CN113817780B - 一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法，属于生物能源技术领域，本发明是为了解决现有微藻制氢过程繁琐，成本较高，无法长时间产氢的问题，所述方法包括的步骤如下：1)蛋白核小球藻的培养，2)PNIPAM‑BA聚合物的合成，3)微藻聚集体的构筑与解聚。此方法解决了现有微藻制氢过程繁琐，成本较高，无法长时间产氢的问题，成功实现了微藻可长时间持续产氢168h，并且可以主动调控开始或终止微藻产氢过程。本发明工艺简单，可控性强，应用前景好。

Description

一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法
技术领域
本发明属于生物能源技术领域，具体涉及一种基于温度响应聚合物相转变调控微藻产氢的方法。
背景技术
随着化石能源的不断消耗以及环境污染问题的日趋严重，寻找可再生的、环境友好的能源已经成为研究学者的主要方向。氢气在燃烧时只生成水，不会产生任何污染物，并且具有能量密度高、热转化效率高、运送成本低等优点，被认为是化石燃料最理想的替代品。虽然制氢有化学方法、生物方法等很多方法，但是传统的化石燃料重整制氢及电解水制氢等技术，并没有从根本上摆脱掉对化石能源的依赖，也没有从根本上消除对环境的污染，生产成本也普遍较高。而生物产氢的条件较为温和，通常在常温常压下进行，能够利用可再生能源，并且可以进行废物利用，因此具有低能耗、少污染的特点，被认为是未来制氢的主要途径之一。
光合微生物法作为生物制氢的重要组成部分，已经成为近年来的研究热点。光合微生物法制氢，即微生物通过光合作用将底物分解产生氢气的方法，通常发生在细菌或藻类细胞内。对于常见的绿藻微生物而言，其光合系统中有两个独立但协调起作用的光合中心，即光合系统I和光合系统II。其中，光合系统II用于接收太阳能分解水产生质子、电子和氧气，PSI产生还原剂用于固定二氧化碳。PSII产生的电子，最终由铁氧还蛋白携带经由光合系统II和光合系统I到达氢化酶处，从而使质子在氢化酶的催化作用下产生氢气。然而，光合系统II产生的氧气会使氢化酶迅速失活，所以绿藻生物在通常情况下以光合放氧为主，并不会产生氢气。为了提高微藻的产氢量以及产氢时间，目前的方法有硫剥夺处理、基因工程筛选耐受氧气的氢化酶、创建捕光天线突变体、消除与氢化酶相竞争的电子转移途径以及通过微藻的表面修饰等等。硫剥夺处理主要是通过去除培养基中的硫元素，从而抑制光合系统的放氧活性，降低了光解水产生的氧气含量，但是该方法同时也抑制了光解水产生的电子产量，最终导致产氢效率低，产氢时间在80小时左右[MelisA,Zhang L,Forestier M,et al.Sustained Photobiological Hydrogen Gas Production uponReversible Inactivation of Oxygen Evolution in the Green AlgaChlamydomonasreinhardtii[J].Plant Physiology,2000,122(1):127–136.]。基因工程筛选耐受氧气的氢化酶、创建捕光天线突变体以及消除与氢化酶相竞争的电子转移途径等方法缺乏明确的工程理论指导，筛选目标种群步骤繁琐，工作量大，目前仍然进展有限[Batyrova K,Hallenbeck P C.Sustainability of Biohydrogen Production Using EngineeredAlgae as a Source[G]//Singh A,Rathore D.Biohydrogen Production:Sustainabilityof Current Technology and Future Perspective.New Delhi:Springer India,2017:163–180.]。而微藻的表面修饰只能对当代细胞起作用，无法对其后代子细胞起作用，并且成本高，无法实现大规模制氢。
