CN104995297A - 因子x突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含Seq ID No.1的突变的序列的蛋白质,所述SEQ ID No.1的突变的序列包含至少一个突变A、A'、B、C或C',其中:突变A由用选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸43至52组成,突变A’由用选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸47至52组成,突变B由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入组成,突变C由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ ID No.1的氨基酸4至13的缺失组成,突变C'由选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ ID No.1的氨基酸4至9的缺失组成。
Description
本发明涉及因子X突变体,及其在治疗血液凝固病症中的用途。
因子X是存在于血液中的蛋白质。此蛋白质在凝固级联中起重要作用。血液凝固是复杂的过程,这使得能够防止经由受损的血管的血液流动。一旦血管破损,负责凝固的元件彼此相互作用以在血管破损位点处形成塞,止血塞。凝固因子是固定止血塞和稳定凝块所必需的。
正常凝块的形成分四个步骤发生:
步骤1:血管被破坏。
步骤2:血管收缩以限制对受损区域的血液供应。
步骤3:血小板粘附至在血管受损期间暴露的内皮下间隙,和受刺激的血管壁。血小板散布,这就是所谓的“血小板粘附”。这些散布的血小板释放激活其他相邻的血小板的物质,使得它们在病灶位聚集以形成止血塞。这就是所谓的“血小板聚集”。
步骤4:激活的血小板的表面因此构成在其上可进行血液凝固的表面。在血液中循环的凝血蛋白(包括因子X)在血小板的表面处激活,并形成纤维蛋白凝块。
这些凝固蛋白(即因子I,II,V,VIII,IX,X,XI,XII和XIII,以及Von Willebrand因子)以链反应运行,即凝固级联。
处于激活形式的因子X(Xa)更特别地参与凝血酶原(因子II)激活为凝血酶(因子IIa),特别是当其与激活的辅因子V复合以形成凝血酶原酶复合物时。这个因子是凝固级联中的基本元件。
当这种因子欠缺时,发生出血,例如鼻出血(流鼻血),关节积血(血液渗出到关节腔中),肠胃出血。因子X缺陷极为罕见。它的传递是常染色体隐性的,其发病率为1/1000000。
FX激活发生于:
-由于因子VIIa/组织因子复合物的凝固级联的起始步骤的非常早期期间,以导致少量凝血酶的形成的相对无效的反应发生。
-或者由少量凝血酶产生的正反馈导致的凝固级联扩增的步骤期间,导致因子VIII和IX的激活。
后者中的两种因子在患有A型血友病和B型血友病的个体中缺失,因此导致在没有治疗时能够致死的出血性病症。这些因子的缺乏意味着不能生成足够量的激活的因子X以终止出血。
因此,需要经修饰的因子X,所述经修饰的因子X可以被凝血酶激活,并使得能够通过直接利用凝固开始期间生成的少量凝血酶在缺乏因子VIII和/或因子IX的情况下具有有效凝固。
发明者已经鉴定了具体的因子X突变体(也称为因子X变体),其能有效地由凝血酶激活,因而使得能够在缺乏因子VIII,因子IX和甚至因子X的情况下修复凝固。确实,正如实例中所示,这些因子X突变体可以由凝血酶激活,并允许有效的凝固,甚至在缺乏内源性因子VIII和/或因子IX和/或因子X的情况下。
这些因子X变体中生成的激活肽切割位点也可以是其它凝固蛋白酶的靶,如因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子Xia、因子XIIa或激肽释放酶(kallikrein)。
此外,因子X的激活肽的修饰可以导致其药理学性质的额外改性,除了仅凝血酶识别之外。此修饰可赋予因子X变体在比活性,在稳定性,或在蛋白酶抗性的改进,或在药物代谢动力学中的增加。此外,较之野生型分子,额外的糖基化和磷酸化的存在,或反之,缺乏这些修饰的,可能是通过引入激活肽的修饰引起的。
本发明因此涉及蛋白质,其包含SEQ ID No.1的突变的序列,SEQ IDNo.1的所述突变的序列包含至少一个突变A、A'、B、C或C',其中:
突变A由用选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸43至52组成,
突变A’由用选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸47至52组成,
突变B由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQID No.1的氨基酸52和53之间的插入组成,
突变C由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至13的缺失组成,
突变C'由选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至9的缺失组成,其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。
本发明的另一个主题是编码所述蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一个主题是包含所述多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个主题是包含所述表达载体或所述多核苷酸的宿主细胞。
本发明的另一个主题是所述蛋白作为药物的用途。特别地,所述蛋白可用于治疗血液凝固病症,特别是出血性病症,如A型血友病,B型血友病和C型血友病(因子XI缺陷),因子X缺陷,或甚至替代因子Ⅶa的紧急凝血的需要。当需要有力和快速的促凝反应时,所述蛋白质可以与其它止血分子,如因子Ⅶa和/或纤维蛋白原组合使用,或甚至与促凝化合物组合使用(血小板输注,促凝混合物如FEIBA、Kaskadil、Kanokad等),这将能加强治疗的功效。
如本文所用,术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用,是指具有多于100个氨基酸的氨基酸序列。如本文所用,术语“蛋白质”包含有100和1000个氨基酸之间,优选地120和500个氨基酸之间的氨基酸序列。
本发明涉及蛋白质,其包含SEQ ID No.1的突变的序列,SEQ ID No.1的所述突变的序列包含至少一个突变A、A'、B、C或C',其中:
突变A由用选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸43至52组成,
突变A’由用选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸47至52组成,
突变B由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQID No.1的氨基酸52和53之间的插入组成,
突变C由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至13的缺失组成。
突变C'由选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至9的缺失组成,其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。
优选地,所述蛋白质包含,优选地由具有上述至少一个突变A,A',B,C或C'的Seq ID No.7组成。
序列SEQ ID No.7(500个氨基酸)包含全部序列SEQ ID No.1(306个氨基酸)。更特别地,序列SEQ ID No.7以N端至C端方向,包含信号肽和前肽(总计40个氨基酸),序列SEQ ID No.5,序列SEQ ID No.1,然后是标签(位置489至500的氨基酸,即12个氨基酸长),即HPC4标签。序列SEQ ID No.103对应于无信号肽和无前肽的序列SEQ ID No.7。
根据本发明的所述蛋白质是有效治疗凝血病症的突变的因子X。
因子X,也称为Stuart-Prower因子,由F10基因编码并且指丝氨酸蛋白酶EC3.4.21.6。因子X由306个氨基酸的重链和139个氨基酸的轻链组成。
因子X是488个氨基酸的蛋白,由信号肽,前肽,以及轻链和重链组成。
人因子X可见于UniProtKB登录号P00742下。它的天然结构由图1所示。
蛋白质以前原肽形式翻译。在切割信号肽后,前肽最终被切割,产生轻链和重链(分别为142和306个氨基酸)(酶原)。凝血触发后,重链最终由激活肽的切割激活,从而获得仅254个氨基酸(前52个氨基酸在治疗期间切割):这是因子Xa的重链(SEQ ID No.6)。
人因子X的前原肽对应于SEQ ID No.4。重链对应于SEQ ID No.1,而轻链对应于SEQ ID No.5。重链的激活肽对应于SEQ ID No.3,并包含52个氨基酸。
SEQ ID No.2与SEQ ID No.4的氨基酸1至182相同。
SEQ ID No.1与SEQ ID No.4的氨基酸183至488相同。
因子Xa的重链(SEQ ID No.6)对应于SEQ ID No.1,其中已经切割了肽SEQ ID No.3。
根据本发明的蛋白质包含处于酶原形式的突变的因子X蛋白质,所述突变的因子X蛋白质取决于结构,包含激活肽:
-在最宽残基42和52之间包括的相同位点处由相同数目的残基替换而修饰;或
-在残基52和53之间接收到残基插入;或者
-在最宽残基52和53之间接收到残基插入,与在最宽残基4和13之间缺失相同数量的残基偶联。
根据本发明的蛋白质可以是包含SEQ ID NO.1的突变的序列的蛋白质,所述SEQ ID NO.1的突变的序列包含至少一个突变A,其中突变A由用选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸43至52组成,其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。优选地,蛋白质包含具有至少一个突变A的序列SEQ ID No.7。
