CN104957094A - 多组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法以及所述多组织β-catenin敲除的小鼠模型在多组织β-catenin敲除的小鼠模型在研究β-catenin的体内工作的应用。这对于认识Wnt通路，尤其是经典的Wnt通路的体内工作至关重要。
Description
技术领域
本申请涉及动物模型的建立方法，具体而言，涉及多组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法。
背景技术
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。
作为经典Wnt通路的核心成员，β-catenin在肿瘤发生、干细胞及胚胎发育过程中的作用已被深入研究，各种激活或失活性β-catenin组织特异性转基因小鼠模型均已建立。
发明内容
发明人利用β-cateninflox/flox和Ap2-Cre小鼠进行交配，首次建立多组织β-catenin敲除小鼠(β-cateninflox/flox；Ap2-Cre)，从而从体内水平探究β-catenin的工作。这对于对于认识Wnt通路，尤其是经典的Wnt通路的体内工作至关重要。
具体而言，本发明一方面提供了一种多组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别选用β-cateninflox/flox小鼠与Ap2-Cre小鼠繁殖，得到F1代：β-cateninflox/+；Ap2-Cre；
将F1代进行繁殖，得到F2代β-cateninflox/flox和β-cateninflox/flox；Ap2-Cre的敲除小鼠。
在某些具体实施方式中，所述β-cateninflox/flox小鼠为SPF级；
在某些具体实施方式中，所述β-cateninflox/flox小鼠具有C57BL/6J背景。
在本发明的另一方面，提供了一种通过权利要求1所述方法构建的多组织β-catenin敲除的小鼠模型在研究β-catenin的体内工作的应用。
通过上述技术方案，本发明提供了一种构建的小鼠模型的方法，其在探讨经典wnt信号通路核心分子β-catenin的体内工作具有较为重要的意义。
附图说明
图1为多组织β-catenin敲除的小鼠模型(APBKO小鼠)的繁殖模式图。
图2为代表性基因分型结果。
图3为脂肪组织β-catenin敲除效率验证。
图4为脑皮质β-catenin敲除效率情况。
图5为下丘脑β-catenin敲除效率检测。
图6为腓肠肌β-catenin敲除效率检测。
图7为股骨β-catenin敲除效率检测。
图8为肾脏组织β-catenin敲除效率检测。
具体实施方式
小鼠繁殖
采用SPF级β-cateninflox/flox小鼠(C57BL/6J背景)与Ap2-Cre小鼠繁殖，获得F1代(β-cateninflox/+；Ap2-Cre或者β-cateninflox/+；Ap2-Cre)之后，再用双杂合的F1进行繁殖，即可获得F2代对照小鼠β-cateninflox/flox；Ap2-Cre的敲除小鼠。
小鼠在以下条件分笼喂养:标准商业小鼠饲料(4.5％脂肪，4％纤维素，21％蛋白质、1.404kcal/g)、高脂饲料购自Research Diet(60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白质)，室温20-22℃，自由摄食和饮水，稳定的人工光照周期(6:00到18:00光照，18:00到6:00黑暗)。8周龄雄鼠和雌鼠按1：2比例合笼交配。
一周幼鼠基因型鉴定，三周幼鼠离乳、标记、分笼。没有特殊说明的，所有试验均采用雄性小鼠。实验所用动物均由上海交通大学医学院动物中心伦理委员会提供监管。
如图1所示，发明人建立了Ap2启动子驱动的cre重组酶介导的成熟脂肪细胞β-catenin敲除的小鼠模型。在获得的F2子代小鼠中，通过基因组DNA PCR的方法初步筛出敲除小鼠。
基因型鉴定
引物序列来自JacksonLab网站
beta-cateninflox/flox小鼠PCR引物序列：
1512：AAG GTA GAG TGA AAG TTG TT
1513：CAC CAT GTC CTC TGT CTA TTC
Beta-catenin PCR反应体系见下：
去离子水定容至12μl
96孔PCR反应板中加入上述混合液后离心数秒，每孔加石蜡油一滴。PCR反应在Eppendorf Master cycle Gradient PCR热循环仪上进行。
PCR扩增条件为：
94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35cycles 72℃2min，Hold14℃
AP2-Cre以及Ap2-Cre小鼠引物序列
oIMR1084-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
oIMR1085-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7338-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT
oIMR7339-GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C
PCR反应体系见下：
96孔PCR反应板中加入上述混合液后离心数秒，每孔加石蜡油一滴。PCR反应在Eppendorf Mastercycle Gradient PCR热循环仪上进行。
PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，51.7℃60s，72℃60s35cycles，72℃2min，Hold 14℃。
