CN113736829B - 一种简易的光生物学制氢体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种简易的光生物学制氢体系及其制备方法和应用,包括以下步骤:向在pH为6~8的微藻液体培养体系中加入絮凝剂,絮凝剂的用量为0.1g/L~100g/L之间,所述微藻液体培养体系为采用液体培养基培养,其中微藻浓度为OD750=0.3,所述微藻液体培养体系的体积为5ml;絮凝后的微藻液体培养体系中产生微藻细胞聚集体,在光照条件下能够实现光生物学制氢。本发明首次提出使用一种在近中性条件絮凝微藻的絮凝剂制备得到基于微藻细胞聚集体的光生物学制氢体系,解决了光生物学制氢体系制备成本高、流程复杂等问题,有望推动光生物学制氢的实际应用发展。
Description
技术领域
本发明涉及光生物学制氢领域,具体涉及一种简易的光生物学制氢体系及其制备方法以及应用。
背景技术
传统化石燃料的使用造成大量的温室气体排放,所导致的全球气候变化逐渐对生命系统的可持续发展造成危害。为此,实现碳中和已然成为世界各国共同的重要发展目标。氢气作为燃料使用不但热值高,并且所带来的副产物仅为水,而水又可以作为生产氢气的原料,因此氢气被视为是极有前景的化石燃料替代物。然而,目前市场商业化使用的氢气仍是通过天然气等传统化石能源所制备,依然伴随着大量的二氧化碳产生而难以实现净零碳排放。
光生物学制氢以地球上储备丰富的光能作为能量来源,以水作为生产原料,通过可再生的生物体作为催化剂实现氢气的制备,是一种全过程净零碳排放的氢气制备方法,因此愈发受到关注。然而,光生物学制氢中的生物催化剂需要厌氧环境才具备催化氢气生成活性,但是光生物学制氢所依赖的光合作用途径会不可避免地产生氧气,因此如何在光照条件下构建有效的厌氧环境是光生物学制氢的关键。目前用于光生物学制氢的厌氧环境形成方法主要有添加除氧物质,硫元素剥夺,以及形成微藻细胞聚集体。添加除氧物质成本较高,硫元素剥夺则需要通过离心来实现无硫培养基的更替,难以较低成本地大规模制备。基于微藻聚集体的光生物学制氢体系,其原理是在聚集体内部的微藻细胞缺乏光照,因此光合作用受到抑制而停止释放氧气,进而通过细胞自身呼吸作用消耗原有的氧气而形成可以制氢的局部厌氧环境。因此微藻聚集体可以在普通含硫培养基的条件下,无需添加任何除氧物质就能实现光生物学制氢,是一种成本较低的具有大规模应用潜力方案体系。但是现阶段微藻聚集体的制备需要对微藻细胞表面进行化学改性,需要预先通过离心分离收获微藻细胞,而大体积的离心过程通常费时费力,因此限制了其大规模应用。开发一种简易的基于微藻聚集体的光生物学制氢体系是实现其商业化应用的关键。
微藻絮凝是一种广泛地应用于大规模分离富集微藻的技术手段,其原理是通过絮凝剂的加入降低或者消除微藻表面的静电斥力,以及通过吸附架桥作用使微藻细胞相互靠近以形成絮体沉降。通过使用絮凝剂构建基于微藻聚集体的光生物学制氢体系,有望推动其低成本大规模应用发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种简易的光生物学制氢体系及其制备方法以及应用,从而解决现有技术中光生物学制氢体系制备成本高和操作流程繁琐的问题。
本发明提供如下技术方案:一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,包括以下步骤:
S1:向在pH为6~8的微藻液体培养体系中加入絮凝剂,絮凝剂的用量为0.1g/L~100g/L之间,所述微藻液体培养体系为采用液体培养基培养,其中微藻浓度为OD750=0.3,所述微藻液体培养体系的体积为5ml;
S2:絮凝后的微藻液体培养体系中产生微藻细胞聚集体,在光照条件下能够实现光生物学制氢。所述光生物学制氢体系中氧气和氢气的含量通过气相色谱仪监测。