还优选地,在这种情况下,突变的蛋白质包含选自SEQ ID No.9、SEQID No.10和SEQ ID No.11的序列。
根据本发明的蛋白质可以是包含SEQ ID NO.1的突变的序列的蛋白质,所述SEQ ID NO.1的突变序列包含至少一个突变A',其中突变A’由用选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸47至52组成。优选地,蛋白质包含具有至少一个突变A’的序列SEQ ID No.7。
还优选地,在这种情况下,突变的蛋白质包含选自SEQ ID No.12,SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16的序列。
根据本发明的蛋白质可以是包含SEQ ID NO.1的突变序列的蛋白质,所述SEQ ID NO.1的突变序列包含至少一个突变B,其中突变B由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入组成,其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。优选地,蛋白质包含具有至少一个突变B的序列SEQ ID No.7。
还优选地,在这种情况下,突变的蛋白质包含选自SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24和SEQ ID No.25的序列。
根据本发明的蛋白质可以是包含SEQ ID NO.1的突变序列的蛋白质,所述SEQ ID NO.1的突变序列包含至少一个突变C,其中突变C由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列在序列SEQID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ ID No.1的氨基酸4至13的缺失组成,其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。优选地,蛋白质包含具有至少一个突变C的序列SEQ ID No.7。
还优选地,在这种情况下,突变的蛋白质包含选自SEQ ID No.27、SEQ ID No.28和SEQ ID No.29的序列。
根据本发明的蛋白质可以是包含SEQ ID NO.1的突变序列的蛋白质,所述SEQ ID NO.1的突变序列包含至少一个突变C’,其中突变C’由选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ ID No.1的氨基酸4至9的缺失组成。优选地,蛋白质包含序列具有至少一个突变C’的序列SEQ ID No.7。
还优选地,在这种情况下,突变的蛋白质包含选自SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34的序列。
优选地,根据本发明的蛋白质包含,优选地由选自SEQ ID No.9至16、18至25、27至34、105至112、114至121和123至130的序列组成。
本申请中描述的序列可总结如下
本发明的主题还是蛋白质复合物,包含:
-包含根据本发明的SEQ ID No.1的突变的序列的蛋白质,和
-序列SEQ IDNo.2的至少一种蛋白质,
所述蛋白质通过二硫桥彼此连接。
本发明的另一主题是编码所述蛋白质的核酸(多核苷酸)。优选地,核酸选自序列SEQ ID No.77至84、86至93、95至102、133至140、142至149和151至158。
本发明的另一主题是表达载体,包含编码所述蛋白质的多核苷酸,或包含所述多核苷酸的表达盒。本发明中,适于根据本发明所使用的表达载体可包含至少一种与核酸序列相连接的表达控制元件。表达控制元件插入到载体中并且使得能够调节核酸序列的表达。表达控制元件的例子特别包括lac系统,λ噬菌体启动子,酵母启动子或病毒启动子。可以并入其他功能性元件,如前导序列,终止密码子,或多聚腺苷酸化信号和在宿主系统随后转录和翻译核酸序列中所需的序列。本领域的技术人员可以理解表达控制元件的正确组合取决于选择的宿主系统。也将理解表达载体必须含有包含核酸序列的表达载体进入和在宿主系统中随后转移和复制所需的额外的元件。
使用常规或可商购方法轻易地构建此类载体。
本发明的另一主题是重组细胞,其包含如上述的表达载体,或如上所述的多核苷酸。根据本发明,可以使用的宿主细胞的实例是真核细胞,如动物,植物,昆虫和酵母细胞;以及原核细胞,如大肠杆菌。可以将携带基因的载体引入到细胞中的方式特别地包括显微注射,电穿孔,转导或通过DEAE-葡聚糖,脂质体,磷酸钙转染,或本领域技术人员已知的其他技术手段。在一个优选实施方案中,使用的是在真核细胞中起作用的真核表达载体。这类载体的例子包括病毒载体,如逆转录病毒,腺病毒,疱疹病毒,牛痘病毒,天花病毒,脊髓灰质炎病毒或慢病毒,细菌表达载体或质粒,如pcDNA5。优选的真核细胞系包括COS细胞,CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,PerC6细胞,HeLa细胞,NIH/3T3293细胞(ATCC#CRL1573),T2细胞,树突细胞或单核细胞。
本发明中的蛋白质可以在转基因动物的乳汁中生产。
在这种情况下,根据第一个方面,包含编码根据本发明的蛋白质的基因的DNA序列的表达由哺乳动物酪蛋白启动子或哺乳动物乳清启动子控制,所述启动子不是天然控制所述基因转录的,并且DNA序列还含有蛋白质分泌的序列。分泌序列包括基因和启动子之间插入的分泌信号。
所用的转基因动物不仅能够产生想要的蛋白质,还能将此能力传递给其后代。蛋白质分泌到乳汁促进了纯化并避免了使用血液制品。动物因此可以从山羊,母兔,母羊或奶牛中选择。
本发明的蛋白质可用作药物。因此,可以将本发明的蛋白质引入药物组合物中。特别地,本发明的蛋白质可用于治疗凝血功能病症,特别是出血性疾病。
本发明的药物组合物可以与可药用的赋形剂,和任选地持续释放基质,如可生物降解的聚合物组合,用于形成治疗组合物。
本发明的药物组合物可以口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、眼内、大脑内、透皮,局部或直肠给药。然后可以将活性成分,单独或与另一种活性成分组合,以单位给药形式给药,作为与常规药物运载体的混合物。单元给药形式包括口服形式,诸如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服溶液或悬浮液、舌下和颊给药的形式、气雾剂、皮下植入物、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下和鞘内给药形式、鼻内给药形式和直肠给药形式。
优选地,药物组合物含有用于能够被注射的制剂的可药用的运载体。这可特别地涉及无菌,等渗的配方,盐水溶液(具有磷酸单钠或磷酸二钠,氯化钠,氯化钾,氯化钙或氯化镁等,或这些盐的混合物),或冻干的组合物,其在适当加入无菌水或生理盐水时,能够构成可注射的溶质。
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂、油制剂,包括芝麻油和花生油,以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在任何情况下,形式必须是无菌的,并且必须是流体,因为它必须使用注射器注射。它在制造和储存条件下必须是稳定的,并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用防腐。
本发明的分散剂可以在甘油,液体聚乙二醇或其混合物,或在油中来制备。正常储存和使用的条件下,这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
可药用的运载体可以是溶剂或分散介质,含有例如水,乙醇,多元醇(例如,甘油,丙二醇,聚乙二醇等),其适当的混合物和/或植物油。通过使用表面活性剂,如卵磷脂,可以保持其适宜的流动性。微生物作用的预防可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯类,氯丁醇,苯酚,山梨酸或其他硫柳汞。在许多情况下,加入等渗剂,例如糖或氯化钠等,是有利的。可以通过在组合物中使用吸收延迟剂,例如单硬脂酸铝或明胶,带来可注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的活性物质与几个上面列出的其他成分掺入到适当的溶剂中,随后在适当情况下过滤灭菌制备无菌可注射溶液。作为一般规则,通过将多种灭菌的活性成分掺入包含基本分散介质和那些上面列出所需的其它成分的无菌载体中制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是在真空下干燥和冷冻干燥。在配制过程中,以与剂量方案制剂相容的方式和以治疗有效量施用溶液。可以轻易地以多种药学形式施用制剂,诸如上述的可注射溶液,但药物释放胶囊等也可以使用。对于例如在水性溶液中肠胃外给药,溶液必须适当缓冲并且用足够量的盐水溶液或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特别的水性溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。在这方面,可以使用的无菌水性介质对本领域的技术人员是已知的。例如,可以将一剂溶解于1ml等渗NaCl溶液中,并然后添加至1000ml的适当的液体,或在计划输液的位置上注射。某些剂量—方案变化将根据受治疗的对象的状况进行。
本发明的药物组合物可以配制成治疗混合物,其包含约0.0001至1.0毫克,或约0.001至0.1毫克,或约0.1至1.0毫克,或甚至约10毫克每剂量或更多。也可以施用多次剂量。对特别的病人,治疗有效剂量的水平将取决于多种因素,包括治疗的病症和疾病的严重程度,使用的具体化合物的活性,所用的具体组合物,患者的年龄,体重,一般健康状况,性别和饮食,给药时间,给药途径,所使用的具体化合物的排泄速率,治疗的持续时间、或其他并行使用的药物。
