CN104962509B - 一种提高乳杆菌耐酸能力的方法及其乳杆菌饮料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高乳杆菌耐酸能力的方法及其乳杆菌饮料，提高乳杆菌耐酸能力的方法是在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌耐酸能力，包括，乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h；离心，获得的菌体，进行酸耐受实验。本发明通过对乳杆菌在含NaCl的培养基中培养，提高了其对酸耐受的能力，为了解盐应激及其产生的协同保护在乳酸菌益生功能中发挥的作用提供了依据。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高乳杆菌耐酸能力的方法及其乳杆菌饮料。
背景技术
乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是人类应用最早的细菌之一，早在公元前3世纪，我们的祖先就用它来制作泡菜和腌菜，长期以来，这些细菌一直用于食品和饮料的加工制作。乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌中的一种，乳杆菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。
益生乳酸菌能够在各种不利环境下存活是其发挥益生功能的先决条件。人和动物的消化道是抵御外来致病菌感染机体的自然屏障，益生乳杆菌这类对人体有益的微生物同样要面对这一自然屏障的考验。在食品工业生产过程中益生菌会遇到酸性环境，如在乳制品发酵过程中，乳酸的产生降低了食品的pH值。此外，当益生菌被食用后进入胃，胃酸的产生使胃中的pH值极低，这也是益生菌要面对的酸性环境。胃液的pH最低可达1.5，在进食后pH可上升至6或更高，但一般维持在2.5～3.5之间，通常食物在胃内停留时间为2～4h。胃液有强酸性，在酸性条件下，质子在细胞内部积累，这就影响了跨膜质子梯度，形成膜电势差，这一电势差会形成被动的动力，使得另外一些离子顺着电位差移动来平衡两侧的电位，这个动力被称作质子驱动力。细胞内酸化会降低酸敏感的酶的活性、导致蛋白及DNA受损，因此耐酸是益生菌重要且必须具备的特性之一。大量的研究表明，外界环境胁迫，如在生产、储藏以及运输过程中的热胁迫、酸胁迫、渗透压胁迫和冷胁迫等，可诱导乳酸菌产生应激反应，从而提高其对另外一种或几种不利环境的耐受能力。此外，乳酸菌在其自然生境及发酵过程中及食品保藏过程中会遇到高浓度的盐，如分离自泡菜的植物乳杆菌ST-III(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)，其具有清除胆固醇，酸耐受能力强等的益生特性，并可以在高盐(NaCl浓度大于4％)MRS培养基中生长。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有提高乳杆菌耐酸能力的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种提高乳杆菌耐酸能力的方法，通过菌体在含有NaCl的培养基中培养能够显著提高乳杆菌的酸耐受能力。
为解决上述技术问题，本发明是提供如下技术方案：一种提高乳杆菌耐酸能力的方法，其是在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌耐酸能力，包括，乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h；离心，获得的菌体，进行酸耐受实验。
作为本发明所述的提高乳杆菌耐酸能力的方法的一种优选方案，其中：乳杆菌在含NaCl培养基中培养，所述含NaCl培养基浓度为1％～11％NaCl。
作为本发明所述的提高乳杆菌耐酸能力的方法的一种优选方案，其中：所述离心，其速度为4500rpm。
作为本发明所述的提高乳杆菌耐酸能力的方法的一种优选方案，其中：所述进行酸耐受实验中，酸耐受的pH值为1.5，耐受时间为2h。
本发明另一个目的是提供一种富含耐酸能力强的乳杆菌饮料。
根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种乳杆菌饮料，其包括，打浆：将酸果蔓打浆10～20min，并过滤得到酸果蔓液；发酵：将液化后的酸果蔓液按酸果蔓液体积的2～5％接种如权利要求1～3任一所述的提高乳杆菌耐酸能力的方法后得到的乳杆菌，在35～40℃恒温下，发酵10～20h，当pH为4.0以下时发酵结束，过滤，制得酸果蔓汁发酵液；调配：按酸果蔓汁发酵液质量百分比的3～4％加入糖；均质：将调配后的酸果蔓过滤液于30～40MPa下均质、脱气、分装。
作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述发酵中乳杆菌的接种量为按酸果蔓液体积的3％。
本发明通过对乳杆菌在含NaCl的培养基中培养，提高了其对酸耐受的能力，为了解盐应激及其产生的协同保护在乳酸菌益生功能中发挥的作用提供了依据。且本发明制备的乳酸菌发酵液被直接食用后，经过胃部低酸环境后，最终在肠道中的活菌数高于未在含有NaCl培养基中培养的乳酸菌，能达到更佳的保健效果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1菌种的培养