步骤S1中限定了所述絮凝剂的用量为0.1g/L~100g/L之间。实际上,絮凝剂的用量可根据具体的微藻细胞浓度进行调整,只要能够确保体系能够产生明显的微藻细胞聚集体即可。应当知晓的是,微藻细胞聚集体是指微藻细胞相互粘连团聚形成的一种三维多细胞结构,当微藻细胞形成聚集体后,聚集体内部微藻细胞通过自身呼吸作用消耗氧气,从而形成光生物学制氢所需的厌氧环境。
优选地,所述絮凝剂使用量优选为1g/L~50g/L,絮凝pH条件优选为7~7.5。
进一步地,所述絮凝剂为阳离子醚化淀粉、壳聚糖、阳离子聚丙烯酰胺中的任意一种或至少两种的组合。但是应该理解的是,其它能够使微藻在近中性条件絮凝的絮凝剂同样可以用在本发明中。
进一步地,所述微藻为绿藻,包括莱茵衣藻、普通小球藻或蛋白核小球藻中的任意一种或至少两种的组合。但是应该理解的是,其它在厌氧环境下可以产生氢气并且能发生絮凝的微生物同样适用于本发明。
进一步地,所述S1步骤中的微藻液体培养体系中的微藻培养于液体培养基中,所述液体培养基为TAP培养基、SE培养基或BG11培养基中的任意一种。通常,该培养基pH被调节在6~8的范围内并始终维持在pH 6~8,以确保微藻具备制氢的催化活性。因为微藻催化制氢首先需要厌氧环境,然后还需要适合的pH才能维持制氢的催化活性。
进一步地,所述S2步骤中的微藻聚集体是在原有所述微藻液体培养体系中直接生成的,无需分离富集以及其它额外处理步骤。例如,不需要通过离心收集微藻聚集体即可以实现光生物学制氢。因为根据本发明步骤S1所提供的絮凝剂,可以使微藻细胞在液体培养体系中高效絮凝而直接产生显著的微藻聚集体,因此可以简单有效地形成能够制氢的局部厌氧环境,这对于大规模制氢体系具有显著的优越性,既减少了操作步骤,降低了生产要求,同时降低了生产成本。
进一步地,所述步骤S2中得到的述微藻聚集体的尺寸为50~1000μm。
进一步地,所述步骤S2中的光照条件为1000~10000Lux的光照度。
本发明还提供一种根据上述制备方法制得的光生物学制氢体系。
本发明还提供一种根据上述的光生物学制氢体系在新能源开发中的应用。
本发明的有益效果为:
1、本发明提供的方法首次提出使用一种在近中性条件絮凝微藻的絮凝剂,在微藻液体培养体系中直接产生微藻细胞聚集体,实现了一种极其简易的光生物学制氢体系的构建。通过本发明的实验结果证明,该光生物学制氢体系可以在总体有氧条件下持续制氢4天以上。很好地解决了常见的光生物学制氢体系制备成本高和操作流程繁琐的问题。
2、本发明提供的一种简易的光生物学制氢体系,解决了常见的光生物学制氢体系制备成本高和操作流程繁琐的难题。根据本发明所制备的光生物学制氢体系中,微藻在近中性pH环境(pH6~8)絮凝形成微藻聚集体,结果实现了连续4天的光生物学制氢。此发明有望推动光生物学制氢的低成本大规模实际应用发展。
附图说明
在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。其中:
图1为本发明提供的方法中絮凝剂诱导游离分散的微藻细胞形成微藻聚集体而实现光生物学制氢的原理;
图2为本发明实验例1中阳离子醚化淀粉的光学显微镜观察结果图;
图3为本发明实验例1中蛋白核小球藻的光学显微镜观察结果图;
图4为本发明实验例2中的蛋白核小球藻、阳离子醚化淀粉以及二者混合物的Zeta电位示意图;
图5为本发明实验例3中阳离子醚化淀粉对蛋白核小球藻的絮凝效率结果统计图;
图6为本发明实验例4中根据本发明实施例1的制备方法得到的蛋白核小球藻聚集体的光学显微镜的观察结果图;
图7为本发明实验例4中根据本发明实施例1的制备方法得到的蛋白核小球藻聚集体的尺寸大小分布统计结果图;
图8为本发明实验例5中根据本发明实施例1的得到的光生物学制氢体系中,随时间累积的氢气产量结果统计图;
图9为本发明实验例5中根据本发明实施例1的制备方法得到的光生物学制氢体系中,随时间变化的氧气浓度变化结果统计图;
