酸盐缓冲液的pH＝7.2，含有135mmol/l的NaCl、2.7mmol/l的KCl、1.5mmol/l的NaH2PO4和8mmol/l的Na2HPO4；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，升温至78℃，保温35min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温23min，升温至94℃，保温75min，降温至55℃，加糖化酶活性为5000IU/g的糖化液，保温48min，调节可溶性糖浓度至12wt％得到木薯糖化液，其中，木薯粉与水的重量比为1：4.5，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.004，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.035；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入含有0.035g/l的维生素H、0.7g/l的烟酸、0.4g/l的烟碱、13g/l的肌醇、0.12g/l的对氨基苯甲酸、1.8g/l的硫胺素和2.3g/l的吡哆醇的维生素复合液混匀得到溶液B，升温至121℃，保温17min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为180rpm的摇床上，升温至30℃，保温42h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：40，维生素复合液与溶液A的体积比为1：200，发酵菌种与溶液B的体积比为4：100，发酵菌种是活化酿酒酵母，将含有50g/l的葡萄糖、20g/l的酵母膏、20g/l的蛋白胨和5g/l的硫酸铵的种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至30℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种。
利用酶循环法测定实施例1-5得到的发酵液中的NAD含量。测定结果如下：
| 实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| NAD含量g/l | 6.1 | 4.9 | 4.5 | 5.8 | 6.5 |
由上表可以看出，本发明可以大大增加发酵液中NAD的积累量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种NAD发酵液的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备福寿螺软组织蛋白溶出物：将福寿螺软组织碎末和枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀，酶解，过滤，取上清液干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物；
S2、制备木薯糖化液：将木薯粉与水混匀，加α-淀粉酶进行液化后，加糖化液进行糖化得到木薯糖化液；
S3、发酵：将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入维生素复合液混匀得到溶液B，灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，升温至28-32℃，保温36-48h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：30-50，维生素复合液与溶液A的体积比为0.8-1.2：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3-5：100。
2.根据权利要求1所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S1中，将福寿螺软组织碎末和浓度为4-6wt％的枯草杆菌中性蛋白酶溶液混匀，升温至50-54℃，保温6-7h后，过滤，取上清液，喷雾干燥得到福寿螺软组织蛋白溶出物，其中，福寿螺软组织碎末和枯草杆菌中性蛋白酶溶液的重量比为1：20-30。
3.根据权利要求1或2项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S1中，枯草杆菌中性蛋白酶溶液的溶剂为pH＝7.0-7.3的磷酸盐缓冲液，其中，磷酸盐缓冲液含有130-140mmol/l的NaCl、2.4-3mmol/l的KCl、1-2mmol/l的NaH2PO4和7-9mmol/l的Na2HPO4。
4.根据权利要求1-3任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S2中，将木薯粉与水混匀，升温至75-80℃，保温30-40min，保温过程中不停搅拌，加α-淀粉酶，保温20-25min，升温至93-95℃，保温70-80min，降温至55-56℃，加糖化液，保温45-50min，调节可溶性糖浓度至10-15wt％得到木薯糖化液。
5.根据权利要求1-4任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S2中，木薯粉与水的重量比为1：4-5，木薯粉与α-淀粉酶的重量比为1：0.003-0.005，木薯粉和糖化液的重量比为1：0.03-0.04。
6.根据权利要求1-5任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S2中，糖化液是糖化酶活性为4000-6000IU/g的溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S3中，将福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液混匀得到溶液A，加入维生素复合液混匀得到溶液B，升温至121-125℃，保温15-20min进行灭菌，冷却至室温，加入发酵菌种，置于速度为150-200rpm的摇床上，升温至28-32℃，保温40-44h得到NAD发酵液，其中，福寿螺软组织蛋白溶出物与木薯糖化液的重量比为1：35-45，维生素复合液与溶液A的体积比为0.9-1.1：200，发酵菌种与溶液B的体积比为3.5-4.5：100。
8.根据权利要求1-7任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S3中，发酵菌种采用酿酒酵母。
9.根据权利要求1-8任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S3中，活化酿酒酵母，将种子培养基置于速度为180rpm的摇床上，室温至28-32℃，保温48h扩大培养得到发酵菌种，其中，种子培养基含有40-60g/l的葡萄糖、10-30g/l的酵母膏、10-30g/l的蛋白胨和4-8g/l的硫酸铵。
10.根据权利要求1-9任一项所述NAD发酵液的生产方法，其特征在于，S3中，维生素复合液含有0.03-0.04g/l的维生素H、0.5-0.8g/l的烟酸、0.2-0.5g/l的烟碱、10-15g/l的肌醇、0.1-0.15g/l的对氨基苯甲酸、1.5-2g/l的硫胺素和1.5-3g/l的吡哆醇。
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2015
- 2015-07-16 CN CN201510423670.9A patent/CN105018549A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111394268A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-07-10 | 合肥康诺药物开发有限公司 | 基因工程菌及其构建方法、应用，生产nad+的方法 |
| CN112322511A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-02-05 | 湖州颐盛生物科技有限公司 | 一株生产辅酶i的酿酒酵母 |
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