取PCR产物5μl在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色。用DL2000标记鉴定。
鼠尾组织DNA抽提
1.取2周龄小鼠，用剪刀取0.5cm长鼠尾，移入1.5ml离心管并标记。
2.加350μl裂解液，50μl蛋白酶K储存液56℃烤箱溶解过夜。
3.次日样本于室温12000rpm离心10分钟。
4.上清倒入1.5ml已标记离心管，加800uL无水乙醇，盖后振摇，可见絮状沉淀。
5.12000rpm4℃离心10分钟。
6.弃上清，倒立吸水纸约3-5分钟，待乙醇挥发。7.加100ulTE液吹打溶解后-20℃冻存备用。
琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物
1.将洗净的水平电泳凝胶槽放入夹板。
2.1X TAE电泳缓冲液在微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解，琼脂糖的浓度为2％。
3.溶化的琼脂糖溶液冷却至60℃时，加入溴化乙锭，充分摇匀。
4.在胶模上放置好梳子后，将温热凝胶倒入胶模中，避免产生气泡。
5.待凝胶凝固后，放入电泳槽，加入1XTAE电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面5mm。
6.将PCR产物与6X loading buffer混合，用微量加样器将样品依次加入加样孔内。
7.电压140V电泳，45min。电泳完成后切断电源，取出凝胶，在凝胶成像系统中对凝胶进行观察和摄影记录。
建立结果
为了证明β-catenin体内的作用，首先用Fabp4启动子驱动的重组酶在体敲除β-catenin，如Fig 1a模式图所示。在获得的F2子代小鼠中，通过基因组DNA PCR的方法初步筛出敲除小鼠(图2)。通过敲除效率的检测，发现除了脂肪组织，在检测的若干组织中，β-catenin都有表达水平的下降。下游靶基因Cyclin d1和Wisp2有不同程度的下降(图3～图8)。这提示β-cateninflox/flox；Fabp4-cre小鼠是一个次全敲除的小鼠模型。
APBKO小鼠除了在脂肪组织检测到β-catenin的敲除，脑皮质，下丘脑，骨骼等代谢器官也有β-catenin的敲除。因此提供了β-Catenin多组织敲除的小鼠模型，为研究β-catenin的体内工作提供了很好的模型。
小鼠研究
小鼠出现围生期的死亡
对小鼠进行了出生比例统计，按照双杂合的繁殖方式进行配对繁殖，根据孟德尔遗传定律，从出生后7天获得的所有333只小鼠计算APBKO小鼠出生率应该为18.75％，,而实际出生的敲除小鼠只有7.8％；生存曲线显示约50％的敲除小鼠在断奶前即死亡，纳入统计的8只敲除小鼠中位生存期只有22天，这提示APBKO小鼠存在大量的围生期死亡。而存活的APBKO新生小鼠也表现为体型偏小，生长滞后。
鼠存在生长发育迟滞、脂肪低分化
对存活的部分小鼠进行了体重等代谢指标的采集。敲除小鼠体重显著减轻，只有对照组小鼠的一半。进一步分析发现敲除小鼠白色脂肪组织极度萎缩，内脏脂肪几乎肉眼不可见。切片可见皮下脂肪呈现低分化，或者未分化的状态，没有正常的白色脂肪组织结构。棕色脂肪的大体形态则未见显著改变，镜下细胞核也显著增多，提示棕色脂肪发育也受到影响。随机血糖结果显示敲除小鼠血糖显著低于对照组，8周龄空腹血糖也显著下降，葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验结果都有改善。这说明敲除小鼠虽然出现脂肪萎缩，但是并未出现脂肪萎缩而出现的代谢恶化，如高血糖，胰岛素抵抗等。
Claims (4)
1.一种多组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别选用β-cateninflox/flox小鼠与Ap2-Cre小鼠繁殖，得到F1代：β-cateninflox/+；Ap2-Cre；
将F1代进行繁殖，得到F2代β-cateninflox/flox和β-cateninflox/flox；Ap2-Cre的敲除小鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-cateninflox/flox小鼠为SPF级。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-cateninflox/flox小鼠具有C57BL/6J背景。
4.一种通过权利要求1所述多组织β-catenin敲除的小鼠模型在研究β-catenin的体内工作的应用。
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| CN103229751A (zh) * | 2013-05-09 | 2013-08-07 | 梁廷波 | 选择性敲除树突状细胞内Myd88分子的杂交小鼠的构建方法 |
| CN103305548A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-09-18 | 西北农林科技大学 | 一种由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道dc细胞表达外源和内源基因的方法及应用 |
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2015
- 2015-07-08 CN CN201510397127.6A patent/CN104957094A/zh active Pending
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