在调控微藻制氢方面，目前有无硫培养基与含硫培养基的更换以及基因miR1166.1的多次诱导表达等方法。微藻在光照期间，光合系统II中的D1蛋白很容易受到光损伤，需要供应含硫氨基酸进行修复。但在无硫培养基中，微藻无法合成含有硫元素的氨基酸，无法修复，因此光系统II活性降低，微藻逐渐终止产氢。将微藻转移至含硫培养基中，D1蛋白得到修复，光系统II活性提升，当更换为无硫培养基时，微藻又开始产氢[Kruse O,Hankamer B.Microalgal hydrogen production[J].Current Opinion inBiotechnology,2010,21(3):238–243.]。此方法虽然简单，但在经济上是不可行的。基因miR1166.1的多次诱导表达实现调控微藻产氢的方法，涉及基因的鉴定，基因的构建表达和目标藻株的筛选等过程[Wang Y,Zhuang X,Chen M,et al.An endogenous microRNA(miRNA1166.1)can regulate photobio-H2 production in eukaryotic green algaChlamydomonas reinhardtii[J].Biotechnology for Biofuels,2018,11(1):126.]，极其复杂。
发明内容
本发明是为了解决现有微藻制氢过程繁琐，成本较高，无法长时间产氢的问题，提供一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法，解决上述问题的同时，还可以主动调控微藻开始或终止产氢过程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一、微藻的培养：将微藻藻种转移至含有1L的培养基中，在温度为25～30℃的光照培养箱中进行光照12h和黑暗12h循环，其中光照强度为2000～5000LUX，当微藻细胞数目达到对数生长期时取用；
步骤二、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯)(PNIPAM-BA)共聚物的合成：将3-5g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体、0.15-0.40g的丙烯酸丁酯(BA)以及10-25mg的偶氮二异丁腈溶液溶解在40-60mL的无水四氢呋喃中，在磁力搅拌作用下，向溶液中通入惰性气体除氧20-40min，除氧结束后，在50-70℃的温度下反应15-30h，冷却，向溶液中加入乙醚和石油醚，获得沉淀物PNIPAM-BA，过滤沉淀物PNIPAM-BA，真空干燥10-20h，得到干燥的PNIPAM-BA产物；
步骤三、微藻聚集体的构筑与解聚：取50-100mL步骤一得到的微藻溶液，离心(5000转/分钟)收集微藻，用培养基对收集的微藻进行清洗，再次离心收集，重复2-4次，将收集到的微藻分散在3-6mL培养基中，并加入100-200mg PNIPAM-BA溶解摇匀，并转移至密闭玻璃瓶中，将密闭玻璃瓶转移至光照强度为2000～5000LUX，温度为30℃的光照培养箱中持续光照，微藻形成微藻聚集体，开始产氢，将密闭玻璃瓶转移至光照强度为2000～5000LUX，温度为20℃的光照培养箱中持续光照，微藻聚集体解聚，停止产氢。
进一步地，所述的微藻为绿藻。在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利用光合系统和氢化酶将水光解为氧气和氢气。目前研究较多的单细胞绿藻主要有小球藻、纤维藻、莱茵衣藻、栅藻和月牙藻等。
进一步地，所述绿藻包括小球藻、纤维藻、莱茵衣藻、栅藻或月牙藻。目前蛋白核小球藻已经商业化，在实际实验研发中更容易获取。在自然条件下，蛋白核小球藻是分散的单细胞，直径大约在3-5微米。
进一步地，所述培养基包括但不限于BG-11培养基、SE培养基或TAP培养基等，本发明优选BG-11培养基。BG-11培养基提供蛋白核小球藻正常生长所需的元素，维持蛋白核小球藻正常的生长繁殖。最重要的是，BG-11培养基是一种无机培养基，不会协助蛋白核小球藻产氢。因此，在BG-11培养基中，更能体现出基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的优势。
