CN104946662A - 玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用。发明人通过超表达玉米GRMZM5G872256基因(命名为ZmGOLS2)提高植物叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高植物抗旱、抗热、抗盐的方法。通过同源克隆，用PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因。构建了用35S启动子调控该基因的表达载体。将该载体用农杆菌介导方法转入植物拟南芥后，转基因植株叶片肌醇半乳糖苷和棉子糖含量显著提高，转基因植株的抗旱、抗热和抗盐能力显著提高。该基因超表达植株在正常条件下生长正常，表现优于已知抗逆基因ZmDREB2A超表达植株。在干旱、高温、高盐胁迫条件下该基因生长优于对照，并和ZmDREB2A超表达植株生长类似。

Description

玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用

技术领域

本发明涉及玉米ZmGolS2基因的应用，具体涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用。

背景技术

通过调控相关基因表达提高植物抗旱、抗热、抗盐的研究多有报道，但多数转基因植物由于在正常条件下植物生长受到抑制，因此到目前为止，仍未见相关基因应用于商业生产。通过调控棉籽糖代谢基因提高植物抗逆性的研究报道极少。Himuro在2014年报道了在二穗短柄草中超表达拟南芥AtGolS2基因提高了转基因植株抗旱性(1)。Zhuo在2013年报道了在烟草中超表达紫花苜蓿MfGolS1基因提高了转基因烟草中的肌醇半乳糖苷、棉子糖含量并提高了抗寒、抗旱和抗盐能力(2)。Sun在2013年报道了在拟南芥中表达TsGolS2基因提高了转基因植株抗盐能力(3)。上述报道所用序列来自玉米以外其它物种，和本专利所涉及的玉米ZmGolS2序列功能类似但序列不同。

1.Himuro,Y.,Ishiyama,K.,Mori,F.,Gondo,T.,Takahashi,F.,Shinozaki,K.,Kobayashi,M.and Akashi,R.(2014)Arabidopsis galactinol synthase AtGolS2 improves drought tolerance in the monocot modelBrachypodium distachyon.J Plant Physiol,171,1127-1131.

2.Zhuo,C.L.,Wang,T.,Lu,S.Y.,Zhao,Y.Q.,Li,X.G.and Guo,Z.F.(2013)A cold responsive galactinolsynthase gene from Medicago falcata(MfGolS1)is induced by myo-inositol and confers multipletolerances to abiotic stresses.Physiol Plantarum,149,67-78.

3.Sun,Z.B.,Qi,X.Y.,Wang,Z.L.,Li,P.H.,Wu,C.X.,Zhang,H.and Zhao,Y.X.(2013)Overexpressionof TsGOLS2,a galactinol synthase,in Arabidopsis thaliana enhances tolerance to high salinity andosmotic stresses.Plant Physiol Bioch,69,82-89.

4.Li,Z.,Peng,J.,Wen,X.and Guo,H.(2013)Ethylene-insensitive3 is a senescence-associated gene thataccelerates age-dependent leaf senescence by directly repressing miR164transcription in Arabidopsis.Plant Cell,25,3311-3328.

发明内容

本发明通过PCR方法克隆了玉米GRMZM5G872256基因(命名为ZmGOLS2)，将该基因在拟南芥中超表达，提高了转基因植物叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高了植物抗旱、抗热、抗盐能力。该基因超表达植株在正常条件下生长正常，表现优于已知抗逆基因ZmDREB2A超表达植株。在干旱、高温、高盐胁迫条件下该基因生长优于对照，并和ZmDREB2A超表达植株生长类似。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

在植物中过量表达玉米ZmGolS2基因能够提高肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，提高植物的抗旱、抗热和抗盐能力。过量表达玉米ZmGolS2基因对植物在正常环境条件下的生长没有副作用。

附图说明

图1为pCsGFP载体示意图。

图2为ZmGolS2基因表达载体构建及转基因植株鉴定示意图，该图显示超表达ZmGolS2的拟南芥植株叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量显著提高；(a)转拟南芥用载体示意图；(b)ZmGolS2和ZmDREB2A基因在WT(野生型)和转基因拟南芥中表达水平分析；A：RT-PCR检测ZmGolS2的表达水平。B:RT-PCR和Western检测ZmDREB2A的表达水平；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1,G2-2，G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5，DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株；(c)超表达ZmGolS2和ZmDREB2A基因的拟南芥在正常生长条件下的生长状态；(d)HPLC检测WT和各转基因株系中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量；星号**表示与WT相比含量显著升高。

