CN104962585B - 一种培养微藻生产氢气的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种培养微藻生产氢气的方法，首先构建微藻的聚集体，然后将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。构建微藻的聚集体方法包括以下步骤：(1)将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于1.2×108cells/mL；(2)将带氨基的阳离子聚电解质以0.5g/L～2g/L的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；(3)收集微藻细胞，与2～10mM硅酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。应用此方法实现了微藻在自然有氧条件下的可持续光产氢，克服微藻产氢持续时间短、效率低等问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程与技术领域，具体涉及一种培养微藻生产氢气的方法。
背景技术
氢气长久以来一直被人们认为是一种理想的有前途的石化能源替代物，因为它燃烧产物是水，对环境友好，并且能量效率高。当前，氢气的工业制备主要是来源于烃类化合物的蒸汽裂解和水的电解，但是这些氢气的制备方式是能源成本很高并且不可持续。氢气的绿色生产一直是一个挑战。光生物产氢被认为是一种理想的可持续的产氢途径。在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利用光合系统和氢酶将水光解为氢气和氧气(A.Hemschemeier,T.Happe.Alternative photosynthetic electron transportpathways during anaerobiosis in the green alga Chlamydomonas reinhardtii[J].Biochim.Biophys.Acta,2011,1807:919–926)。但是，这是一个短暂的过程，只发生在黑暗-光照交替的几分钟之内。因为与产氢密切相关的氢酶在氧气的氛围下会丧失催化功能。在黑暗的条件下，细胞呼吸创造厌氧环境激活氢酶，在黑暗进入光照的短暂时间内，光合系统II(PSII)产生的光合电子可以传递到氢酶上与氢质子结合生成氢气。但是光合作用产生的氧气又会使氢酶失活。因此，持续时间短和效率低限制了绿藻产氢的应用。
公开号为CN 104046651 A的专利文献公开了一种提高微藻产氢效率的方法，该方法首先将产氢微藻细胞在培养基中培养至指数生长期；然后收集该藻体细胞，将其转入包含有机物的微藻产氢培养基中，除氧、密封，在黑暗环境中继续培养一定时间，所述的有机物包括葡萄糖、果糖、乙酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、苹果酸、氨基酸中的至少一种，以及前述每种有机物的钠盐、钾盐中的至少一种；最后将该微藻细胞重新置于光照环境中诱导其分解水生产氢气。实验证实，该发明通过向微藻产氢培养基中添加有机物能够显著提高微藻的产氢效率。但是该发明方法存在操作繁琐的问题，比如产氢微藻的培养基为不含硫的培养基；需要通过惰性气体吹扫、真空抽滤、超声脱气、膜分离等除氧手段制造缺氧的环境；需要在黑暗环境中培养24小时以上诱导氢酶表达等。
为了改进和提高绿藻的生产氢气能力，筛选和寻找有耐氧氢酶的绿藻突变株，以及通过蛋白质工程和基因改造降低氢酶对氧气的敏感性，是目前看来最有前景的两条途径。但是目前发现的有耐氧氢酶的绿藻是极少的，并且还没有发现能够在光下可持续产氢的，而通过蛋白质工程和基因改造的办法前提是要解析氢酶的晶体结构，这本身就是一项极具挑战性的工作，目前进展也是很缓慢。有人尝试把某种光合细菌对应的氢酶基因导入到绿藻中，但效果并不明显。目前，在绿藻光产氢研究领域最普遍的手段是通过缺硫培养的方法，为绿藻细胞制造缺氧环境，诱导氢酶表达，实现生产氢气。但是这样一种代谢处理会抑制光合系统II的活性，并终止生产氢气(T.K.Antal,et al.The dependence of algalH2production on Photosystem II and O2consumption activities in sulfur-deprivedChlamydomonas reinhardtii cells[J].Biochim.Biophys.Acta,2003,1607:153–160)。迄今为止，还没有实现绿藻在自然有氧条件下的可持续光产氢。
发明内容
本发明提供了一种培养微藻生产氢气的方法，实现微藻在自然有氧条件下的可持续光产氢，克服微藻产氢持续时间短、效率低等问题。
为解决上述的技术问题，本发明提供了一种培养微藻生产氢气的方法，包括以下步骤：
(1)构建微藻的聚集体；
(2)将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。
微藻细胞形成一定尺寸的聚集体之后，由于微环境的改变，在空间上将出现功能的分化。在聚集体外层的细胞，依然可以进行光合作用放出氧气，而在聚集体内层的细胞，由于外层细胞阻挡了部分光照，使得内层细胞光合作用减弱，越在内层光合作用越弱，但是细胞的呼吸作用却不会因为光照的改变而有太多变化，因而当聚集体的尺寸达到一定大小时，在聚集体的内层细胞会达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，这时便可维持聚集体内层的厌氧环境，在厌氧环境中氢酶可以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件下，即可催化2H++2e-→H2反应的进行生成氢气(图1)。
