CN105002256B - 复合酶法拆分制备旋光纯r－（－）坦索洛新的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复合酶法拆分制备旋光纯R－（－）坦索洛新的方法，以坦索洛新外消旋体为底物，在固定化重组脂肪酶B和重组消旋酶的耦合作用下进行转化，完成坦索洛新的动态动力学拆分，得到旋光纯R－（－）坦索洛新。本发明运用复合酶法对坦索洛新进行动态动力学拆分，具有高度的化学区域选择性和对映选择性，反应条件温和，绿色环保，复合酶的固相化可满足在相同的反应条件下消旋与对映拆分的同步进行，也大大降低了生产成本。

Description

复合酶法拆分制备旋光纯R－（－）坦索洛新的方法

技术领域

本发明属于手性化合物制备领域，涉及旋光纯坦索洛新的制备方法，特别涉及以复合酶催化拆分制备R－（－）坦索洛新的方法。

背景技术

盐酸坦索洛新（tamsulosin hydrochloride）化学名称为（R）-(5)[2-[[2-2-氧基苯氧基]－乙基]氨基]丙基]－2－甲氧基苯磺酰胺盐酸盐，是由日本山之内制药公司研发的α1a－肾上腺素受体拮抗剂。1992年7月通过美国FDA批准，1993年首次在日本上市，商品名为FLOMAX，1996年在中国上市，商品名为哈乐（HARNAL），本品可降低前列腺平滑肌张力，改善因前列腺肥大而引起的排尿障碍，临床主治良性前列腺增生。

坦索洛新属于手性药物，它的外消旋体制备方法为已知的方法（CN－102206176A），即将4－甲氧基－3－磺酰胺基苯丙酮与甲酸胺在钯－碳催化下得到关键中间体5－（2－胺基丙基）－2－甲氧基苯磺酰胺，再与2－（2－乙氧基苯氧基）溴乙烷缩合反应，制备成坦索洛新外消旋体（RS）－5－[2－[[2－[2－乙氧基苯氧基]乙基]氨基]丙基]－2－甲氧苯磺酰胺。

目前市场上销售的坦索洛新外消旋体均以化学法来完成拆分和消旋。但是化学拆分法存在收率低，拆分剂消耗大以及反应条件苛刻等缺陷。

发明内容

本发明针对现有技术缺陷，提供了复合酶法拆分制备旋光纯R－（－）坦索洛新的方法，以达到反应条件温和，选择性高和收率高的目的。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

坦索洛新的结构式:

坦索洛新的分子式 ： C20N28N2O5S

分子量：408.51

CAS号：106133－20－4

熔点：226－228℃.

坦索洛新的结构式如式Ⅰ所示，为手性化合物。而作为药物应用的坦索洛新需要得到旋光纯的R－（－）坦索洛新然后进一步盐酸化。

因此本发明提供了一种复合酶法拆分制备旋光纯R－（－）坦索洛新的方法，以坦索洛新外消旋体为底物，在固定化重组脂肪酶B和重组消旋酶的耦合作用下进行转化，完成坦索洛新的动态动力学拆分，得到旋光纯R－（－）坦索洛新。

由式Ⅰ所示，坦索洛新的手性中心为一甲基基团，因此本发明选择脂肪酶B(CALB)，消旋酶（海因酶）对其外消旋体的拆分，该酶系具有在疏水性很差的溶剂中仍具有较高的活性。

脂肪酶是一类丝氨酸水解酶通常其活动中心是一个由天冬氨酸－组氨酸－丝氨酸或组氨酸－丝氨酸－谷氨酸组成的三联体，在催化反应中丝氨酸的羧基向底物酯类或酰胺中的羰基碳原子发起亲核进攻，形成酶－酰胺中间体，随后其它亲核试剂如水，胺，醇和过氧化氢等进攻酶－酰基中间休，酶将酰基转移到酰基受体上，而自身复原又可以重复这一过程。

脂肪酶的催化活动中心匹配的对映反应速度高于不匹配的对映实体，实现对外消旋体的拆分，在外消旋动力学拆分的同时，慢反应对应的对映体在催化剂的作用下持续外消旋化，转化为快反应对映体，这样目标产物即单一对映体，理论产率可以达到100%。

动态动力学拆分（DKR）是底物外消旋化和对映体拆分同时进行的过程，底物的一种对映体连续外消旋化最终实现构型翻转，这就是成功的进行DKR的重要组成部分，然而底物的外消旋动力学拆分是各自要特定的反应条件的，因此必须考虑平衡这两方面的因素。