图3为超表达ZmGolS2基因植株抗旱能力提高示意图，该图中(a)干旱胁迫前，干旱胁迫2周，干旱胁迫后复水7天各个株系的表型；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1,G2-2，G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5，DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株；(b)正常生长2周的各株系叶片失水率测定；将叶片从植株上剪下，放到玻璃纸上在室温条件下失水，每隔半小时称重；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比失水率显著降低(p<0.05)；(c)各株系干旱处理后存活率统计；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比差异显著(P<0.05)。

图4为超表达ZmGolS2基因植株抗热能力提高示意图，该图显示超表达ZmGolS2和ZmDREB2A基因提高了转基因拟南芥植株的抗热性；(a)各转基因株系热激前后表型观察；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1,G2-2，G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5，DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株；(b)各株系存活率统计；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比差异显著(P<0.05)。

图5为超表达ZmGolS2基因植株抗盐能力提高示意图，该图中(a)盐胁迫处理前和处理后植株表型；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1,G2-2，G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5，DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株。盐浓度为200mM NaCl；(b)各株系盐胁迫后电导率测定；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

1、发明人通过PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因的编码区，构建了该基因植物表达载体。

对水培的三叶期玉米幼苗进行脱水处理。从脱水处理2小时的叶片提取RNA并将其反转录成cDNA。

以cDNA为模板，用上游引物5’-CGGGATCCTGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAG-3’和下游引物5’-GCTCTAGACAAACACTCTAGCCCAATTCCTGACC-3’对ZmGOLS2的编码区进行PCR扩增。

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃终延伸8min。

将扩增产物切胶回收，用BamHI和XbaI酶切片段，后与pCsGFP载体(用于拟南芥稳定转化，见图1)连接。将pCsGFP上NcoI与BamHI酶切位点之间的GFP表达框替换为一段短序列，然后将扩增并酶切的ZmGolS2ORF片段连在BamHI和XbaI位点之间，构建超表达拟南芥载体。载体有植物转化筛选标记潮霉素基因(见图2a)。载体上的ZmGolS2ORF片段经测序正确后转入农杆菌Gv3101，用花序侵染法侵染拟南芥Col0野生型。T0代种子经过70％乙醇室温1min，20％次氯酸钠室温5min消毒后，均匀涂布在MS平板上(含潮霉素25mg/L)。4℃处理3天后转移至22℃培养箱生长。萌发约7-10天，转基因植株的叶深绿，根较长；非转化的植株叶浅绿，根短，不能长期存活。将转化体移入营养土中生长直到收T1代种子。T1代种子按上述方法筛选，收T2代种子(每个株系收多个单株)。每个T2代单株种子分别筛选，种植，收集每个单株的T3代种子，筛选每个单株的T3代种子，后代不分离的(均对潮霉素有抗性)进行下一步鉴定。

ZmGolS2基因核苷酸序列：

ATGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAGATGACCGCCAAAGCCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGAAGCCTGCCACGAGGGCGTACGTGACGTTCCTTGCGGGCGACGGCGACTACTGGAAGGGCGTGGTGGGGCTGGCCAAAGGCCTGCGCAAGGTCCGCTCGGCCTACCCCCTGGTGGTGGCGGTGCTGCCCGACGTGCCCGAGTCCCACCGCCGCATCCTCGTCTCGCAGGGCTGCGTCGTCCGCGAGATCGAGCCCGTGTACCCGCCTGAGAACCAGACGCAGTTCGCCATGGCGTACTACGTCATCAACTACTCCAAGCTCCGCATCTGGGAGTTCGTGGAGTACGAGAGGATGGTGTACCTGGACGCGGACATCCAGGTGTTCGAGAACATCGACGGCCTGTTCGAGCTCGAGAAGGGGTACTTCTACGCGGTGATGGACTGCTTCTGCGAGAAGACGTGGAGCCACACCCCGCAGTACAGGATCGGCTACTGCCAGCAGTGCCCGGACAAGGTGGCGTGGCCAGCGGCGACCGCCGAGCTGGGCCCTCCGCCGTCGCTCTACTTCAACGCCGGCATGTTCGTGCACGAGCCCAGCGTGGCCACCGCCAAGGCGCTCCTCGACACCCTCCGCGTGACTCCGCCCACCCCCTTCGCAGAGCAGGACTTCCTGAACATGTTCTTCAGGGATCAGTACAGGCCGATCCCCAACGTGTACAACCTCGTGCTGGCCATGCTCTGGAGGCACCCCGAGAACGTGCAGCTGGAGAAGGTGAAGGTCGTGCACTACTGCGCGGCGGGGTCCAAGCCGTGGAGGTTCACGGGCAAGGAGGCGAACATGGACAGGGAGGACATCAACGCCCTGGTGAACAAGTGGTGGGACATCTACAACGACGAGACGCTGGACTTGAAGGGCCTGCCCTCGCTCTCGCCCGACGACGACGACGAGGTGGAGGCGGTGGCCAAGAAGCCGCTTCGCGCGGCCCTGGCGGAGGCCGGCACGGTCAAGTACGTCACCGCGCCCTCGGCCGCGTGA。