优选的方案，所述的微藻为绿藻。在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利用光合系统和氢酶将水光解为氢气和氧气。目前研究较多的单细胞绿藻主要有纤维藻(Ankistrodesmus sp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonas sp.)、小球藻(Chlorella sp.)、栅藻(Scenedesmus sp.)和月牙藻(Selenastrum dibraianum)等。
更为优选的方案，微藻为蛋白核小球藻。在自然条件下，小球藻是单细胞分散的，直径大约在3～4微米。目前蛋白核小球藻已经商业化，在实际应用中更容易获得。
所述的微藻的聚集体的直径为50～150μm。当聚集体的尺寸达到一定大小时，维持聚集体内层的厌氧环境，氢酶得以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件下，产生氢气。
所述的培养基包括但不限于TAP培养基、SE培养基或BG11培养基等，本发明优选TAP培养基。TAP培养基提供蛋白核小球藻正常生长所需，在此培养条件下，蛋白核小球藻可维持正常的生长周期。
所述的光照条件为100μE·m-2·s-1～200μE·m-2·s-1的光照强度。
构建微藻聚集体的方法包括以下步骤：
(1)将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于1.2×108cells/mL；
(2)将带氨基的阳离子聚电解质以0.5g/L～2g/L的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；
(3)收集微藻细胞，与2～10mM硅酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。
培养至对数生长期得到性状稳定统一的微藻细胞，且微藻溶液中的微藻细胞要达到一定的数量才有利于下一步聚集体的形成。
由于微藻个体微小，且细胞表面多带负电荷，因而其个体在培养液中可以均匀地分散悬浮，形成稳定的分散体系。通过向微藻溶液中加入带有氨基阳离子聚电解质，使微藻细胞表面带有电荷和诱导硅酸矿化的活性位点。
硅酸溶液在氨基的催化作用下会发生聚合反应生成二氧化硅，聚硅酸是用中和法即由硅酸钠在加酸条件下水解、聚合反应到一定程度的中间产物。聚硅酸带负电荷，属阴离子型无机高分子物质，通过吸附架桥使微藻聚集。
优选的方案，步骤(2)中，所述的阳离子聚电解质为聚二甲基二烯丙基氯化铵，以1g/L的量加入微藻细胞溶液中。此浓度既能保证有足够多的阳离子聚电解质吸附到微藻细胞表面，又不会因浓度太高对微藻细胞产生生物毒性。
优选的方案，步骤(3)中，所述的硅酸溶液浓度为5mM。既能保证有足够二氧化硅形成使细胞聚集，又不至于发生均相的自聚。
优选的方案，步骤(3)中，所述的聚集时间为0.5～1h。
本发明达到的有益效果：通过本发明的技术方案用带氨基的阳离子聚电解质对微藻细胞表面改性，在硅酸溶液中聚集形成一定大小尺寸的微藻的聚集体，使得聚集体的内层细胞达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，在微藻培养体系中直接利用可见光生产氢气，制备工艺简单，产氢效率提高，有潜在应用价值。
附图说明
图1为小球藻聚集产氢示意图；
图2为自然状态的蛋白核小球藻与聚集的蛋白核小球藻对比图；
其中，(a)为自然状态的蛋白核小球藻的光学显微镜照片和扫描电镜照片，
(b)为小球藻聚集体的光学显微镜照片和扫描电镜照片，
(c)为自然状态的小球藻培养液加入三氧化钨粉末(试管底部)在100μE·m-2·s-1光照下照射12小时后的照片，
(d)为自然状态的小球藻和聚集的小球藻培养液都加入三氧化钨粉末的照片，
(e)为聚集的小球藻培养液都加入三氧化钨粉(试管底部)在100μE·m-2·s-1光照下照射12小时后的照片；
图3为自然状态的小球藻和聚集的小球藻在有氧条件下的生产氢气对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
选用已经商业化的蛋白核小球藻为实验对象。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)以1g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将5mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。以自然状态下的小球藻作为对照，分成2组。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时。
实验1.将自然状态下的蛋白核小球藻和聚集的蛋白核小球藻置于光学显微镜和扫描电镜下观察。
如图2(b)所示，蛋白核小球藻的聚集体的直径约100μm。
实验2.分别在自然状态下的蛋白核小球藻和聚集的蛋白核小球藻培养液中加入三氧化钨粉末，光照12小时后，观察三氧化钨指示剂的颜色变化。三氧化钨粉末是用来检测氢气的指示剂，氢气浓度为0时，显示淡黄绿色，当氢气浓度达到一定浓度时，会生成钨青铜呈兰灰色。
结果如图2(c)所示指示剂呈淡黄绿色，说明试管管中氢气为0，表明自然状态下的蛋白核小球藻不产氢；
如图2(d)所示指示剂呈现兰灰色，说明试管中存在氢气，表明聚集的蛋白核小球藻产氢。
实验3.分别于不同时间测定密封管顶空氢气的积累量和氧气含量。
结果如图3所示，自然状态下的蛋白核小球藻和聚集的蛋白核小球藻在光照的48小时内密封管里氧含量维持在19-21％；
在光照的48小时内自然状态下的蛋白核小球藻的密封管里氢气含量0；聚集的蛋白核小球藻的密封管中氢气含量随时间的延长呈线性增长，说明聚集的蛋白核小球藻在持续产氢。
实施例2