以下实施例用于说明本发明的多种实施方案的目的。
图例
图1:天然人因子X的结构
图2:突变体开发策略
族1涵盖包含突变A或A'的突变体。
族2将包含突变B的突变体共同分组。
族3将包含突变C或C'的突变体共同分组。
图3:在CHO中生产的变体因子的表达水平
转染后在CHO中表达这三个FX族。用Zymutest FX试剂盒(Hyphen)一式三份地分析第7天的上清液。浓度(μg/ml)沿y轴表示。标准差在直方图的上方标注。族1,灰条;族2,黑条;族3,白条。
图4:在HEK中生产的因子X及变体的表达水平
转染后在HEK293S中表达这三个FX族。用Zymutest FX试剂盒(Hyphen)一式三份地分析第7天的上清液。浓度(μg/ml)沿y轴表示。标准差在直方图的上方标注。族1,灰条;族2,黑条;族3,白条。
图5:CHO中生产的因子X及变体在因子X缺陷血浆中的精确计时活性
转染后在CHO-S中表达这三个FX族。通过Star自动化设备(Stago)上的TP测试至少一式两份地分析第7天的上清液。凝固时间使得可以计算比活性(以s/(μg/ml))并然后转换为百分比野生型重组因子X活性。沿着y轴给出这些值。标准差在直方图的上面标示。族1,灰条;族2,黑条;族3,白条。*FX-Kal2族3,没有做。
图6:CHO中生产的族1的因子X变体在由RVV-X级分激活后的活性
转染后在CHO-S中表达族1的FX变体。在存在Russell毒蛇毒液的RVV-X级分的情况下以两个FX浓度(至少一式两份)孵育第七天的上清。FXa的出现通过在405nm处监测pNAPEP 1025底物的水解测量。初始转换率(mODU/min/nM)与FX-WT的进行比较,固定为100%。建立两种浓度的值的平均并在y轴给出。标准差在直方图的上面标出。
图7:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由组织因子(1pM)激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,分别以3.5和1.65μg/ml使用FX-Kal2和3。
图8:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,分别以3.5和1.65μg/ml使用FX-Kal2和3。
图9:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由组织因子或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图7和8得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal2和3(*)分别以3.5和1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的5μg/ml。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
图10:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由组织因子(1pM)激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,分别以3.5和1.65μg/ml使用FX-Kal2和3。
图11:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,分别以3.5和1.65μg/ml使用FX-Kal2和3。
图12:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族2的变体,由组织因子(1pM)或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图10和11得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal2和3(*)分别以3.5和1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的5μg/ml。结果以对数比例呈现。为了更大的可读性,低于1nM/min的生成的凝血酶的值未表示(+)。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
图13:FX-WT及族2变体的凝血酶激活。
在含有Pefachrome FXa 8595底物的Hepes缓冲液中存在凝血酶(10nM)的情况下,进行FX-WT和其族2的某些变体的激活。随时间在405nm处监测由生成的FXa所释放的对-硝基苯胺的出现。多种浓度的激活的因子X作为阳性对照使用。
图14:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由组织因子激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图15:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图16:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由组织因子(1pM)或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图14和15得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal 3(*)以1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的7.5μg/ml。FX-WT的值是两次实验的平均。为了更大的可读性,低于1nM/min的生成的凝血酶的值未表示(+)。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
图17:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由组织因子激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且FIX缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FIX过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图18:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且FIX缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FIX过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图19:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族1的变体,由组织因子(1pM)或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图17和18得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal 3(*)以1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的7.5μg/ml。FX-WT的值是两次实验的平均。为了更大的可读性,低于1nM/min的生成的凝血酶的值未表示(+)。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
图20:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族3的变体,由组织因子激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆和---)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图21:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族3的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FVIII缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FVIII过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆和---)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图22:对因子VIII缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族3的变体,由组织因子(1pM)或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图20和21得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal 3(*)以1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的7.5μg/ml。FX-WT的值是两次实验的平均。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
图23:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族3的变体,由组织因子激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FIX缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FIX过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图24:对因子IX缺陷的血浆的汇集物加入FX或其族3的变体,由脑磷脂激活后获得的凝血酶图