ZmGolS2基因蛋白序列：

MAPELMTAKMTAKAAAAAAAVKPATRAYVTFLAGDGDYWKGVVGLAKGLRKVRSAYPLVVAVLPDVPESHRRILVSQGCVVREIEPVYPPENQTQFAMAYYVINYSKLRIWEFVEYERMVYLDADIQVFENIDGLFELEKGYFYAVMDCFCEKTWSHTPQYRIGYCQQCPDKVAWPAATAELGPPPSLYFNAGMFVHEPSVATAKALLDTLRVTPPTPFAEQDFLNMFFRDQYRPIPNVYNLVLAMLWRHPENVQLEKVKVVHYCAAGSKPWRFTGKEANMDREDINALVNKWWDIYNDETLDLKGLPSLSPDDDDEVEAVAKKPLRAALAEAGTVKYVTAPSAA。

2、发明人发现在植物中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量。

通过RT-PCR对转化的植株进行基因表达水平鉴定。

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，24个循环；72℃终延伸8min。

对超表达玉米ZmGolS2拟南芥植株糖含量测定方法如下：将鉴定出的超表达玉米ZmGolS2的拟南芥3个株系T3代纯合种子与WT和超表达GFP种子先在MS培养基上生长2周，后移入营养土中生长4周，每个株系采0.5克叶片组织，3个生物学重复。液氮研磨至粉末后加入5ml 80％乙醇(含200μg/ml乳糖)，继续研磨至匀浆。将匀浆倒入10ml离心管中，再往研钵中加入2ml 80％乙醇(含200μg/ml乳糖)，清洗研钵，合并在离心管中。将样品置于80℃水浴锅中加热30min。室温，12000*g离心20min。将上清转移至另一干净的离心管中。95℃加热，将乙醇蒸发。将样品在-80℃冰箱中冻存24小时。真空抽干。HPLC级双蒸水将样品重悬。12000*g离心20min。上清冻存于-20℃冰箱中。测定前用0.22μm过滤。HPLC检测器为waters2424ELSD，色谱柱为WatersXbrige氨基柱。上样量为5μl。在拟南芥中超表达玉米ZmGolS2基因提高了叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，如图2d所示。

3、发明人发现在植物中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高温、抗盐能力。

转基因拟南芥苗期抗旱性检测：称取相同重量的营养土于四孔小盆中，然后通过底部吸水使土表完全湿润，称量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后将MS培养基上生长的幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3个生物学重复。正常生长14天后，不浇水处理14天，观察表型并拍照，然后复水恢复7天，后统计存活率。

转基因拟南芥苗期抗盐性检测：称取相同重量的营养土于四孔小盆中，然后通过底部吸水使土表完全湿润，称量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后将MS培养基上生长的幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3个生物学重复。正常生长14天后，每2天浇一次含有200mM NaCl的自来水，每次充分吸水，共浇7次。14天后观察表型并测定叶片电导率，电导测定方法参考背景技术中的参考文献4。

转基因拟南芥苗期抗热性检测：将MS培养基上生长(22℃，16/8光周期，相对湿度60％)5天的拟南芥幼苗移入事先浸有4ml培养液的双层Waterman滤纸上，22℃正常生长2天，然后45℃处理1小时。热激处理后放置于22℃条件下(16/8光周期，相对湿度60％)恢复培养7天后测定存活率。

在拟南芥中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高温、抗盐能力，参见图2-5。

Claims (2)

1.在植物中超表达玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用。

2.在植物中超表达玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量的应用。