图10为本发明实验例6中根据本发明实施例1的制备方法得到的光生物学制氢体系中,蛋白核小球藻叶绿素含量分析结果统计图;
图11为本发明实验例7中根据本发明实施例1的制备方法得到的光生物学制氢体系中pH测定结果统计图;
图12为本发明实验例7中根据本发明实施例1的制备方法得到的光生物学制氢体系中,加入阳离子醚化淀粉絮凝后的蛋白核小球藻的细胞活性分析结果统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种简单易得的光生物学制氢体系制备方法,应当理解的是,此处仅作为举例而非限制,在本实施例中选择的絮凝剂,微藻,以及液体培养基分别为阳离子醚化淀粉,蛋白核小球藻,以及TAP培养基,首先使用TAP培养基培养蛋白核小球藻至对数期生长期,然后往对数期生长的蛋白核小球藻液体培养体系中加入阳离子醚化淀粉,使其在近中性pH(pH为6~8)条件下絮凝并产生具有蛋白核小球藻聚集体的微藻液体培养体系,其中微藻浓度为OD750=0.3,微藻液体培养体系的体积为5ml接着在光照条件下使用气相色谱仪监测培养体系中氧气和氢气的含量,以下实施例具体说明本发明的实施效果。使用气相色谱仪监测所述光生物学制氢体系中氧气和氢气含量的变化情况。但是应当理解的是,根据本发明提供的光生物学制氢体系还适用于远远超过10mL的更大规模,只要原料足够,规模不受限制。
其中,所使用的气相色谱仪是安捷伦8860型气相色谱仪(美国安捷伦科技),配备了TCD检测器能够同时分析氧气和氢气含量,载气为高纯氮气,流速为3~30mL/min。
其中,阳离子醚化淀粉(取代度:0.025~0.03,粘度:460~1200,斑点≤0.5)购自安徽酷尔生物工程有限公司;细胞活性分析试剂盒(HR0489)以及叶绿素含量分析试剂盒(GL3175)购自于北京百奥莱博科技有限公司;蛋白核小球藻(GY-D12)以及TAP培养基购自上海光语生物科技有限公司。
本发明的工作原理在于,基于微藻细胞聚集体光生物学制氢的优势,通过加入一种絮凝剂,使得微藻液体悬浮培养体系在近中性pH条件下絮凝并产生显著的微藻细胞聚集体。因为微藻细胞表面带有负电荷,由于同种电荷互相排斥,微藻细胞在液体培养条件下难以互相靠近因而分散在培养体系中。絮凝剂通常带有正电荷,能够降低或者消除微藻表面的静电斥力,从而使得微藻细胞能够靠近形成聚集体,此外阳离子醚化淀粉或者阳离子聚丙烯酰胺等高分子絮凝剂还具备吸附架桥作用,能够促进微藻细胞的相互靠近能更为有效地使形成微藻细胞聚集体。其中,形成微藻聚集体的目的在于在微藻聚集体内部产生厌氧环境从而激活微藻制氢的催化活性。微藻制氢依赖细胞内氢酶或者固氮酶,氢酶和固氮酶均需要厌氧环境才具备催化活性。游离分散的微藻细胞进行正常的光合作用释放大量的氧气,因此氢酶或固氮酶处于失活状态。分散的微藻细胞形成聚集体后,聚集体内部的微藻细胞缺乏光照而光合作用受到抑制,因而不能释放氧气,而细胞的呼吸作用不受光照影响依然能够正常进行,因此聚集体内部细胞通过呼吸作用可以消耗原有的氧气而形成厌氧环境,从而能够激活氢酶或者固氮酶活性,进而实现基于微藻聚集体的光生物学制氢体系的构建,如图1所示;因为氢酶和固氮酶制氢活性除了需要厌氧环境还需要近中性pH条件,所以需要选用近中性条件下絮凝的絮凝剂,否则形成微藻细胞聚集体也不能有效制氢。建立基于聚集体的光生物学制氢体系后,使用气相色谱仪监测光生物学制氢体系中氧气和氢气的含量。
实验例1
对实施例1制备得到的光生物学制氢体系,使用光学显微镜观察分析阳离子醚化淀粉以及蛋白核小球藻的形状大小;阳离子醚化淀粉的光学显微镜观察结果如图2所示(图中标尺为30μm),阳离子醚化淀粉在TAP培养基中分散均匀,直径大小约为18μm,蛋白核小球藻的光学显微镜观察结果如图3所示(图中标尺为30μm),蛋白核小球藻在TAP培养基中分散均匀,直径大小约为5μm;
实验例2
