CN105018368A - 一种生物水解环硫酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芽孢杆菌及用于水解环硫酸酯的方法，属于微生物技术领域。芽孢杆菌<i>Bacillus</i>？sp.？CCZU11-1，其保藏编号为CGMCC？No.？9297。以1,3-丙二醇环硫酸酯及其的衍生物为起始原料，利用芽孢杆菌<i>Bacillus</i>？sp.？CCZU11-11静息细胞和固定化细胞为生物催化剂，在一定条件下进行1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物等产品的生物水解。本方法具有工艺路线简单、反应条件温和及无污染等特点。
Description
技术领域
本发明公开了土壤中分离的硫酸酯酶产生菌Bacillus sp. CCZU11-1及其用于水解环硫酸酯的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
环硫酸酯及其衍生物是一类重要的功能添加剂。近几年，1,3-丙二醇环硫酸酯 (1,3-PCS)及其衍生物作为电解液成膜添加剂在锂离子电池中有广泛的应用。这些硫酸酯直接排放到环境中会引起环境污染，生物水解环硫酸酯实现其高效降解引起了许多专家学者极大的兴趣。
据报道，硫酸酯水解酶(EC3.1.6.X)可将有机硫酸酯直接水解生产烷基醇和无机硫 (Gadler & Faber, 2006，Trends in Biotechnology 25, 83-88)。到目前为止，Acidianus brierley DSM 1651, Comamonas terrigena NCIMB 8193, Pseudomonas sp. strain C12B, Rhizobiaceae sp. FCC 175, Synechococcussp. PCC 7942, Rhodococcus ruber DSM44541, Rhodopirellula baltica DSM 10527, and Xanothbacter autotrophicus DSM 6696 (Gadler & Faber，Trends in Biotechnology, 2006,25, 83-88; Pogorevc et al., Tetrahedron: Asymmetry, 2002,13, 1443-1447; Schober et al., 2013, Angew. Chem. Int. Ed. 52, 3277 -3279; Toesch et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2014, 98, 1485–1496., Wallner et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 2652-2656)含烷基硫酸酯水解酶，而少有报道环硫酸水解酶的报道。
本研究小组从自然筛选出硫酸酯水解酶菌株芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1，可实现1,3-丙二醇环硫酸酯(1,3-PCS)及其衍生物等环硫酸酯的高效水解合成二醇。另外，催化外消旋的1,2-丙二醇环硫酸酯可合成S-1,2-丙二醇(e.e.>99%)。可见，Bacillus sp. CCZU11-1在环硫酸酯及其衍生物的转化或降解中具有潜在的应用前景。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种芽孢杆菌的培养及用于水解降解环硫酸酯的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis. CCZU11-1，该菌株已于2014年6月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9297。
上述芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1，CGMCC No. 9297，用于降解环硫酸酯的方法，按照下述步骤进行：
一、菌株的培养：
（1）种子液的摇瓶培养：将所说的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养在25~35 ℃下120~180 rpm的摇床上培养8~15 h；
（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的2~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度25~35 °C，时间12~120 h，离心、洗涤得到静息细胞；
二、静息细胞催化1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物：
将收获的静息细胞，以50~100 g湿重/L悬浮于pH为6.5~8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入1,3-丙二醇环硫酸酯或其衍生物，使硫酸酯底物终浓度为50~200 mM，在25~35 °C和180 rpm的恒温摇床上振荡反应24~240 h后，离心除去细胞，分析水解率。
其中步骤一（1）中所述的种子液培养基组成为葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~10 g，KH2PO4 1~3 g，NaCl 0.1~2 g，MgSO4 0.1~2 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
其中步骤二（2）中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~10 g，KH2PO4 1~3 g，NaCl 0.1~2 g，MgSO4 0.1~2 g，1,3-丙二醇环硫酸酯 0.1~1 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
其中所用的底物1,3-丙二醇环硫酸酯的衍生物为1,2-丙二醇环硫酸酯、1,2-乙二醇环硫酸酯和1,2-乙二醇环亚硫酸酯。
本发明的优点：本发明利用芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1生物催化剂实现1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物的高效水解，具有工艺路线简单、反应条件温和及转化率高等优点。
附图说明
图1 固定化细胞和游离静息细胞催化重复利用水解1,3-丙二醇环硫酸酯反应的结果。
具体实施方式
本发明所涉及的本发明提到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis. CCZU11-1)，是本发明的发明人从来自常州武进的土壤样品中，经初筛、复筛及分离纯化而得到的一株能够产硫酸酯水解酶的新菌株。根据它的16S rDNA序列，鉴定为Bacillus subtilis.。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus subtilis. CCZU11-1，该菌株已于2014年6月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9297。
本发明涉及的菌株Bacillus sp. CCZU11-1具有如下微生物学特征：
1. 形态特征：
杆状，染色均匀，鞭毛侧生，为内生孢子，大小为0.7～0.9μm×1.5～2.0μm。
2. 平板固体培养基上的菌落特征(30 ℃，24 h) ：
圆形，1～4mm；培养初期为透明、粘稠状，而后菌落表面出现褶皱。
3. 生长环境
可在温度15～45 ℃下生长，pH 4～8，盐浓度0～10％的条件下生存。
