CN104958335A - 人参在制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人参及人参提取物的新用途,即人参及人参提取物在制备治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途,特别是人参提取物中人参皂苷Rd含量不低于50%的药物制剂在制备治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及人参的新用途,特别是人参提取物的新用途,即在制备预防和/或治疗抗小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途。
背景技术
小胶质细胞(microglia)的异常激活在多发性硬化等疾病中都发挥重要作用,是上述疾病病理发展过程中造成神经损伤的主要病因之一。在病理状态下,微环境的微小变化即可激活小胶质细胞,激活的小胶质细胞可以上调许多神经毒性因子的分泌水平,如一氧化氮(NO)、活性氧簇(ROS)和类花生酸类(如前列腺素E2)等,从而导致继发性脑损害。因此,抑制小胶质细胞的过度活化,可以有效防治、多发性硬化等疾病。
人参主要成分包括30余种人参皂甙、少量挥发油、有机酸及酯类等。其中人参皂甙可以分为三组,即齐墩果酸组、原人参二醇组和原人参三醇组,分别称为人参皂甙(Ginsenoside)-RX(注:X=0、a1、a2、a3、b1、b2、b3、c、d、e、f、g1、g2、g3、h1、h2、h3、s1、s2),尚有假人参皂甙(Pseudoginsenoside saponin)F11等。皂甙为人参生理活性的物质基础。原人参二醇(Protopanaxadiol)和原人参三醇(Protopanaxatriol)是人参皂甙中的原存在形式,在分离甙元时,由于稀酸的作用,分子侧链部分的羟基和烯键环合而成人参二醇(Panaxadiol)和人参三醇(Panaxatriol),人参二醇和人参三醇均是三萜类化合物。
人参具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津止渴,安神益智的功效。主治:劳伤虚损、食少、倦怠、反胃吐食、大便滑泄、虚咳喘促、自汗暴脱、惊悸、健忘、眩晕头痛、阳痿、尿频、消渴、妇女崩漏、小儿慢惊及久虚不复,一切气血津液不足之症。
已知人参具有以下功效:能调节中枢神经系统兴奋过程和抑制过程的平衡、提高机体的适应性、对多种动物的心脏均有先兴奋后抑制、对心肌有保护作用、在正常或高血压状态下人参有降低血压的作用、对骨髓的造血功能有保护和刺激作用、具有抑制血小板聚集的作用、抗休克作用、能增加肝脏代谢各物质的酶活性,使肝脏的解毒能力增强、有降血糖作用,可用于糖尿病的治疗。
人参临床使用主要以全成分制备成制剂。但其单体成分人参特别是人参皂甙Rb2能改善血脂,降低血中胆固醇、甘油三酯、升高血清高密度脂蛋白胆固醇,降低动脉硬化指数,对于高脂血症、血栓症和动脉硬化有治疗价值。
人参中的人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg3和人参皂苷Rg5都有一定的抗肿瘤活性。人参皂苷Rh2是人参中抗肿瘤功效最好的成分。
人参皂苷Rg1对蛋白质或脂质的生物合成作用与对DNA的生物合成的作用有大致相同倾向,能减少酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩,对大鼠有减慢心率和双向性血压作用(先升后降),有舒张动物血管和抗疲劳作用。
人参皂苷Re能抑制中枢神经,促进DNA,RNA合成;具有升高血浆皮质酮的作用,扩张血管;能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩;对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用;对猫的行为和脑电图显示中等的抑制;有抗疲劳作用。
人参皂苷Rb1对中枢神经系统、心血管系统、消化系统、免疫系统、内分泌系统、泌尿生殖系统有广泛的作用,从而可提高人体力、智力的活动能力,增强机体对有害刺激的非特异性抵抗力。
人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd,分子量:947.12,分子式:C48H82O18,CAS号:52705-93-8)。从五加科植物人参[Panax ginseng C.A.Mey er(P.schinseng Nees)]或三七[Panax Notoginseng(Burk.)F.H.Chen]等的根、花蕾、叶、芦头、茎或葫芦科(Cucurbifaceae)绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak.]的叶中提取得到,以三七含量最为丰富。人参皂苷Rd易溶于水、甲醇、乙醇,不溶于乙醚、苯。文献报道,人参皂苷Rd具有防治中风(药学学报,2005,40(12):1144-1146)、血栓形成(中国药理学通报,2005,11:1400-1401)等心脑血管疾病的作用。
但目前没有文献报道人参或人参提取物可抑制小胶质细胞相关的免疫毒性,亦没有报道公开人参或人参提取物能防治肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等疾病。
发明内容
本发明的目的是提供人参在制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途;
本发明的另一目的是提供人参提取物在制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途;
本发明的另一目的是提供用于制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的人参提取物的制备方法。