为了解决动力学拆分最大的理论产率问题，需要在动力学拆分方法中增加一个未知反应的对映体的循环过程，主要的方法有分离，对映体的消旋重复拆分，但是分离只是简单的针对反应过的对映体，而没有充分利用底物，只能缩短反应时间，最大理论产率仍然没有改变。由于脂肪酶只能针对一种特定的对映体反应，不能与另一构象的对映体反应，不能改变最大产率只有50%的缺陷。

金属－酶配伍的DKR是近10年来取得很大进展，其中主要是过渡金属配合物与脂肪酶B配伍为主。过渡金属的外消旋有两种方式，1是通过氢转移反应来实现外消旋，2是通过形成π－烯丙基来产生外消旋化作用，其中铑，钯，钌的配合物显示出良好的外消旋催化性能，其理论产率可达100%，但是，过渡金属的价格贵，而且含有残留物。

而本发明选择用消旋酶取代过渡金属，价格低，无残留，收率高。消旋酶的种类繁多，目前主要用于氨基酸的改型即DL的转型上。

作为本发明的一种实施方式，选择脂肪酶为南极假丝酵母(Candida antarctica)产的脂肪酶B(CALB)，消旋酶为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)产的海因酶。

而南极假丝酵母菌和恶臭假单胞菌均可为市售可得。

脂肪可分顺式和反式两种分子结构，而能兼顾二者的脂肪酶同时对水溶液和非水溶液都的很强的催化作用的属南极假丝酵母产的脂肪酶B（CALB）。

消旋酶为恶臭假单胞菌产的海因酶（hycjanoinase,EC3.5.2.2）,目前海因酶主要用于生产D－对羟基苯甘氨酸，尚未有用于生产坦索洛新类化学物的报道。

南极假丝酵母产的脂肪酶B和有恶臭的假单胞菌产的海因酶，产酶菌均为野生菌，它们的酶表达量均较低，产酶活低和产酶量亦低，不适宜直接用于产业化。因此为提高其酶表达量和酶活，分别将南极假丝酵母脂肪酶B基因组和恶臭假单胞菌海因酶基因组重组整合到毕赤酵母（Pichia Pastoris）中表达。

毕赤酵母作为真核异源蛋白的宿主菌，易于遗传操作，还具有以下优势：1。以甲醇为碳源，其表达载体含特有的乙醇氧化酶AOX1基因启动子，能通过甲醇诱导AOX1调控外源基因表达。2。高效表达，毕赤酵母生长快，能表达很高的细胞浓度，外源蛋白表达可达细胞总蛋白的5－40%。3。适于表达胞内或胞外外源蛋白。4。高稳定性，插入的外源基因不存在自主复制的表达载体中是和表达载体一起整合到酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，避免了外源基因的丢失现象。5。毕赤酵母能对所分泌的蛋白进行N－O－糖其化修饰，且糖基化程度适中。6。适应性强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养基中生长。7。可进行转录的修饰。8。可对外源基因的多拷贝。

因此本发明选择毕赤酵母来表达南极假丝酵母脂肪酶B和恶臭假单胞菌海因酶基因。

此外，基因剂量对外源目的蛋白表达有重要影响，一个拷贝的外源蛋白表达盒足够外源蛋白的高表达，增加拷贝数既有正效应也有负效应，各自影响机理不同，要提高拷贝数既起正效应作用，因随基因剂量增大，会增加外源蛋白基因转录水平，外源蛋白的产生要经过转录，翻译执叠，糖基化与分泌等步骤，而且需要细胞能量的供给，不可少一个步骤，它会因“菌株－表型－外源蛋白”的特定组合以及细胞不同的生理状态而异。

本发明选用的外源基因表达的毕赤酵母由Invitrogen公司提供的试剂盒构建，转化酵母细胞表达载体均能在大肠杆菌埃希氏菌GS115表达，分泌型载体所含有的信号肽有：pPICZX和pPIC9K的α－pact的序列。因为毕赤酵母中没有稳定的天然质粒，所以携带外源基因的重组载体必须整合到酵母染色体才能实现外源基因的表达。整合方式有单交换和双交换两种，单交换整个更具强的遗传稳定性。

为了简单快速获得高表达的转化分子，要进行目的基因高拷贝克隆的筛选，因此就需要在载体上引入抗体基因，如抗G418（Kana mycin）的基因，就可以通过提高G418的浓度来选高拷贝表达克隆。

也可通过筛选标准化来达到高拷贝转化子的外源基因拷贝数，即：多拷贝单元，可以通过整合时的重复发生得以实现发生频率通常为5－10%，为了筛选出高拷贝数转化子，可以采取菌落杂交（或打印迹杂交）或增加抗生素浓度（如G418）等方法来进行。