-沿x轴:时间(分钟)
-沿y轴:观察到的凝血酶的最大浓度(nM)
正常血浆汇集物样品由黑色曲线(●)代表,并且因子FIX缺陷的血浆汇集物样品由(○)代表。对应于用1U/ml或0.1U/ml的FIX过载的缺陷血浆的曲线分别由符号■和□代表。代表野生型FX及变体的符号如下:FX-WT(◆)、FX-对照+(◇)、FX-IIa(▲)、FX-PAR1(△)、FX-PAR1M(实线的×)、FX-FIXa1(*)、FX-FIXa2(虚线曲线的×)、FX-Kal1()、FX-Kal2()和FX-Kal3(无符号实线)。因子X或其变体以7.5μg/ml使用,除了由于技术上的原因,以1.65μg/ml使用FX-Kal 3。
图25:对因子IX缺陷的血浆的汇集物中加入FX或其族3的变体,由组织因子(1pM)或脑磷脂激活后获得的凝血酶图的速度
呈现从图23和24得出的速度的值(以生成的凝血酶的nM/min)。应当注意的是,FX-Kal 3(*)以1.65μg/ml使用而非其他FX及变体的7.5μg/ml。FX-WT的值是两次实验的平均。白条,通过用组织因子(1pM)激活得到的值;黑条,通过用脑磷脂激活得到的值。
实施例
实施例1:因子X变体的互补DNA的生成
1-一般性观察
多种构建体的核苷酸和蛋白序列在序列表中提供,并且在本说明书的表中总结。野生型FX分子称为FX-WT(SEQ ID No.7),它对应于人FX,其核苷酸序列已经优化。该分子将用作突变的分子的三个族的对照。
突变的分子是根据位于重链上游的切割位点来命名的。FX-对照+对应于纤维蛋白原上的凝血酶的识别位点,或纤维蛋白肽A。根据本发明的突变的分子分别命名为FX-IIa(凝血酶切割共有位点),FX-PAR1(PAR1受体上修饰的凝血酶切割位点),FX-PAR1M(PAR1受体上没有糖基化位的修饰的凝血酶切割位点),FX-FXIa1(FIX上的FXIa切割位点1),FX-FXIa2(FIX上的FXIa切割位点2),FX-KAL1(FXII上的激肽释放酶切割位点1),FX-Kal2(FXII上的激肽释放酶切割位点2)和FX-Kal3(FXII上的激肽释放酶切割位点3)。
如图2所示,这些位点中的每一个存在于不同的环境(族)中,即:
-在由激活肽切割位点上游6或10个氨基酸替换(突变A或A')组成的族1中;
-或在由激活肽切割位点上游相同序列的插入(突变B或B')组成的族2中;
-或在由激活肽切割位点上游这些序列的插入,与激活多肽的一部分的缺失偶联(突变C或C')组成的族3中。
因此,序列SEQ ID No.9至16的蛋白对应于序列SEQ ID No.7,其中已经插入了突变A或A'。因此,这些蛋白属于族1。
序列SEQ ID No.18至25的蛋白质对应于序列SEQ ID No.7,其中已经插入了突变B。因此,这些蛋白属于族2。
最后,序列SEQ ID No.27至34的蛋白质对应于序列SEQ ID No.7,其中已经插入了突变C或C'。因此这些蛋白质属于族3。
序列SEQ ID No.8、17和26对应于FX-对照+,并且是相当的。
2-实验方案
通过装配或Infusion PCR,使用审慎设计的引物引入每种变体特异性的序列,以允许在对于人中表达优化的编码FX的合成的核苷酸序列(SEQID NO.35)中插入和/或缺失核苷酸序列。
2.1.编码人FX的pCEP4-FXWT4HS-gs载体的制备
用BamHI和HindIII酶消化含有对于人中表达优化的合成的基因并由Genescript制备的pUC57克隆载体,比如pCEP4表达载体(LifeTechnologies公司)。对应于FX基因(FXWT4HSgs)的插入片段和经消化的pCEP4载体用Nucleospin extract II(Clonetech Laboratories)纯化,然后用T4连接酶连接在一起。连接产物用于转化Top10细菌(LifeTechnologies)。通过使用BamHI和HindIII酶消化质粒,并将消化产物通过琼脂糖凝胶以检测其中1519bp的条带,来确定细菌菌落中插入片段的存在。通过使用CMVs1(5'-GGGACTTTCCTACTTGGCAGT-3'SEQID No.36)和SV40-3'UTR(5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTGGT-3'SEQID No.37)引物进行测序验证cDNA。
2.2-编码人FX的OptiCHO FXWT4HS载体的制备
为变体的最佳表达,后者和野生型分子也在OptiCHO载体中制备。
使用pCEP4-FXWT4HS-gs载体,以5'FXWT和3'FX-SwaI引物通过PCR(kapa Hifi;Biosystems)扩增FXWT4HS序列的cDNA。
使用Nucleospin extract纯化1551-bp的PCR产物,然后使用NheⅠ和SwaI酶消化,就像OptiCHO目的载体一样。消化后将它们再次在Nucleospin Extract上进行纯化。
使用T4连接酶将插入片段和载体连接在一起,然后将连接产物整合到感受态Top10细菌中。在氨苄青霉素的存在下扩增细菌后,细菌菌落从培养皿取样并使用5'ef1a和3FX引物通过PCR筛选以搜索296-bp的扩增子,所述扩增子是编码FX的插入片段在OptiCHO载体中存在的标志。通过用Nhe I和SwaI酶酶促消化筛选经纯化的载体以在琼脂糖凝胶上寻找1538-bp片段来对PCR筛选补充。用以下引物对OptiCHO-FXWT4HS载体测序:
-5'ef1a:5'-GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG-3'(SEQ ID No.38)
-3FX:5'-CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGC-3'(SEQ ID No.39)
-2BGHPA:5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3'(SEQ ID No.40)
2.3.族1变体的制备
根据表1通过装配PCR并连接,或通过Infusion技术使用在表2中列出的引物,进行编码族1变体的cDNA的插入片段的制备。PCR1和2中使用的模板是OptiCHO-FXWT4HS载体。将PCR产物用DpnI处理以消化亲本DNA。用Nucleospin extract纯化目标扩增子。
对于OptiCHO-FX WTF1D,OptiCHO-FX WTF1G和OptiCHO-FXWTF1I分子,使用来自PCR 1和2的纯化的扩增子作为模板并通过装配PCR根据表1装配。通过用T4连接酶连接来装配纯化的PCR3扩增子和用NheⅠ和SwaI消化的载体。
表1
表2
对于OptiCHO-FX WTF1a,OptiCHO-FX WTF1b,OptiCHO-FXWTF1c,OptiCHO-FX WTF1e,OptiCHO-FX WTF1f和OptiCHO-FXWTF1h分子,通过根据表3的条件的PCR生成来自PCR 1和2的纯化的扩增子。通过与用NheI和SwaI预消化并使用Nucleospin Extract纯化的载体Infusion来装配PCR 1和2的纯化的扩增子。
表3:
对于每个变体,通过细菌转化入Top10细菌插入最终载体。在氨苄青霉素的存在下扩增细菌后,细菌菌落从培养皿取样并使用5'ef1a和3FX引物通过PCR筛选以搜索296-bp的扩增子,所述扩增子是编码FX的插入片段在OptiCHO载体中存在的标志。用以下引物对OptiCHO-FX WTF1a至OptiCHO-FX WTF1i载体测序:
-5'ef1a
-2BGHPA。
2.4族2变体的制备
根据表4通过PCR技术并通过Infusion使用在表2中列出的引物,进行编码族2变体的cDNA的插入片段的制备。用于PCR1和2的模板是OptiCHO-FXWT4HS载体。将PCR产物用DpnI处理以消化亲本DNA。用Nucleospin extract纯化扩增子。通过与用NheI和SwaI预消化并使用Nucleospin Extract纯化的OptiCHO载体Infusion来装配PCR 1和2的纯化的扩增子。
表4:
对于每个变体,通过细菌转化入Top10细菌插入最终载体。在氨苄青霉素的存在下扩增细菌后,细菌菌落从培养皿取样并使用5'ef1a和3FX引物通过PCR筛选以搜索296-bp的扩增子,所述扩增子是编码FX的插入片段在OptiCHO载体中存在的标志。用以下引物对OptiCHO-FX WTF2a到OptiCHO-FX WTF2i载体测序:
-5'ef1a
-2BGHPA。
2.5.-制备的族3变体
族3含有在激活肽中的缺失,所述缺失必须在其中能够插入酶促切割位点之前制备。在此方面,制备了两个中间体载体,OptiCHO FXWT F3AD用于族3变体F3a到F3d,以及OptiCHO FXWT F3EI用于族3变体F3e到F3i。
使用OptiCHO FXWT4HS-gs载体作为模板和表2中所列的5'FXWT,3'FX-SwaI,3FXF3,5FXF3,3FXF3bis和5FXF3bis引物,根据表5通过装配PCR构建中间体载体的插入片段。
表5:
使用Nucleospin extract纯化装配PCR的产物,然后纯化所述产物,就像OptiCHO目的载体一样,使用NheI和SwaI酶。消化后将它们再次在Nucleospin extract上进行纯化。
使用T4连接酶将插入片段和载体连接在一起,然后将连接产物整合到感受态Top10细菌中。在氨苄青霉素的存在下扩增细菌后,细菌菌落从培养皿取样并使用5'ef1a和3FX引物通过PCR筛选以搜索296-bp的扩增子,所述扩增子是编码FX的插入片段在OptiCHO载体中存在的标志。
用以下引物对OptiCHO FXWT F3AD和OptiCHO FXWT F3EI中间体载体测序:
‐5'ef1a
‐3FX
‐2BGHPA.