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以0.5g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将5mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
实施例3
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以1.5g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将5mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
实施例4
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以2g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将5mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
实施例5
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以1g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将2mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
实施例6
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以1g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将7mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
实施例7
所选藻种与实施例1中一致，为蛋白核小球藻。
将聚二甲基二烯丙基氯化铵以1g/L的量加入到对数生长期的小球藻细胞溶液中(细胞密度1.2×108cells/mL)进行表面改性，使其表面带上正电荷。然后离心清洗，再离心，最后将10mM的硅酸溶液与离心后的小球藻细胞迅速混合，并吹散，置于烧杯中搅拌30min。收集小球藻细胞，清洗并用TAP培养基重悬，然后分装到体积为60cm3密封管中，每管30mL藻液。在100μE·m-2·s-1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气的积累量。
表1：各组实施例产氢过程维持48小时的产氢量
| 实施例组 | PDADMAC浓度(g/L) | 硅酸浓度(mM) | 管中产氢量(μmol) |
| 1 | 1 | 5 | 22±1 |
| 2 | 0.5 | 5 | 15±2 |
| 3 | 1.5 | 5 | 16±1.5 |
| 4 | 2 | 5 | 10±1.2 |
| 5 | 1 | 2 | 6±0.8 |
| 6 | 1 | 7 | 20±1.6 |
| 7 | 1 | 10 | 18±2.1 |
由上表可知实施例1的技术方案制备得到的氢气量最大。
Claims (8)
1.一种培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建微藻的聚集体；
(2)将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气；
微藻的聚集体的直径为50～150μm；
构建微藻的聚集体的方法包括以下步骤：
(1)将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于1.2×108cells/mL；
(2)将带氨基的阳离子聚电解质以0.5g/L～2g/L的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；
(3)收集微藻细胞，与2～10mM硅酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。
2.如权利要求1所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，微藻为绿藻。
3.如权利要求2所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，微藻为蛋白核小球藻。
4.如权利要求1-3任一项所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，所述的培养基为TAP培养基。
5.如权利要求1-3任一项所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，所述的光照条件为100μE·m-2·s-1～200μE·m-2·s-1的光照强度。
6.如权利要求1-3任一项所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，构建微藻的聚集体的方法的步骤(2)中，所述阳离子聚电解质为聚二甲基二烯丙基氯化铵，以1g/L的量加入微藻细胞溶液中。
7.如权利要求1-3任一项所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，构建微藻的聚集体的方法的步骤(3)中，所述硅酸溶液的浓度为5mM。
8.如权利要求1-3任一项所述的培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，构建微藻的聚集体的方法的步骤(3)中，聚集的时间为0.5～1h。
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