本发明中对环硫酸酯的含量用液相色谱（HPLC）进行分析，对产物二醇利用气相色谱-质谱联用分析。
葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~10 g，KH2PO4 1~5 g，NaCl 0.1~2 g，MgSO4 0.1~2 g，1,3-丙二醇环硫酸酯 0.1~1 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；
实施例1
利用Bacillus sp. CCZU11-1生长细胞催化水解1,3-丙二醇环硫酸酯
配制种子培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0)，在1 L摇瓶中装入200 mL种子培养基，于在25 °C和180 rpm条件下培养种子液15 h。再配制发酵培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，1,3-丙二醇环硫酸酯 0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0)。在5 L发酵罐中装入2.5 L发酵培养基，消毒后接入10%的种子液，通气量1:0.1 (v/v/m)，搅拌转速200 rpm，温度25 °C，进行发酵培养12 h，加入200 mM 1,3-丙二醇环硫酸酯，不同时间取样HPLC分析，当1,3-丙二醇环硫酸酯水解率为98%时继续补加1,3-丙二醇环硫酸酯200 mM，当产物1,3-丙二醇累积浓度达到1000 mM左右时，停止补料，继续反应使底物对1,3-丙二醇环硫酸酯消耗完，当底物残留浓度<0.02%，终止反应。利用生长细胞反应过程时间为120 h，转化率>99.0%。
实施例2
利用Bacillus sp. CCZU11-1静息细胞催化水解1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物
配制种子培养基(葡萄糖15 g，蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，KH2PO4 3 g，NaCl 2 g，MgSO4 2 g，水 1000 mL，pH 9.0)，在1 L摇瓶中装入200 mL种子培养基，于在35 °C和120 rpm的恒温摇床上振荡培养种子液8 h后。种子液接种至3.5 L发酵培养基(葡萄糖15 g，蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，KH2PO4 3 g，NaCl 2 g，MgSO4 2 g，1,3-丙二醇环硫酸酯 1 g，水 1000 mL，pH 9.0)中，消毒后接入2%的种子液，通气量1:1 (v/v/m)，搅拌转速搅拌转速450 rpm，温度35 °C，进行发酵培养12 h后，收获静息细胞。50 g湿重/L的静息细胞在10 mL磷酸缓冲溶液(pH 7.5, 100 mM)中分别转化50 mM 1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物24 h。1,3-丙二醇环硫酸酯、1,2-乙二醇环硫酸酯和1,2-乙二醇环亚硫酸酯的水解产物二醇的分析产率>70%。1,2-丙二醇环硫酸酯的水解产率为42.3%，结果如表1所示。
实施例3
分批补料水解1,3-丙二醇环硫酸酯
称取实施例2培养获得的湿重100 g静息细胞，将细胞悬浮于1 L pH 8.0磷酸钾缓冲溶液(100 mM)中，分别加入1,3-丙二醇环硫酸酯，终浓度为100 mM，在35 °C和180 rpm的恒温摇床振荡反应，反应24 h后，分批补料100 mM对1,3-丙二醇环硫酸酯进行其水解。分批补料10次1,3-丙二醇环硫酸酯(每次补料100 mM)，反应240 h后1,3-丙二醇的累计浓度为993 mM。水解1,3-丙二醇环硫酸酯过程中，反应体系中只发现1,3-丙二醇的生成。
实施例4
利用固定化细胞催化水解1,3-丙二醇环硫酸酯
在1 L Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.5, 100 mM)反应体系中，底物1,3-丙二醇环硫酸酯为100 mM，加入海藻酸钙固定化细胞（相当于100 g湿重/L Bacillus sp. CCZU11-1细胞），在30 °C、180 rpm的条件下反应24 h，重复操作12次，以游离细胞（100 g湿重/L）为对照。结果如图1所示，固定化催化剂可反复回利用12次，水解率均大于95%，达到了令人满意的效果，在催化或降解1,3-丙二醇环硫酸酯方面具有潜在的工业应用前景。
表1
Claims (5)
1.芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1，保藏号为CGMCC No. 9297。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1用于降解环硫酸酯的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
一、菌株的培养：
（1）种子液的摇瓶培养：将的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1，在种子液培养基中进行扩增培养在25~35 ℃下120~180 rpm的摇床上培养8~15 h；
（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的2~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度25~35 °C，时间12~120 h，离心、洗涤得到静息细胞；
二、静息细胞催化1,3-丙二醇环硫酸酯及其衍生物：
将收获的静息细胞，以50~100 g湿重/L悬浮于pH为6.5~8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入1,3-丙二醇环硫酸酯或其衍生物，使硫酸酯底物终浓度为50~200 mM，在25~35 °C和180 rpm的恒温摇床上振荡反应24~240 h后，离心除去细胞，分析水解率。
3. 根据权利要求2所述的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1用于降解环硫酸酯的方法，其特征在于其中步骤一（1）中所述的种子液培养基组成为葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~10 g，KH2PO4 1~3 g，NaCl 0.1~2 g，MgSO4 0.1~2 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0。
4.根据权利要求2所述的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1用于降解环硫酸酯的方法，其特征在于其中步骤二（2）中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖5~15 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~10 g，KH2PO4 1~3 g，NaCl 0.1~2 g，MgSO4 0.1~2 g，1,3-丙二醇环硫酸酯 0.1~1 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0。
5.根据权利要求2所述的芽孢杆菌Bacillus sp. CCZU11-1用于降解环硫酸酯的方法，其特征在于其中所用的底物1,3-丙二醇环硫酸酯的衍生物为1,2-丙二醇环硫酸酯、1,2-乙二醇环硫酸酯和1,2-乙二醇环亚硫酸酯。
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