例外的是OptiCHO FXWT F3A分子,根据表6通过装配PCR使用在表2中列出的引物,进行编码系列3变体的cDNA的插入片段的制备。用于PCR 1和2的模板是OptiCHO-FXWT F3AD载体用于族3变体F3a至F3d,和OptiCHO FXWT F3EI用于族3变体F3e至F3i。用Nucleospinextract纯化扩增子。通过用以NheI和SwaI预消化并使用Nucleospinextract纯化的OptiCHO载体装配PCR来装配PCR 1和2的纯化的扩增子。
表6:
使用Nucleospin extract纯化装配PCR的产物,然后纯化所述产物,就像OptiCHO目的载体一样,使用NheI和SwaI酶。消化后将它们再次在Nucleospin extract上进行纯化。
使用T4连接酶将插入片段和载体连接在一起,然后将连接产物插入感受态Top10细菌中。在氨苄青霉素的存在下扩增细菌后,细菌菌落从培养皿取样并使用5'ef1a和3FX引物通过PCR筛选以搜索296-bp的扩增子,所述扩增子是编码FX的插入片段在OptiCHO载体中存在的标志。
用以下引物对最终族3载体进行测序:
-5'ef1a
-2BGHPA
实施例2:重组因子X的生产
1-实验方案
1.1-试剂
ProCHO4(Lonza)和FreestyleTMF17(GIBCO)培养基。
L-谷氨酰胺(Gibco)。
CHO-S细胞转染培养基:Opti-Pro SFM(Gibco)。
HEK细胞转染培养基:Opti-MEM(Gibco)。
维生素K1(Sigma)。
1.2–方案
在CHO-S或HEK-293-Freestyle真核细胞(Invitrogen)中以瞬时表达生产野生型因子X和其变体。
CHO-S细胞在ProCHO4介质中培养,HEK293F细胞在F17介质中培养,分别补充有4mM和82mM的L-谷氨酰胺。两种细胞系在37℃下在受控的气室中(8%CO2)以135rpm震荡的条件下培养。在转染日的前一天,将以7×105个细胞/ml的密度接种细胞。
在转染当天,将DNA(20-30μg)和30μg转染剂(TA)单独在CHO-S的Opti-Pro培养基和HEK293F的Opti-MEM培养基中预孵育5分钟,然后混合并孵育20分钟以允许DNA/TA复合物的形成。整个系统添加到30毫升体积的1×106个细胞/ml的细胞制物中。
在使用天然维生素K环氧化物还原酶(VKOR)共转染FX的情况下,两种载体以多种比例加入以获得DNA的总量为20-30μg。VKOR酶使得在HEK中制造有活性的FX同时优化的γ-羧化。转染后,将维生素K1(5μg/ml)立即加入到培养基中。转染后的第一天对转染水平进行评估,使用表达GFP(绿色荧光蛋白)的对照质粒。以“批次”模式进行生产7天。在生产结束时,通过离心分离细胞和上清。将细胞除去并过滤上清,然后冷冻。
实施例3:因子X浓度的测量
1-实验方案
借助商用ELISA Zymutest Factor X(Hyphen Biomed)根据制造商的建议来测定因子X浓度。一式三份地测量浓度,使用位于测定法的检测的线性区域的抗原值。为了确保引入的突变不破坏浓度的测量,FX以相等量沉积并通过使用与ELISA中所用的不同的多克隆抗体的免疫印迹(抗人FX多克隆抗体(Cryopep货号PAHFX-S))或通过SDS-PAGE后染色显示(数据未显示)。
2-结果
2.1-在CHO中瞬时表达的因子X变体的表达
通过使用商用ELISA Zymutest Factor X测量在转染了编码族1至3的cDNA的CHO-S细胞的上清中存在的因子X(FX)变体的浓度(图3)。
正如所料,未转染的(对照)CHO细胞的上清不含有FX。用编码多种FX的载体转染使得能够得到范围从0.5至3.06μg/ml的水平。多个族的FX的表达没有大的区别。至多,族3的FX-IIa表达(2.64μg/ml)比族1的表达(1.26μg/ml)强2.1倍。一些构建体使得能够获得浓度高于野生型因子X的因子X:它们是FX-IIa族(族3)和FX-PAR1(族1和3)构建体。FX-Kal3似乎降低FX生产。
2.2-在HEK中瞬时表达的因子X变体的表达
通过使用商用ELISA Zymutest Factor X测量在转染了编码族1至3的cDNA的HEK293S细胞的上清中存在的因子X变体的浓度(图4)。正如所料,未转染的(对照)HEK293S细胞的上清不含有FX。族1分子以接近FX-WT的水平生产(从0.14至1.64μg/ml)。仅FX-PAR1分子以较高的水平生产。FX-Kal3分子保持是最少生产的分子。族2以对所有构建体类似的方式生产,表达值为从1.79至2.54μg/ml除了FX-Kal3构建体以较低水平生产(0.66μg/ml)。族3以从0.2至1.2μg/ml的较低的水平生产。
结论是,某些因子X变体构建体使得以比FX-WT更高的水平生产FX成为可能:
-这些是,在CHO细胞中,FX-IIa(族3)和FX-PAR1(族1和3)构建体和
-在HEK细胞中,族1的FX-PAR1。
实施例4:在CHO-S中产生的因子X变体的凝血活性测量
1-实验方案
使用Star automated device(Stago)在FX-缺陷血浆存在的条件下测量由CHO-S细胞生产的FX变体的精确计时活性。FX-缺陷血浆,neoplastin和Owren-Koller缓冲液来自Stago(Asnières,法国)。
浓缩的培养上清液在Owren-Koller缓冲液中稀释到1/10,然后添加到FX缺陷血浆。将混合物在37℃孵育240秒,然后通过添加100μl neoplastin启动凝血酶原时间(PT)。
将凝血时间(s)转换成FX的比活性。
2-结果
评价从CHO中的多次转染所得的浓缩的上清补偿因子X缺陷的能力。将上清在FX缺陷血浆中孵育,并进行PT测试。将凝血时间(s)转换为比活性(SA;秒每微克蛋白),然后计算比活性与野生型FX相比的百分比(图5)。多个族之间的结果是一致的。这一结果表明,行为差异主要源于切割位点而不是它们克隆的方式。
构建体可以分为三类:第一类中,其SA类似于FX-WT(含有FX-对照+),第二类中,其SA与对照相比降低(含有FX-IIa、FX-PAR1、FX-PAR1M和FX-Kal3)以及第三类别,其活性在缺乏FX时大于FX-WT(含有FX-FXIa 1和2、FX-KAL 1和2)。应当注意的是,FX-Kal2族3构建体因技术原因不能分析(图上的*)。
这些结果表明,引入并且形成族3的修饰(FX-FXIa 1和2、FX-KAL1和2)对因子X分子,赋予在缺乏内源性因子X时比野生型因子X更有效的凝血能力。
实施例5:CHO-S中产生的因子X变体通过RVV-X毒液级分的激活的测量
1-实验方案
在存在Russell毒蛇毒液抗因子X级分(RVV-X)的条件下孵育培养物上清后,测量CHO-S细胞产生的FX变体的激活。对照激活的因子X,毒液级分X(RVV-X)和pNAPEP 1025底物来自HaematologicTechnologies(Cryopep Montpellier,法国)。
在37℃在下列缓冲液中研究激活:25mM HEPES,pH 7.4,0.175MNaCl,5mM的CaCl2和5mg/ml BSA。对于浓度为0至100nM的FX,使用浓度为200mU/ml的RVV-X。孵育5分钟后,在50mM Tris缓冲液,pH 8.8,0.475M NaCl,9mM EDTA中终止反应。通过测量pNAPEP 1025底物(250μM)的水解速度在405nm处监测生成的FXa的量。
2-结果
表达族1变体的CHO上清液与RVV-X孵育。使用多种浓度的FX在该处理后测量FXa的生成。通过溶液中pNAPEP1025的产物的出现速度(mODU/分钟)定量FXa的存在。这一生成反应了RVV-X对FX的识别和切割,和产生的FXa识别FX底物的能力。对于FX的多种初始浓度计算表观速度的平均值,并且该值与FX-WT的值的百分比相关。