对实施例1制备得到的光生物学制氢体系,使用Zeta电位测试仪分别分析蛋白核小球藻,阳离子醚化淀粉,以及蛋白核小球藻混合阳离子醚化淀粉后的Zeta电位;
结果如图4,蛋白核小球藻的Zeta电位约为负20毫伏,阳离子醚化淀粉的Zeta电位约为正25毫伏,二者混合后的Zeta电位约为正5毫伏,说明阳离子醚化淀粉能够有效降低甚至消除蛋白核小球藻表面的负电荷。
实验例3
对实施例1制备得到的光生物学制氢体系,进行阳离子醚化淀粉对蛋白核小球藻的絮凝效率分析,取5mL对数期生长的(OD750=0.3)蛋白核小球藻置于容积为8.5mL的透明玻璃试管中,然后再加入50mg的阳离子醚化淀粉,密闭试管后在25℃,6300lux光照条件下培养,定时间点(2小时,4小时,6小时,12小时,24小时)使用微板读数仪分析培养上清液的750nm处的光吸收值,然后根据以下公式计算得到阳离子醚化淀粉对蛋白核小球藻的絮凝效率:
絮凝效率(%)=(ODo-ODn)/ODo×100;
其中,ODo为在加入阳离子醚化淀粉前的蛋白核小球藻培养液的的750nm处的光吸收值;
ODn为第n小时的培养上清夜的750nm处光吸收值。结果如图5所示,在加入阳离子醚化淀粉后4小时,蛋白核小球藻的絮凝效率就超过80%,且在此之后,蛋白核小球藻培养体系一直保持在高絮凝效率状态。
实验例4
对实施例1制备得到的光生物学制氢体系,采用光学显微镜观察分析阳离子醚化淀粉絮凝蛋白核小球藻产生的细胞聚集体,以及聚集体尺寸大小分布统计分析;
结果如图6(图中标尺为100μm)所示,在阳离子醚化淀粉絮凝蛋白核小球藻后,原培养体系中产生显著的蛋白核小球藻聚集体,并且如图7所示,聚集体尺寸大小集中分布在300μm左右,最大尺寸直径超过800μm。
实验例5
取5mL对数期生长的(OD750=0.3)蛋白核小球藻置于容积为8.5mL的透明玻璃试管中,然后再加入50mg的阳离子醚化淀粉,密闭试管后在25℃,6300lux光照条件下培养,定时间点(24小时,48小时,72小时,96小时)使用气密针抽取100μL试管顶空气体,注入气相色谱仪进样口,用于分析培养体系中氢气和氧气的含量,检测条件:TCD检测器200℃,柱温箱100℃,载气流速3mL/min。
结果如图8所示,根据本发明的制备方法所得到的光生物学制氢体系持续制氢时间长达96小时(4天),并且可以从图9(其中,圆形曲线表示加入阳离子醚化淀粉絮凝后的蛋白核小球藻培养体系,即实验组中顶空气体的氧气浓度,方形曲线表示游离分散的蛋白核小球藻培养体系,及对照组中顶空气体的氧气浓度)中发现在能够制氢的培养体系中的氧气含量持续下降,说明蛋白核小球藻絮凝产生聚集体后能降低体系氧气浓度。
实验例6
将实验例5反应96小时的蛋白核小球藻培养物进行叶绿素含量分析,在充分摇匀培养物后,加入等体积(5mL)的叶绿素含量分析液,于室温下避光震荡孵育4小时,接着使用离心机在1万转的转速下离心15分钟,取滤液,即叶绿素粗体物,用微板读数仪测定样品在665nm(A665)和649nm(A649)两处的光吸收值。根据以下公式:
总叶绿素含量(mg)=CT×N×V;
CT=6.63×A665+18.08×A649;
N=稀释倍数;
V=样品体系(L);
得到蛋白核小球藻总叶绿素含量结果;
结果如图10,图中,左边为游离分散的蛋白核小球藻,即对照组的叶绿素含量,右边为加入阳离子醚化淀粉絮凝后的蛋白核小球藻叶绿素含量,实验组叶绿素含量低于对照组,及加入阳离子醚化淀粉絮凝后的蛋白核小球藻叶绿素含量低于游离分散的蛋白核小球藻,说明蛋白核小球藻絮凝形成聚集体后叶绿素的生物合成受到了一定抑制,这也从侧面佐证了蛋白核小球藻在形成聚集体之后,聚集体内部的藻细胞光照明显缺乏,从而影响了叶绿素的生物合成;
实验例7