增加外源基因拷贝数，会增加外源基因的转录水平，但外源基因蛋白的产生要经过转录翻译、折叠、糖基化分泌等步骤，缺一不可。

若蛋白质分子量在60Kda以上，则采用mu+sHis基因型，若蛋白质分子量在20Kda以下，则采用mu+His基因型，启动子有多种组成型：有3－磷酸甘油醛脱氢酶FLD1启动子，PFLD1还有PEX8启动子（属于弱启动子），因为启动子是基因表达的关键元件，直接关系到表达水平。最常用的启动子AOX1仅受甲醇诱导，但此启动子不适用于食品工业，因大量甲醇的存在有火灾隐患。可以选用不以甲醇为唯一诱导物的PGAＰ/PFLD/PDAS和PADX2,还例如从毕赤酵母基因组文库中克隆到一个新的3-磷酸甘油脱氢酶基因(GAP)的启动子PGAP/可在多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸诱导下表达。

信号肽序列：

表达蛋白的分泌需要信号肽引导并沿一定途经才能分泌至细胞外，毕赤酵母一般利用两种来源信号肽序列，一是外源基因本身携带的信号肽序列，但酵母表达系统不能完全利用外源蛋白的天然信号肽，二是酵母本身信号肽序列，如毕母酵母酸性磷酸酶（prtol）信号肽序列和蔗糖酶基因（suc2）信号肽序列,α－MF信号肽使用的最广泛。

综合考虑上述因素，本发明的重组包括以下步骤：

根据毕赤酵母密码子偏好性设计，合成南极假丝酵母脂肪酶B基因，构建重组质粒转化毕赤酵母GS115，插入表达载体pPIC9K，经G418抗性筛选，可得到多拷贝脂肪酶转化子。

根据毕赤酵母密码子偏好性设计合成CALB基因，可以提高CALB的表达量。插入表达载体pPIC9K，经G418抗性筛选，得到多拷贝转化子，这样可提高脂肪酶活力。

恶臭假单胞菌产的海因酶基因经PCR扩增后，插入PMD18－T质粒，形成PMD－T7－DLIT质粒，重组质粒转化到毕赤酵母的宿主菌GS115上，插入表达载体pPIC9K，经G418抗性筛选，可得多拷贝海因酶转化子。

转化后的毕赤酵母接种到YPD 活化培养基内进行活化，活化后，接种至BMMY 诱导培养基，培养过程中随时补加甲醇使甲醇终浓度为0.5%，收集发酵液。

所述YPD培养基的成分为葡萄糖20 g/L, 蛋白胨20 g/L, 酵母膏10 g/L

进一步，所述BMMY 诱导培养基的成分为YNB 13.4 g/L,甲醇 5 mL/L, 生物素0.4mg/L, 1mol/L pH 6.0 磷酸钾缓冲液100 mL/L。

上述YNB为本领域通常所用的YNB培养基。

游离酶若直接用于动态动力学拆分工艺受到限制。底物发生消旋化催化反应的温度较高，一般在60度以上，而生物酶对温度十分敏感，在高温下酶会改变构象，降低选择性，甚至完全失活，游离酶在水相中不易回收，而且在有机相中容易成簇失活，尤其是双酶系统。

因此本发明选择将游离酶的固定化，不仅能提高酶的稳定性和酶的重复使用，也可避免成簇失活现象及酶的空间结构可提高酶的酶活比，双酶的固相化可满足消旋与对映拆分的同步进行，也大大降低了生产成本。

本发明采用Eupergit C作为酶固相化载体。采用本发明的载体完成酶的固相化，固定化后的酶可重复使用200次以上，生产成本大大降低。

本发明的有益效果为：本发明采用脂肪酶B(CALB)和消旋酶双酶联用法来完成坦索洛新的动态动力学拆分，此法催化反应具有高度的化学区域选择性和对映选择性，反应条件温和，更符合经济和绿色环保的要求。

由于本发明选用的利于反应的两种酶产生菌为野生型菌，因此选择用毕赤酵母为载体将其整合，可提高酶表达量，酶活和产酶量，增加酶的稳定性。本发明以南极假丝酵母产的脂肪酶B和恶臭假单胞菌产的海因酶各自重组到毕赤酵母，并以各自固相化酶耦合作用参与反应，一步法完成对坦索洛新的消旋和对映体拆分。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

外消旋坦索洛新的制备

将4－甲氧基－3－磺酰胺基苯丙酮与钯碳溶于醇类溶剂，加入甲酸铵，甲酸铵与4－甲氧基－3－磺酰胺基苯丙酮的摩尔比为5－10，回流反应制得5－（2－胺基丙基）－2－甲氧基苯基磺酰胺，再将5－（2－胺基丙基）－2－甲氧基苯基磺酰胺与2－（2－乙氧基苯氧基）溴乙烷经缩合反应制得坦索洛新消旋体。