本发明的目的是通过下列的技术方案实现的:
本发明原料来源:人参为五加科植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。
发明人在研究小胶质细胞介导疾病的治疗过程中发现,人参及人参提取物能减少活化小胶质细胞NO等细胞毒性炎症介质的产生,抑制小胶质细胞激活诱导细胞死亡,从而为人参及人参提取物应用于活化小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的脑部炎症相关疾病,如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等疾病的防治提供了直接有力的实验依据和理论基础,既有很强的科学性和创新性,又有很高的开发应用价值。
因此,本发明所述小胶质细胞介导疾病包括多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病痴呆症、疯牛病。
本发明采用独特提取、纯化工艺所得人参提取物,控制提取物中人参皂苷Rd含量不低于50%,用此人参提取物制备的药物,预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病效果更显著。
本发明药物临床应用时,服用量最佳治疗效果为每日剂量以人参皂苷Rd计为1~100mg/kg体重。
本发明还提供人参提取物与医药学上可接受的载体配合制成在制备治疗和/或预防小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途。人参提取物配合医药学上可接受的载体和药用辅料按照药学领域常规方法制备为口服、注射或粘膜给药,可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂等剂型。
本发明专利临床应用的安全性较高,在治疗小胶质细胞介导疾病的药物治疗中不失为一种好药,其拓宽了治疗小胶质细胞介导疾病的新方法,同时为患者解决了现有技术治疗小胶质细胞介导疾病时出现的不良反应。
因此,申请人提供人参及人参提取物制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途。特别是人参醇提物制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途。
本发明还公开了预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物所用人参提取物的制备方法,包括以下步骤:
1)取人参药材加水或体积百分比浓度为25~96%的乙醇提取,将提取液回收乙醇,得人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加体积百分比浓度为95.0%以上的乙醇溶解,滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得。
优选地,步骤1)中所得人参提取液含固形物5-25%。
优选地,步骤2)经D型大孔树脂纯化时,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以70~95%乙醇液洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒。
优选地,步骤3)滤去不溶物是采用1~50μm滤膜过滤。
优选地,步骤3)经单分散聚合硅胶层析柱吸附后,洗脱纯化时用水:体积百分比浓度为95.0%~99.9%的乙醇液按梯度洗脱法洗脱纯化。
优选地,紫外检测器在线检测采用的检测波长为203nm。
本发明提供的人参、人参提取物制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途具有以下优点:
1、本发明所用人参及人参提取物为天然中药,安全无毒,可长期服用。在“人参提取物对小胶质细胞细胞活力的影响”实验中发现:人参提取物对小胶质细胞活力无抑制作用,不会引起小胶质细胞死亡。
2、“人参提取物对激活小鼠小胶质细胞系BV-2产生炎症介质(NO)水平的影响”实验中发现人参提取物干预能明显抑制LPS引起的NO的释放,实验数据表明人参提取物对激活的小胶质细胞具有明显的抑制作用。
3、本发明所述人参提取物制备方法以D型大孔树脂吸附后,先用水:95%乙醇梯度洗脱去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以70~95%乙醇液洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,可以在前期获得人参皂苷Rd较高的洗脱液,再通过进一步的纯化处理,获得用于治疗小胶质细胞介导疾病有显著效果的人参提取物。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是,本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明,本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数,v/v表示溶液的体积比。
实施例1:人参提取物的制备
1)取人参药材加水提取,提取液浓缩成含固形物25%的人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以70%乙醇洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加浓度为95.0%乙醇溶解,用50μm滤膜滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附后,用水:浓度为95.0%乙醇按梯度洗脱法洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得人参提取物。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为50%。