本发明相对于现有技术的有益效果为：通过利用PNIPAM-BA相转变使单细胞微藻形成微藻聚集体，通过升高/降低环境温度，重构/破坏微藻聚集体以及厌氧微环境，实现了微藻可长时间持续可控产氢168h。本发明制备工艺简单，可控性强，应用前景好。
附图说明
图1为PNIPAM-BA的相转变温度曲线图；
图2为自然状态的蛋白核小球藻光学图片；
图3为形成微藻聚集的蛋白核小球藻光学图片；
图4为微藻聚集体与自然状态下微藻产氢随时间变化的曲线图；
图5为调控外界温度30℃或20℃控制微藻开始或停止产氢的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
PNIPAM的分子链结构中含有疏水的异丙基和亲水的酰胺基团，因此能够在32℃条件下发生体积相转。由于小球藻的适宜生长温度在20-30℃，因此需要修饰含有疏水性基团的BA单体去降低PNIPAM的相转变温度，获得的PNIPAM-BA相转变温度为25℃，如图1所示。当环境温度为20℃时，整个PNIPAM-BA分子链由亲水性的酰胺基团为主导，酰胺基团在分子间氢键的作用下，与水分子结合，表现出亲水性，溶液呈均一相，蛋白核小球藻均匀分散在溶液中。由于蛋白核小球藻的光合作用会产生氧气，氢化酶会失去活性，因此不会有氢气产生。当环境温度为30℃时，整个PNIPAM-BA分子链由疏水性的基团主导，酰胺基团与水分子间的氢键发生断裂，PNIPAM-BA分子链会携带溶液中的蛋白核小球藻一起收缩形成微藻聚集体。在形成微藻聚集体之后，外层微藻细胞会阻挡光照，使得内层微藻细胞光合作用减弱，越在内层光合作用越弱，但是微藻细胞的呼吸作用却不会因为光照的改变而有太多变化，因而当聚集体的尺寸达到一定大小时，在聚集体的内层微藻细胞会达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，这时便可维持聚集体内层的厌氧环境，在厌氧环境中氢酶可以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件下，即可催化水的光解生成氢气。由此，通过主动调控外界环境温度，可以实现调控微藻开始或终止产氢的过程。
实施例1：
一、蛋白核小球藻的培养。将蛋白核小球藻藻种转移至含有1L的BG-11培养基中，在温度为27～30℃的光照培养箱中进行光照12h和黑暗12h循环，其中光照强度为2800～4500LUX。当蛋白核小球藻细胞数目达到对数生长期时取用。
二、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯)(PNIPAM-BA)共聚物的合成。将4.5g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体、0.25g的丙烯酸丁酯(BA)以及20mg的偶氮二异丁腈溶液溶解在40-60mL的无水四氢呋喃中。在磁力搅拌作用下，向溶液中通入惰性气体除氧20-40min。除氧结束后，在60℃的温度下，反应24h，冷却。向溶液中加入乙醚和石油醚，获得沉淀物PNIPAM-BA。过滤沉淀物PNIPAM-BA，真空干燥10-20h，得到干燥的PNIPAM-BA产物。
将PNIPAM-BA溶解在BG-11溶液中，利用紫外分光光度计测定PNIPAM-BA的相转变温度，如图1所示，可以得知PNIPAM-BA聚合物的相转变温度为25℃。
三、取80-100mL蛋白核小球藻溶液，离心收集蛋白核小球藻。用BG-11培养基对收集的蛋白核小球藻进行清洗，再次离心收集，重复2-4次。将收集到的蛋白核小球藻分散在3-6mL的BG-11的培养基中，加入100-200mg PNIPAM-BA溶解摇匀，并转移至密闭玻璃瓶中，作为实验组。将密闭玻璃瓶转移至光照强度为3000～5000LUX，温度为30℃的光照培养箱中持续光照，微藻形成微藻聚集体，开始产氢。
四、取50-100mL蛋白核小球藻溶液，离心收集蛋白核小球藻。用BG-11培养基对收集的蛋白核小球藻进行清洗，再次离心收集，重复2-4次。将收集到的蛋白核小球藻分散在3-6mL的BG-11的培养基中，并转移至密闭玻璃瓶中，作为对照组。