族1的分析部分地显示与PT所获得的结果相似的结果,特别是对于FX-对照+,FX-IIa,FX-Kal 1,FX-Kal2和FX-Kal3(图6)。FX-XIa1和2分子表现出活性,但这一次不大于FX-WT。另一方面,FX-PAR1和FX-PAR1M分子展示出大于由PT所观察到的显著活性。
这些结果表明,族1的FX-PAR1M和FX-Kal2由RVV-X比FX-WT更有效激活。
实施例6:在凝血酶产生时间(TGT)方面对族2因子X变体的促凝血能力的测量:FVIII缺陷血浆中的外源性凝血途径的激活(TF 1pM/PL4μM)
1-实验方案
1.1-试剂
凝血酶校准物,低PPP试剂,CK-Prest,Fluca试剂盒(Fluo-缓冲液+Fluo-底物),PNP和FIX缺陷血浆来自Stago(Asnières,法国)。FX缺陷血浆来自Cryopep(法国蒙彼利埃)。FVIII缺陷血浆来自SiemensHealthcare(德国Marburg)。人FX(货号HCX-0050),和人FXa(货号HCXA-0060)来自Haematologic Technologies Inc.(Burlington,Vt,美国)。对照重组人因子VIII来自Baxter(Recombinate)(Maurepas,法国)。
1.2–方案
认为血浆中1个单位的FX(1U/ml)=10μg/ml,对应于在血浆中的100%FX水平。
凝血酶生成测试在于通过组织因子和磷脂的混合物(外部途径的激活),或通过脑磷脂(内部途径的激活)先体外后体内激活凝血,并然后在于测量随时间生成的凝血酶的浓度。
在存在含有终浓度1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)的20μl的PPP试剂(Stago)的条件下,对任选地含有细胞上清或对照的80μl血浆汇集物进行凝血酶生成测试。可以使用多种血浆,正常的,因子X缺陷的,因子VIII缺陷的或因子IX缺陷的。
反应通过加入20μl的Fluca-试剂盒(底物+氯化钙)启始,其构成测量凝血酶出现的开始。以390nm的激发波长和以460nm的发射波长在Fluoroskan Ascent荧光计(ThermoLabsystems)上测量荧光的出现。然后通过ThrombinoscopeTM软件分析凝血酶图(代表荧光强度作为时间的函数的曲线),所述软件通过比较性计算将荧光值转变为以nM计的凝血酶。
2-结果
将上清浓缩大约20倍,在Sartorius VivaSpin20-30kDa上进行,在2500g下至少1小时,直到获得所需的浓度。使用通用定标物血浆和以0,0.1或1U/ml重构的FVIII缺陷血浆用作对照。
正如预期的那样,用组织因子激活凝血之后,FVIII缺陷血浆给出最弱的信号,对应实验的背景噪声。通用定标物血浆给出比用FVIII浓度(0.1或1U/ml)重构的FVIII缺陷血浆弱的信号。另一方面,用FX-WT重构FVIII缺陷血浆并不能产生足够量的凝血酶。这个重构几乎不比单独的缺陷血浆大(图7,表7)。
所有FX变体分子给出比FX-WT大的信号,提示在缺乏FVIII时它们产生凝血酶的能力相比FX-WT显著增加(表7)。族2的FX突变体的速度在FX-WT的2和4.5倍之间波动(图9,表7)。应当注意的是,以低30%的FX-Kal2的量(3.5μg/ml而不是5μg/ml)获得了2X速度。
在缺乏FVIII时能够生成最大量的凝血酶的突变体,依次为,FX-PAR1,FX-FXIa1,FX-IIa和FX-KAL1。
实施例7:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量因子X变体的促凝能力:FVIII缺陷血浆中的内部凝血途径(单独的脑磷脂)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在20μl的脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的正常血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的血浆和因子VIII缺陷血浆。
2-结果
使用相同的对照,用脑磷脂激活后通过TGT分析实施例6中使用的上清。
对照表现如预期,FVIII缺陷血浆不允许任何的IIa生成,并且当增加FVIII剂量时发现了有效性的梯度(表8)。
族2的分析显示,如预期,野生型FX是活性最低的分子,表现出弱的剩余活性(3.4nM/s)。所有其他分子表现出更大的产生凝血酶的能力(表8)。FX-Kal-1至3,FX-FXI-2和FX-PAR1M分子显示略强的活性(6.6至8.7nM/s),但低于FX-对照+,FX-PAR1和FX-FXI-1构建体(10.5-13.3nM/s)。另一方面,FX-IIa分子使得能够获得介于0.1和1U/ml的FV III所获得的值之间的信号(78.2nM/s),非常有效地校正了FVIII缺陷。这些在速度上的差异显示突变体的高1.8X(但对于3.5μg/ml的FX-Kal2突变体)至高22.8X(对于FX-IIa突变体)的凝血酶生成有效性。
结论是,几个FX突变体具有在用组织因子和脑磷脂激活血浆后在缺乏FVIII时还原凝血的能力。
实施例8:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族2的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的外部凝血途径的激活(TF 1pM/PL 4μM)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的正常血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的或因子IX缺陷的。
2-结果
用组织因子激活后通过TGT分析实施例6中使用的上清,作为对照使用正常血浆(通用定标物)或用0、0.1或1U/mL的血浆FIX重构的FIX缺陷血浆(图10,表9)。
FIX缺陷血浆是阴性的(它不能使任何IIa生成),并且其用FIX重构允许其生成大量凝血酶。然而,使用的FIX的两种浓度之间没有定量差异,由此表明它们均使得能形成最大量的IIa(表9)。
在此测定中,所有的突变体都使得能比FX-WT生成更大量的IIa。然而,差异比在缺乏FVIII时较少:因此,速度范围从1.50X(对于3.5μg/ml的FX-Kal2)到4.60X(对于FX-PAR1)。除此突变体外,FX-IIa、FX-PAR1M、FX-FXIa1和FX-KAL1分子是最有效的(图12,表9)。
实施例9:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族2的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的内部凝血途径的激活(脑磷脂)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的正常血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的或因子IX缺陷的。
2-结果
用脑磷脂激活后通过TGT分析实施例6中使用的上清,作为对照使用正常血浆(通用定标物)和用0、0.1或1U/mL的血浆FIX重构的FIX缺陷血浆(图11,表10)。
FIX缺陷血浆是阴性的(它不允许任何IIa生成),并且其用FIX重构允许其生成大量凝血酶。然而,使用的FIX的两种浓度之间没有定量差异,由此表明它们形成最大量的IIa(表10)。
在用脑磷脂诱导凝血后,只有三种分子使得能生成显著多于FX-WT的凝血酶,他们是FX-IIa、FX-对照+和FX-PAR1,速度分别比FX-WT的速度高61X、8.3X和3.8X(图12,表10)。然而,其他突变体具有大于FX-WT的速度。