实施例2:人参提取物的制备
1)取人参药材加浓度为25%的乙醇提取,将提取液回收乙醇,得含固形物20%的人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以95%乙醇洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加浓度为96%乙醇溶解,用45μm滤膜滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附后,用水:浓度为97%乙醇按梯度洗脱法洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为63%。
实施例3:人参提取物的制备
1)取人参药材加浓度为96%乙醇提取,将提取液回收乙醇,得含固形物5%的人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以95%乙醇液洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加浓度为98.0%乙醇溶解,用1μm滤膜滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附后,用水:浓度为98%乙醇按梯度洗脱法洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为71%。
实施例4:人参提取物的制备
1)取人参药材加浓度为80%乙醇提取,将提取液回收乙醇,得含固形物15%的人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以70~95%乙醇洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加浓度为99.9%乙醇溶解,用25μm滤膜滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附后,用水:浓度为99.9%乙醇按梯度洗脱法洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得。
本发明人参提取物采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为86%。
实施例5:本发明片剂
取实施例1人参提取物,加入辅料微晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀,用60%乙醇制软材,过20目筛制粒,干燥,整粒,加入润滑剂滑石粉、硬脂酸镁混合均匀,压片,制成片剂。即得人参片剂。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为48%。
实施例6:本发明颗粒剂
取实施例2人参提取物,加入辅料淀粉、蔗糖粉混合均匀,用60%乙醇制软材,过20目筛制粒,干燥,整粒,分装,制成颗粒剂,即得人参颗粒剂。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为61%。
实施例7:本发明锭剂
取实施例3人参提取物,加入粘结剂糯米粉、蜂蜜和少量的水,搅拌混合均匀,搓条,分割,按规定重量及形状搓捏成型,干燥,制得锭剂,即得人参锭剂。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为69%。
实施例8:本发明注射剂
取实施例4人参提取物,用注射用水溶解,活性炭处理,过滤,灌封,冷冻干燥,制得冻干粉针注射剂,即得人参冻干粉剂。
采用HPLC法测定,人参皂苷Rd含量为87%。
对比例1:人参皂苷的制备(参考2010版《中国药典》一部人参总皂苷的制法)
1)取人参,切得厚片,加水煎煮二次,第一次2小时,第二次1.5小时,煎滤滤过,合并滤液,通过D101型大孔吸附树脂柱,水洗脱至无色,再用60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,滤液浓缩至相对密度为1.06-1.08(80℃)的清膏,干燥,粉碎,即得人参总皂苷。
药效实验:
1人参提取物对小胶质细胞细胞活力的影响
1.1实验材料
实验药物:本发明实施例4
细胞及试剂:小胶质细胞株BV-2(北京协和医科大学);胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清(Gibco,USA);T25细胞培养瓶,96孔、48孔、12孔细胞培养板(corning);一氧化氮检测试剂盒(碧云天);Cell Counting Kit-8(DOJINDO,Japan,简称CCK-8);LPS(碧云天)
仪器设备:CO2恒温培养箱(THERMO,FORMA3111型,美国);倒置相差显微镜(Nikon,TE200,日本);低温高速离心机(BECKMAN,64R型,美国);定量PCR仪(ABI,7500型,美国);DU-800紫外分光光度计(DNA/Protein Analyzer,BECKMAN,美国);PCR1000。
1.2实验分组
实验1组:本发明实施例4人参提取物0.01g/L;
实验2组:本发明实施例4人参提取物0.001g/L;
实验3组:本发明实施例4人参提取物0.0001g/L;
对照组:培养过程不加本发明人参提取物。
1.3实验方法
在BV-2细胞中分别加入实验1-3组人参提取物培养24h后,弃去上清液,加入CCK-8,继续孵育0.5h,于450nm波长处测定吸光度。
