CN104946768A - 检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。本发明还提供相应的检测试剂盒。本发明实现了简便快捷的检测LF基因转录水平的目的，可以监测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）、不同组织、不同时期的LF基因的mRNA表达状态。本发明在检测LF基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。

Description

检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增（其中n为热循环次数）。
荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合了实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数）；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2（或10）倍稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以Northern Blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。
而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在 PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。
乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是在分离乳清蛋白时得到的一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌。LF蛋白具有广谱抗菌能力的单体糖蛋白，在初乳中的含量是常乳的十几倍甚至几十倍，对幼畜初期免疫具有重要作用。LF蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化、抑杀肿瘤细胞、调节免疫系统等强大生物功能，不易产生耐药性，对动物的细胞几乎没有毒性，并且不含稀有氨基酸和外源化学成分，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。在干乳期和患有乳房炎的时期，牛的乳腺中LF蛋白表达量会显著升高，这主要是为了对抗乳腺组织中的病原微生物和炎症反应。因此，通过对LF基因表达量的检测，可以监测牛在患病过程中免疫能力的变化。
发明内容
本发明提供了检测乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）LF基因mRNA表达量的引物和PCR反应的条件，并组装成LF基因mRNA表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。
本发明提供一种检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；
下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。
本发明的第二个目的是提供一种牛LF基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物序列为：
上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；
下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。
优选地，所述试剂盒还包括SYBR Green染料。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
优选地，所述阳性对照的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。
本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，57.9℃ 20秒，捕捉荧光信号，循环40次。
本发明的第四个目的是提供一种牛LF基因mRNA表达水平的定量检测方法，是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，57.9℃ 20秒，捕捉荧光信号，循环40次。
本发明的第五个目的是提供权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-5任一所述的试剂盒、序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列在定量检测牛LF基因mRNA表达水平中的应用；优选地，所述牛为黄牛、奶牛和牦牛。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1．本发明实现了简便快捷的定量检测LF基因mRNA表达水平的目的，可以监测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）、不同组织、不同时期的LF基因的mRNA表达状态。
2．本发明在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
3.本发明可以监测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）基因mRNA转录水平，通过对该基因的研究，可以鉴定该基因与动物免疫能力的相关性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为LF基因mRNA表达水平的荧光检测结果图。其中，A：扩增曲线，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值（Relative Fluorescence Units，RFU）；B：熔解曲线，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量（d(RFU)/dT）。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
其中，SYBR Green染料购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例1
本发明的LF基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒由以下组分组成：
2×SYBR GREEN MIX                     5mL；
阳性对照：标准LF基因模板         500μL；
引物混合液                                             500μL；
超纯水                                5mL。
其中，2×SYBR GREEN MIX由以下组分组成：Taq DNA聚合酶0.1 U/μL、dNTPs底物0.4 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、pH8.3的Tris·HCl  20 mmol/L、质量百分含量为0.02%的明胶和SYBR Green染料。
引物混合液：上游引物8 μmol/L、下游引物8 μmol/L。其中，上游引物的序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’，
下游引物的序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。
标准LF基因模板：浓度为0.8 μmol/L，LF基因模板序列为
5’-CCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAGGCGCGGTACACCAGGGTCGTGTGGTGTGCCGTGGGACCCGAGGAGCAGAAGAAGTGCCAGCAGTGGA-3’。
超纯水：纯度超过18.25 MΩ·CM。
应用本发明的荧光定量PCR检测试剂盒定量检测牛LF基因mRNA表达水平的步骤如下：
（1）按比例配制LF荧光定量PCR反应液，20 μL反应体系如表1：
表1  LF荧光定量PCR反应液20 μL反应体系
在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。
其中，阴性对照为超纯水；阳性对照为标准LF基因模板。
（2）取2×SYBR GREEN MIX 1000 μL、引物混合液100 μL、超纯水800 μL充分混匀，配制1900 μL 的FQ-PCR反应预混液；
（3）充分混匀以上各种液体，将预混液按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中；
（4）配制以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准LF基因模板5管，每管10μL；
（5）FQ-PCR扩增：在每个装有19μL PCR反应预混液的反应管中分别加入1μL待测cDNA、超纯水（阴性对照）或标准LF基因模板（阳性对照），震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96TM）中，95℃下预变性30秒，然后按95℃ 5秒，57.9℃ 20秒热循环40次，并在57.9℃时检测记录荧光信号，根据该荧光信号制作熔解曲线。PCR扩增曲线参见图1A，图1A表明LF基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线（图1B）表明该荧光定量具有高度的检测专一性。因此，本发明可以准确的测定LF的表达水平，并具有高度的特异性，效果很理想，与设计的预期完全一致。
其中，待测cDNA的制备方法如下：
a、RNA提取过程：采集牛种（黄牛、奶牛或牦牛）的组织，将100mg组织在液氮中磨碎，加入1mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃ 10000×g离心15分钟（样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层）；把水相转移到新管中；加入0.5 mL异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置10分钟；4℃ 10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀；移去上清，使用1mL 75 %乙醇洗涤RNA沉淀；4℃ 7000×g离心5分钟，弃上清；室温放置干燥RNA沉淀；加入25-200μl无RNase的水用枪头吸打几次，58℃放置10分钟使RNA溶解，此时得到牛种的RNA溶液。
b、反转录过程，即获得cDNA的过程：在PCR管中加入50 μmol/L oligo dT溶液1.5 μL，10 mmol/L dNTP混合液1 μL，牛总RNA 2.5 μL，RNase free dH2O 5μL，混匀，于65 ℃下放置5分钟后，迅速转移至冰上冷却。在上述PCR管中继续加入5×Prime ScriptTM 缓冲液4 μL，40 U/μL RNA酶抑制剂0.5 μL，200 U/μL Prime ScriptTM反转录酶1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，混匀，于30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min条件下处理。
（6）PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析：以起始模板数的对数为横坐标，以阳性对照的Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始模板数进行定量测定。同时于3％琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，溴乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。以确定扩增产物的大小，从而进一步确定扩增的是否是目的基因。
由于本发明在设计LF基因荧光定量引物时，所选择的基因片段在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源，所以使用本发明的特异性引物以及采用本发明的方法能够有效扩增来源于这些物种的LF基因，从而检测各个牛种的LF基因的mRNA表达量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
                         序列表
 
<110>  中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120>  检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cccgctactt gaccacctt                                                    19
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tccactgctg gcacttcttc                                                   20
 
 
<210>  3
<211>  120
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cccgctactt gaccaccttg aagaacctca gggaaactgc ggaggaggtg aaggcgcggt       60
 
acaccagggt cgtgtggtgt gccgtgggac ccgaggagca gaagaagtgc cagcagtgga      120

Claims (10)

1.检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；
下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。
2.一种牛LF基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物序列为：
上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；
下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SYBR Green染料。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。
6.权利要求2-5任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，57.9℃ 20秒，捕捉荧光信号，循环40次。
8.一种牛LF基因mRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于：是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，57.9℃ 20秒，捕捉荧光信号，循环40次。
10.权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-5任一所述的试剂盒、序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列在定量检测牛LF基因mRNA表达水平中的应用；优选地，所述牛为黄牛、奶牛和牦牛。
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