结论是,研究的所有突变体都使得在缺乏FIX时能够生成凝血酶,无论使用的诱导如何。FX-IIa,FX-对照+和FX-PAR1是最有效的。
实施例10:在HEK中产生的族2的因子X变体和野生型因子X的凝血酶激活
1-实验方案
在存在凝血酶的条件下孵育培养物上清后,测量在存在维生素K环氧化物还原酶(VKOR)时,由HEK细胞生产的FX变体的激活。对照激活的因子X,凝血酶和Pefachrome FXa8595底物来自HaematologicTechnologies(Cryopep,蒙彼利埃,法国)。
磷脂来自Diagnostica Stago(Asnières,法国)。
在37℃在下列缓冲液中研究激活:25mM HEPES,pH 7.4,0.175MNaCl,5mM的CaCl2和5mg/ml BSA。对于浓度为42.5和85nM的FX,使用浓度为10nM的凝血酶和浓度为4μM的磷脂。在37℃孵育1小时后,通过测量Pefachrome FXa8595底物(250μM)的水解速度在405nm处监测生成的FXa的量。
2-结果
为了证实旨在由凝血酶切割的位点实际上确由这种酶识别,在凝血酶存在下孵育FX-WT,FX-对照+和FX-IIa的浓缩的上清。FXa的出现由底物降解产物的出现测量(图13)。血浆FXa用作阳性对照。突变体的产物出现的动力学不能直接与FXa的动力学相比,因为这些分子在释放活性前需要被激活。此外,由于凝血酶的切割位点是复合体,分子的激活不一定最佳。事实上,所有分子保有切割位点下游的原始区域,只在上游部分修饰。所以,FXa底物由重组分子降解的动力学是和由FXa降解的动力学不同的。
所获得的结果证实由TGT所获得的数据,正如预期,血浆和WT FXs是阴性的因为它们不具有凝血酶识别位点。另一方面,FX-IIa和FX-对照+能够由凝血酶激活并能够释放FXa。正如TGT测量中,FX-IIa比FX-对照+更有效地激活。
实施例11:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族1的因子X变体的促凝能力:FVIII缺陷血浆中的外部凝血途径(TF 1pM/PL 4μM)
1–实验方案
在存在含有终浓度为1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)的20μl的PPP试剂(Stago)的条件下,对任选地含有细胞上清或对照的80μl的正常血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用多种血浆,正常和因子VIII缺陷的。
反应通过加入20μl的Fluca-试剂盒(底物+氯化钙)启始,其构成测量凝血酶出现的开始。以390nm的激发波长和以460nm的发射波长在Fluoroskan Ascent荧光计(ThermoLabsystems)上测量荧光的出现。然后通过ThrombinoscopeTM软件分析凝血酶图(代表荧光强度作为时间的函数的曲线),所述软件通过比较性计算将荧光值转变为以nM计的凝血酶。
2–结果
使用已经描述的对照,在用组织因子激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族1上清液。对照(正常血浆,用重组FVIII重构的或未用重组FVIII重构的FVIII缺陷血浆)表现如预期。另外,FX-WT给出了中等但高于预期的信号(图14和16;表11)。然而它的平均速度(59nM/min)被若干突变体超过,特别是FX-FXIa1/2,FX-Kal1/2和FX-对照+以及FX-IIa,其速度至少是对照的130%。
实施例12:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族1的因子X变体的促凝能力:FVIII缺陷血浆中的内部凝血途径(单独的脑磷脂)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在20μl的脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的血浆和因子VIII缺陷血浆。
2–结果
使用已经描述的对照,在用脑磷脂激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族1上清。
对照表现如预期,FVIII缺陷血浆是阴性的(其不允许任何IIa生成),并且在增加FVIII的剂量时发现有效性的梯度(图15;表12)。在此测定法中,补充FX(进行了两次测定法)不能使得生成显著量的凝血酶(6.06和7.65nM/分钟的速度)。另一方面,FX-IIa、FX-FXIa1和2和FX-对照+族1突变体使得能够生成显著更大量的凝血酶,至少是对照的3.5X(图15和16;表12)。
实施例13:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族1的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的外部凝血途径(TF 1pM/PL 4μM)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在含有终浓度为1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)的20μl的PPP试剂(Stago)和20μl fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清或对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常血浆和因子IX缺陷的血浆。
2-结果
使用已经描述的对照,在用组织因子激活后,在FIX-缺陷血浆中通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族1上清。对照(正常血浆,用血浆FIX(10%或100%)重构的或未用血浆FIX重构的FIX缺陷血浆)表现如预期。另外,FX-WT给出了中等但高于预期的信号(图17;表13)。然而它的平均速度(23nM/min)被除了FX-PAR1的全部突变体超过。所述突变体特别是FX-FXIa1/2,FX-Kal1/2和FX-对照+以及FX-IIa,其速度至少是对照的150%。
实施例14:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族1的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的内部凝血途径(脑磷脂)
1–实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在20μl的脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的血浆和因子IX缺陷血浆。
2–结果
使用已经描述的对照,在用脑磷脂激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族1上清。
对照表现如预期,FIX缺陷血浆是阴性的(其不允许任何IIa生成),并且在增加FIX的剂量时发现有效性的梯度(图18;表14)。在此测定法中,补充FX(进行了两次测定法)不能使得生成显著量的凝血酶(1.24和1.53nM/分钟的速度)。另一方面,FX-IIa、FX-FXIa1和2和FX-对照+族1突变体使得能够生成显著更大量的凝血酶,至少是对照的4.7X至55X(图18和19;表14)。
实施例15:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族3的因子X变体的促凝能力:FVIII缺陷血浆中的外部凝血途径(TF 1pM/PL 4μM)
1-实验方案