将自然状态下的蛋白核小球藻和聚集的蛋白核小球藻置于光学显微镜下观察，如图2和3所示。在形成微藻聚集体后，蛋白核小球藻的局部浓度上升，远远超过自然状态下的蛋白核小球藻的浓度。利用氢气检测器持续监测微藻聚集体(实验组)以及自然状态下的蛋白核小球藻(对照组)不同时间段下的氢气量，如图4所示。在蛋白核小球藻形成微藻聚集体后，氢气产量远超过自然状态下的产氢量，这说明形成微藻聚集体有利于微藻产氢。
实施例2：
一、蛋白核小球藻的培养。将蛋白核小球藻藻种转移至含有1L的BG-11培养基中，在温度为25～28℃的光照培养箱中进行光照12h和黑暗12h循环，其中光照强度为2500～4000LUX。当蛋白核小球藻细胞数目达到对数生长期时取用。
二、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯)(PNIPAM-BA)共聚物的合成。将2g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体、0.3g的丙烯酸丁酯(BA)以及15mg的偶氮二异丁腈溶液溶解在40-60mL的无水四氢呋喃中。在磁力搅拌作用下，向溶液中通入惰性气体除氧20-40min。除氧结束后，在55℃的温度下，反应25-30h，冷却。向溶液中加入乙醚和石油醚，获得沉淀物PNIPAM-BA。过滤沉淀物PNIPAM-BA，真空干燥10-20h，得到干燥的PNIPAM-BA产物。
三、取50-100mL蛋白核小球藻溶液，离心收集蛋白核小球藻。用BG-11培养基对收集的蛋白核小球藻进行清洗，再次离心收集，重复2-4次。将收集到的蛋白核小球藻分散在3-6mL的BG-11的培养基中，并加入100-200mg PNIPAM-BA溶解摇匀,并转移至密闭玻璃瓶中。
四、将密闭玻璃瓶转移至光照强度为3000～5000LUX，温度为30℃的光照培养箱中光照12小时，微藻形成微藻聚集体。然后调低光照培养箱温度为20℃，其他条件不变，光照12小时，微藻聚集体解聚，停止产氢。以上过程循环4次，利用氢气检测器监测体系内不同时间段下的氢气量，如图5所示。在最初12小时，光照培养箱温度为30℃，微藻形成微藻聚集体，开始产氢；然后在12-24小时内，光照培养箱温度为20℃，微藻聚集体解聚，仅有少量氢气产生。在后续的温度调控循环中，仍然能够有效调控微藻开始或者终止产氢。

Claims (2)

1.一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
步骤一、微藻的培养：将微藻藻种转移至含有1L的培养基中，在温度为25～30℃的光照培养箱中进行光照12h和黑暗12h循环，其中光照强度为2000～5000LUX，当微藻细胞数目达到对数生长期时取用；所述的微藻为小球藻、纤维藻、莱茵衣藻、栅藻或月牙藻；
步骤二、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯)共聚物的合成：将3-5g的N-异丙基丙烯酰胺单体、0.15-0.40g的丙烯酸丁酯以及10-25mg的偶氮二异丁腈溶液溶解在40-60mL的无水四氢呋喃中，在磁力搅拌作用下，向溶液中通入惰性气体除氧20-40min，除氧结束后，在50-70℃的温度下反应15-30h，冷却，向溶液中加入乙醚和石油醚，获得沉淀物PNIPAM-BA，过滤沉淀物PNIPAM-BA，真空干燥10-20h，得到干燥的PNIPAM-BA产物；
步骤三、微藻聚集体的构筑与解聚：取50-100mL步骤一得到的微藻溶液，离心收集微藻，用培养基对收集的微藻进行清洗，再次离心收集，重复2-4次，将收集到的微藻分散在3-6mL培养基中，并加入100-200mg PNIPAM-BA溶解摇匀，并转移至密闭玻璃瓶中，将密闭玻璃瓶转移至光照强度为2000～5000LUX，温度为30℃的光照培养箱中持续光照，微藻形成微藻聚集体，开始产氢，将密闭玻璃瓶转移至光照强度为2000～5000LUX，温度为20℃的光照培养箱中持续光照，微藻聚集体解聚，停止产氢。
2.根据权利要求1所述的一种基于温敏聚合物相转变调控微藻产氢的方法，其特征在于：所述培养基包括BG-11培养基、SE培养基或TAP培养基。
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