1.4实验结果见表1
表1人参提取物对小胶质细胞细胞活力的影响
分组 | 细胞活力 |
实验1组 | 1.04±0.08 |
实验2组 | 0.99±0.14 |
实验3组 | 0.96±0.09 |
对照组 | 1.01±0.12 |
表1结果显示,实验1-3组与对照组相比,组间没有统计学差异。表明本发明对小胶质细胞活力无影响,不引起小胶质细胞死亡,没有神经毒性。
2人参提取物对小胶质细胞分泌炎性介质的影响
2.1实验材料
本发明实施例4人参提取物、对比例1人参皂苷。
2.2实验分组
实验1组:本发明实施例4人参提取物0.01g/L加LPS;
实验2组:本发明实施例4人参提取物0.001g/L加LPS;
实验3组:本发明实施例4人参提取物0.0001g/L加LPS;
实验4组:对比例1人参皂苷0.01g/L加LPS;
实验5组:对比例1人参皂苷0.001g/L加LPS;
实验6组:对比例1人参皂苷0.0001g/L加LPS;
正常对照组;
LPS组。
2.3实验方法
完全DMEM培养基培养小鼠小胶质细胞系BV-2及原代培养的大鼠小胶质细胞。调整细胞浓度为1×105/mL,接种到48孔培养板内过夜,加入本发明实施例4人参提取物及对比例1人参皂苷,终浓度分别为0.01g/L,0.001g/L,0.0001g/L,预孵育0.5h,然后加入内毒素(LPS,终浓度0.1μg/mL)进行刺激。用Greiss法检测NO的浓度。
2.4实验结果见表2。
表2对小胶质细胞分泌炎性介质的影响
分组 | 神经毒性物质NO浓度 |
实验1组 | 7.08±0.84μM*# |
实验2组 | 9.65±1.27μM*# |
实验3组 | 10.57±1.12μM*# |
实验4组 | 13.37±1.89μM* |
实验5组 | 12.89±1.78μM* |
实验6组 | 15.24±1.34μM |
对照组 | 1.29±0.38μM |
LPS组 | 16.37±1.69μM |
注:与LPS组相比,*P<0.01;与同等浓度的人参皂苷相比,#P<0.01。
表2结果显示:本发明实验1-5组与LPS组相比,有显著的统计学差异;本发明实验1-3组分别与实验4-6组相比,有显著的统计学差异。表明在达到一定浓度后人参皂苷及人参提取物干预能明显抑制LPS引起的神经毒性物质NO释放。同时表明,同等浓度条件下,采用本发明方法制备的人参提取物比人参皂苷效果更为显著。
3讨论
在研究中发现,本发明对小胶质细胞活力无影响,不引起小胶质细胞死亡,没有神经毒性。在达到一定浓度后,人参提取物干预能明显抑制LPS引起的神经毒性物质NO释放。提示本发明对多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病痴呆症、疯牛病等疾病有较佳的治疗效果,对于临床治疗小胶质细胞介导疾病药物的开发研究及临床治疗都具有参考意义。
总体实验效果显示,本发明可有效治疗小胶质细胞介导疾病,实验中药物用量0.01g/L、0.001g/L、0.0001g/L分别相当于临床治疗时人体用量的100mg/kg、10mg/kg、1mg/kg治疗效果,最优为用量0.01g/L,药效结果提示,当人参提取物中人参皂苷Rd含量为50%以上、治疗用量为1-100mg/kg时,人参提取物能显示出显著的治疗小胶质细胞介导疾病效果。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (13)
1.人参在制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途。
2.人参提取物在制备预防和/或治疗小胶质细胞介导疾病药物的新用途。
3.根据权利要求2所述用途,其特征在于:所述的人参提取物为人参醇提物。
4.根据权利要求2所述用途,所述人参提取物中人参皂苷Rd含量不低于50%。
5.根据权利要求4所述用途,其特征在于所述人参提取物通过以下步骤制备而得:
1)取人参药材加水或体积百分比浓度为25~96%的乙醇提取,将提取液回收乙醇,得人参提取液;
2)人参提取液脱脂后,经D型大孔树脂纯化后,浓缩,减压干燥,制成干燥品;
3)干燥品加体积百分比浓度为95.0%以上的乙醇溶解,滤去不溶物,然后经过单分散聚合硅胶层析柱吸附洗脱纯化,用紫外检测器在线检测洗脱液紫外吸光度,检测波长为203nm,收集主含人参皂苷Rd的洗脱液,回收溶媒并浓缩、减压干燥,即得。
6.根据权利要求5所述用途,其特征在于:所述步骤1)中所得人参提取液含固形物5-25%。
7.根据权利要求5所述用途,其特征在于:所述的步骤2)经D型大孔树脂纯化时,用水:95%乙醇按梯度洗脱法洗去除Rd外的人参三醇苷类成分以及多数人参二醇苷类成分,再单独以70~95%乙醇液洗脱以人参皂苷Rd为主的皂苷类成分,收集洗脱液并脱色后,回收溶媒。
8.根据权利要求5所述用途,其特征在于:所述的步骤3)滤去不溶物是采用1~50μm滤膜过滤。
9.根据权利要求5所述用途,其特征在于:所述的步骤3)经单分散聚合硅胶层析柱吸附后,洗脱纯化是用水及体积百分比浓度为95.0%~99.9%的乙醇液按梯度洗脱法洗脱纯化。
10.根据权利要求5所述用途,其特征在于:所述的紫外检测器在线检测采用的检测波长为203nm。
11.根据权利要求1-8任一项所述用途,其特征在于:其中所述药物每日剂量以人参皂苷Rd计为1~100 mg/kg体重。
12.根据权利要求1-10任一项所述的用途,其特征在于:所述小胶质细胞介导疾病包括多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病痴呆症、疯牛病。
13.人参提取物与医药学上可接受的载体配合制成在制备治疗和/或预防小胶质细胞介导疾病药物方面的新用途。
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