在存在含有终浓度为1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)的20μl的PPP试剂(Stago)的条件下,对任选地含有细胞上清或对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用多种血浆,正常和因子VIII缺陷的。
反应通过加入20μl的Fluca-试剂盒(底物+氯化钙)启始,其构成测量凝血酶出现的开始。以390nm的激发波长和以460nm的发射波长在Fluoroskan Ascent荧光计(ThermoLabsystems)上测量荧光的出现。然后通过ThrombinoscopeTM软件分析凝血酶图(代表荧光强度作为时间的函数的曲线),所述软件通过比较性计算将荧光值转变为以nM计的凝血酶。
2–结果
使用已经描述的对照,在用组织因子激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族3上清液。对照(正常血浆,用重组FVIII重构的或未用重组FVIII重构的FVIII缺陷血浆)表现如预期。另外,FX-WT给出了中等但高于预期的信号(图20和21;表15)。然而它的平均速度(59nM/min)被若干突变体超过,特别是FX-FXIa1/2,FX-Kal1/2/3和FX-对照+以及FX-IIa,其速度高于78nM/min(即,至少是对照的130%)。
实施例14:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族3的因子X变体的促凝能力:FVIII缺陷血浆中的内部凝血途径(单独的脑磷脂)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。在存在20μl的脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的血浆和因子VIII缺陷血浆。
2–结果
使用已经描述的对照,在用脑磷脂激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族3上清。
对照表现如预期,FVIII缺陷血浆是阴性的(其不允许任何IIa生成),并且在增加FVIII的剂量时发现有效性的梯度(图21;表16)。补充FX(进行了两次测定法)不能使得生成显著量的凝血酶(6.06和7.65nM/分钟的速度)。另一方面,FX-IIa、FX-FXIa1和2和FX-对照+族3突变体使得能够生成显著更大量的凝血酶,其速度高于26nM,即至少比FX-WT快3.8X(图23;表16)。
实施例15:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族3的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的外部凝血途径(TF 1pM/PL 4μM)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。
在存在含有终浓度为1pM的组织因子(TF)和4μM的磷脂(PL)的20μl的PPP试剂(Stago)和20μl fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清或对照的80μl的血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常血浆和因子IX缺陷的血浆。
2-结果
使用已经描述的对照,在用组织因子激活后,通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族3上清。
对照表现如预期,FIX缺陷血浆是阴性的(其不允许任何IIa生成),并且在增加FIX的剂量时发现有效性的梯度(图23;表17)。补充FX(进行了两次测定法)不能使得生成显著量的凝血酶(23nM/分钟的平均速度)。另一方面,族3的全部突变体,除了FX-PAR1M外,使得能够生成显著量的凝血酶,其速度大于33nM,即至少比FX-WT快140%(图23;表17)。
实施例16:在凝血酶产生时间(TGT)方面,测量族3的因子X变体的促凝能力:FIX缺陷血浆中的内部凝血途径(脑磷脂)
1-实验方案
试剂,自动化设备和实验方案与实施例6中描述的是相同的。在存在20μl的脑磷脂(用1ml的蒸馏水重构的CK-Prest)和20μl的fluca–试剂盒(底物+氯化钙)的条件下,对任选地含有细胞上清和对照的80μl的正常血浆汇集物进行凝血酶生成测试。使用的血浆是正常的血浆和因子IX缺陷血浆。
2–结果
使用已经描述的对照,在用脑磷脂激活后通过TGT分析在VKOR存在下从转染的HEK293F细胞得到的族3上清。
对照表现如预期,FVIII缺陷血浆是阴性的(其不允许任何IIa生成),并且在增加FXI的剂量时发现有效性的梯度(图24;表18)。在此测定法中,补充FX(进行了两次测定法)不能使得生成显著量的凝血酶(1.24和1.53nM/分钟的速度)。另一方面,FX-IIa、FX-FXIa1和2、FX-Kal 2和3、和FX-对照+族1突变体使得能够生成显著更大量的凝血酶,至少是对照的3.4X至52X(图24和25;表18)。此外,全部突变体,除了FX-PAR1M和FX-Kal2突变体,均比FX-WT活性更高。
Claims (11)
1.包含SEQ ID No.1的突变的序列的蛋白质,所述SEQ ID No.1的突变的序列包含至少一个突变A、A'、B、C或C',其中:
突变A由用选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸43至52组成,
突变A’由用选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列替换序列SEQ ID No.1的氨基酸47至52组成,
突变B由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQID No.1的氨基酸52和53之间的插入组成,
突变C由选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至13的缺失组成,
突变C'由选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列在序列SEQ ID No.1的氨基酸52和53之间的插入,和序列SEQ IDNo.1的氨基酸4至9的缺失组成,
其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺。
2.如权利要求1中所述的蛋白质,其特征在于其包含,优选地由具有至少一个突变A、A'、B、C或C'的序列SEQ ID No.7组成。
3.如权利要求1或2中所述的蛋白质,其特征在于其包含选自SEQ IDNo.9至16、18至25、27至34、105至112、114至121,和123至130的序列。
4.蛋白质复合体,其包含如权利要求1至3中任一项所述的蛋白质,和序列SEQ ID No.2的至少一种蛋白质,所述蛋白质通过二硫桥彼此连接。
5.核酸,其特征在于其编码如权利要求1至4中任一项所述的蛋白质。
6.如权利要求5中所述的核酸,其特征在于其选自序列SEQ ID No.77至84、86至93、95至102、133至140、142至149和151至158。
7.包含如权利要求5或6中所述的核酸的表达盒。
8.表达载体,其特征在于其包含如权利要求7中所述的表达盒。
9.重组细胞,其包含如权利要求5或6中所述的核酸,所述核酸优选包括于如权利要求8中所述的载体中。
10.如权利要求1至4中任一项所述的蛋白质,其用作药物。
11.如权利要求1至4中任一项所述的蛋白质,其用于治疗出血性病症。
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