1、将乳杆菌在De Man，Rogosa and Sharpe medium(MRS)固体平板上划线，37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h；
2、上述培养液以2％接种量接种到含有2％NaCl、4％NaCl、6％NaCl、8％NaCl、10％NaCl不含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h。
实施例2盐应激对乳杆菌耐酸的影响
1、酸耐受
(1)收集在含NaCl(2％NaCl、4％NaCl、6％NaCl、8％NaCl、10％NaCl)及不含有NaCl的培养基中生长的菌体；
(2)用与培养时相同NaCl浓度的盐水(在无盐条件下培养的菌体用生理盐水)重悬菌体，调节菌体浓度为108～109cfu/mL；
(3)取1mL上述菌悬液，4500rpm，离心5min；
(4)加入1mL pH为1.5的MRS培养基重悬菌体，孵育2h；
2、酸耐受后菌体存活率计数
(1)对酸耐受前的菌体进行菌落计数：用生理盐水进行梯度稀释后取1mL10-6，10-7，10-8稀释度的菌液于无菌培养皿中，MRS培养基浇注平板；
(2)将1中所述菌液用生理盐水进行梯度稀释，取1mL 10-4，10-5，10-6稀释度的菌液于无菌培养皿中，MRS培养基浇注平板；
(3)37℃厌氧倒置培养48h后，菌落计数。
表1植物乳杆菌TH103酸耐受存活率
*：-代表存活为0；不同的字母代表差异显著(p≤0.05)。
由上表可知，于含有NaCl的培养基中培养的菌体在pH为1.5的MRS培养基中孵育2h后其存活率明显高于在不含NaCl的培养基中培养的菌体，且随着NaCl浓度的增加酸耐受能力也随之提高，当NaCl浓度为8％时与NaCl浓度为10％时的存活率没有显著差异，说明在8％NaCl时乳杆菌酸耐受能力达到最高。
实施例3、酸果蔓乳杆菌饮料的制备
选取新鲜和无病虫害的酸果蔓50kg，经流水清洗3遍，打浆20min，并经200目不锈钢网筛过滤。将酸果蔓液泵入无菌发酵罐中，按酸果蔓液体积的3％接种已经提高耐酸能力的乳杆菌，然后，在38℃下恒温发酵，初期采用功率1000w，频率20kHz的低频超声辅助发酵累计时间2h，随后停止超声继续发酵10h，当pH为4.0时发酵结束，过滤，制得酸果蔓汁发酵液。按发酵滤液重量百分比的3％加入白砂糖，搅拌均匀后，于均质机40MPa下均质2次，脱气，分装，即得酸果蔓发酵饮料。
实验采用单因素试验设计，选用20只体重相近的6周龄BABC/L雄性小鼠，随机分为2组，对照组饲喂基础饲粮，每天灌胃1mL未经耐酸能力提高的酸果蔓乳杆菌饮料(发酵时间长达80h～100h)；实验组饲喂基础饲粮，每天灌胃1mL富含耐酸能力的酸果蔓乳杆菌饮料。实验组每天每组3个重复，每个重复3只小鼠，饲喂1个月后处死小鼠，解剖，取盲肠，手术线将两端扎紧，立即送入实验室进行大肠杆菌及乳杆菌数量测定。用1g肠道内容物中细菌数量的对数表示，即log cfu/g。
表2富含耐酸能力的酸果蔓乳杆菌饮料对小鼠肠道菌群数量的影响
*：同列不同的字母代表差异显著(p≤0.05)。
产品实验测定：
所得产品感官正常，各理化及卫生指标如下：乳杆菌活菌数≥9.1×106cfu/mL，苯甲酸＜0.02g/kg，霉菌＜21cfu/mL，酵母菌＜17cfu/mL，大肠菌群及致病菌未检出。
由此可见，通过对乳杆菌在含NaCl的培养基中培养，提高了乳杆菌耐酸能力，实验重复性好，为提高乳杆菌耐酸的能力提供了一种新方法。同时，提高耐酸能力后的乳杆菌，其发酵时间大大缩短，且其存活率大大提升；本发明制备的乳酸菌发酵液被直接食用后，经过胃部低酸环境影响而最终在肠道发挥益生菌作用的活菌数比一般未在含有NaCl培养基中培养的乳酸菌多，达到的保健效果更佳。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种乳杆菌饮料，其特征在于：所述乳杆菌饮料由以下方法制备，
在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌耐酸能力，包括，
乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；
将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h，所述含NaCl培养基浓度为4％～10％NaCl；
离心，获得的菌体，进行酸耐受实验，所述进行酸耐受实验中，酸耐受的pH值为1.5，耐受时间为2h；打浆：将酸果蔓打浆10～20min，并过滤得到酸果蔓液；
发酵：将液化后的酸果蔓液按酸果蔓液体积的2～5％接种提高乳杆菌耐酸能力的方法后得到的乳杆菌，在35～40℃恒温下，发酵10～20h，当pH为4.0以下时发酵结束，过滤，制得酸果蔓汁发酵液；
调配：按酸果蔓汁发酵液质量百分比的3～4％加入糖；
均质：将调配后的酸果蔓过滤液于30～40MPa下均质、脱气、分装。
2.根据权利要求1所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述发酵中乳杆菌的接种量为按酸果蔓液体积的3％。
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