实施例2

本发明复合酶法拆分制备旋光纯坦索洛新的方法，具体包括以下步骤：

1. 制备分泌表达型脂肪酶B（来源南极假丝酵母）与海因酶（来自恶臭假单胞菌）多拷贝转化子。

a. 提取南极假丝酵母与恶臭假单胞菌液中含脂肪酶B和海因酶的质粒。

b. 分别以含脂肪酶B(CALB)和海因酶(DLIT)基因的质粒为模板，设计上下游引物进行PCR特异性扩增，PCR扩增反应体系如表1所示。扩增后与载体PMD18-T连接，16℃2h后组成PMD18-T-CALB与PMD18-T-DLIT两种重组质粒，转化至大肠杆菌感受态内。

表1：PCR扩增反应体系

PCR循环过程：

①预热： 94℃ 2min

②变性： 98℃ 10s

③退火： 50℃ 30s

④延伸: 68℃ 3min45s

②~④循环25次。

c. 挑取分别表达脂肪酶B与海因酶的大肠杆菌单菌落活化，利用质粒提取试剂盒分别提取菌液中含PMD18-T-CALB和PMD18-T-DLIT的质粒。

d. 以BamH1与Kpn1双酶切步骤c提取的双质粒和空载体pPIC9K，其中双酶切反应体系如表2所示。37℃下消化2h后，凝胶电泳法分别回收空载体和目的基因双酶切产物，按表3连接体系，16℃连接2h，可合成pPIC9K-CALB与pPIC9K-DLIT两种重组质粒，转化至毕赤酵母GS115感受态内，经平板G418抗性筛选，获得多拷贝转化子。

表2：双酶切反应体系（50ul）

表3：连接体系（11ul）

2.分泌表达型毕赤酵母高效发酵脂肪酶B与海因酶

将转化后的毕赤酵母接种到YPD 活化培养基（葡萄糖20 g/L, 蛋白胨20 g/L, 酵母膏10 g/L）内活化后，以1%的接种量接种至BMMY 诱导培养基（YNB 13.4 g/L,甲醇 5 mL/L, 生物素0.4 mg/L, 1mol/L pH 6.0 磷酸钾缓冲液100 mL/L），培养过程中随时补加甲醇使终浓度为0.5%，25℃下摇床反应24h，收集发酵液。

3. 由于毕赤酵母为分泌型表达，可使表达的酶蛋白分泌到发酵液中，经分离，浓缩和纯化后，将酶蛋白吸附到固相化载体EUPERGITC上成固相化酶颗粒。

4．混合经固相化的脂肪酶B和海因酶，可对实施例1制备的外消旋坦索洛新进行动态动力学拆分。

5．所获得的动态动力学拆分的（R）型坦索洛新溶液经盐酸化后再经纯化浓缩和结晶，得到（R）型坦索洛新产品。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做出的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.复合酶法拆分制备旋光纯R－（－）坦索洛新的方法，其特征在于，以坦索洛新外消旋体为底物，在固定化重组脂肪酶B和重组消旋酶的耦合作用下进行转化，完成坦索洛新的动态动力学拆分，得到旋光纯R－（－）坦索洛新，所述脂肪酶为南极假丝酵母(Candida antarctica)产的脂肪酶B，所述消旋酶为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)产的海因酶，所述重组是分别将南极假丝酵母脂肪酶B基因组和恶臭假单胞菌海因酶基因组重组到毕赤酵母（Pichia Pastoris）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组包括以下步骤：

根据毕赤酵母密码子偏好性设计，合成南极假丝酵母脂肪酶B基因，构建重组质粒转化毕赤酵母GS115，插入表达载体pPIC9K，经G418抗性筛选，得到多拷贝脂肪酶B转化子；

恶臭假单胞菌产的海因酶基因经PCR扩增后，插入PMD18－T质粒，形成PMD－T7－DLIT质粒，重组质粒转化到毕赤酵母的宿主菌GS115上，插入表达载体pPIC9K，经G418抗性筛选，得多拷贝海因酶转化子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，转化后的毕赤酵母接种到YPD 活化培养基内进行活化，活化后，接种至BMMY 诱导培养基，培养过程中随时补加甲醇使甲醇终浓度为0.5%，收集发酵液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述BMMY 诱导培养基的成分为YNB 13.4g/L,甲醇 5 mL/L, 生物素0.4 mg/L, 1mol/L pH 6.0 磷酸钾缓冲液100 mL/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶的固定化载体为Eupergit C。