取5mL对数期生长的(OD750=0.3)蛋白核小球藻置于容积为8.5mL的透明玻璃试管中,加入50mg的阳离子醚化淀粉后,在25℃,6300lux光照条件下培养,定时间点摇匀培养物,接着使用pH计测试培养物的pH,以及取200μL上摇匀的培养物加入20μL细胞活性分析试剂液,然后于室温避光振荡孵育4小时,随后使用离心机在1万转的转速下离心15分钟,取滤液用微板读数仪测定样品在490nm(OD490)处的光吸收值,然后以下计算公式:
细胞活性(%)=(OD490e-OD490b)/(OD490c-OD490b)×100;
OD490e为实验组,即加入阳离子醚化淀粉絮凝的蛋白核小球藻经细胞活性分析试剂液处理后的样品在490nm处的光吸收;
OD490c为对照组,即自然游离分散的蛋白核小球藻经细胞活性分析试剂液处理后的样品在490nm处的光吸收;
OD490b为空白TAP培养液经细胞活性分析试剂液处理后的样品在490nm处的光吸收;
得到培养体系中蛋白核小球藻的细胞活性;
结果如图11所示,加入阳离子醚化淀粉絮凝后的蛋白核小球藻培养体系的pH低于自然游离分散的蛋白核小球藻培养体系,但总体维持在近中性的pH范围;而至于细胞活性,如图12所示,阳离子醚化淀粉的加入也会在一定程度上降低蛋白核小球藻的细胞活性,但是影响并不显著,在96小时后,加入阳离子醚化淀粉絮凝的蛋白核小球藻细胞活性仍然相对保持在65%以上。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外,本领域的技术人员能够理解,尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征,但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如,在上面的权利要求书中,所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (6)
1.一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:向在pH为6~8的微藻液体培养体系中加入絮凝剂,絮凝剂的用量为0.1 g/L~100g/L之间,所述微藻液体培养体系为采用液体培养基培养,其中微藻浓度为OD750=0.3,所述微藻液体培养体系的体积为5ml;
S2:絮凝后的微藻液体培养体系中产生微藻细胞聚集体,在光照条件下能够实现光生物学制氢;所述微藻细胞聚集体是指微藻细胞相互粘连团聚形成的一种三维多细胞结构;
所述絮凝剂为阳离子醚化淀粉;所述微藻为绿藻;所述步骤S2中得到的述微藻聚集体的尺寸为50~1000 μm。
2.根据权利要求1所述的一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,其特征在于,所述绿藻包括莱茵衣藻、普通小球藻或蛋白核小球藻中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,其特征在于,所述S1步骤中的微藻液体培养体系中的微藻培养于液体培养基为TAP培养基、SE培养基或BG11培养基中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,其特征在于,所述S2步骤中的微藻聚集体是在原有所述微藻液体培养体系中直接生成的,无需分离富集以及其它额外处理步骤。
5.根据权利要求1所述的一种简易的光生物学制氢体系的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的光照条件为1000~10000 Lux的光照度。
6.一种根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制得的光生物学制氢体系。
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