CN104940238A - 鱼脑磷脂提取物及其在制备免疫调节剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
鱼脑磷脂提取物及其在制备免疫调节剂中的应用,所述的鱼脑磷脂提取物通过下述方法制备:(1)制备鱼脑组织匀浆,添加5~10U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为6~7,4℃冷藏4~6h;(2)室温条件下按1g匀浆:1~3ml溶剂向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1~2的混合物;(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱,然后用甲醇冲洗;(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。所述提取物具有高的免疫调节活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药,具体地说是鱼脑磷脂在预防和治疗免疫低下中的应用;进一步说是鱼脑磷脂在制备预防和治疗免疫低下的药物或保健食品中的应用。
背景技术
恶性肿瘤,已经成为人类死亡的第一位或第二位原因,1996年以来全球每年新确诊肿瘤病人1000万以上,约有700万人死于癌症,恶性肿瘤大多发生于免疫力低下人群,因此市场和临床上对疗效好、毒副反应小、免疫激活保健品和药物需求量激增。
白细胞介素是由多种细胞产生并作用与多种细胞的一类免疫细胞因子。白细胞介素在传递信息,激活与调节免疫细胞,介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。目前至少发现了38种白介素,其中多种白介素参与机体免疫调节。例如巨噬细胞分泌的IL-1,能够与抗原协同作用,活化T细胞、促进B细胞生长和分化,吸引中性粒细胞,引起炎症介质释放;IL-2主要由T细胞产生,刺激NK细胞增殖,增强NK杀伤活性,目前IL-2已通过生物工程技术大量生产,在肿瘤治疗和提高免疫中起重要作用。此外,其他的白介素如IL-6、肿瘤坏死因子TNF-a均参与杀死和抑制肿瘤细胞作用。
由于肿瘤的顽固性,细胞毒性药物难以克服肿瘤细胞及瘤体内乏氧部分的抗药性,而通过改善患者的免疫状态却有其独特的优点。白细胞介素可以通过体液免疫、细胞免疫调节机体的免疫能力,激活巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞的活性,间接杀伤肿瘤细胞,参与癌症的治疗,并且拮抗肿瘤患者由放疗和化疗导致的免疫抑制,因此不失为提高免疫力、抗肿瘤的新途径。
已有研究表明,鱼脑磷脂具有多种生物活性,包括免疫调节的作用。作为弃物利用的有效方式,鱼脑磷脂相关研究在吸引越来越多的关注。本发明的申请人长期从事鱼脑磷脂相关的研究工作,对鱼脑磷脂的提取方法及活性进行了系统而完整的探查。
发明内容
本发明的目的之一,在于提供一种鱼脑磷脂提取物,所述提取物通过下述方法制备:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加5~10U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为6~7,4℃冷藏4~6h;
(2)室温条件下,按1g匀浆:1~3ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1~2的混合物;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱(中性脂、糖脂和色素),然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
本发明另一方面的目的,在于提供上述提取物的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加5~10U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为6~7,4℃冷藏4~6h;
(2)室温条件下,按1g匀浆:1~3ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;混合物与溶剂的比例优选1g:2ml;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1~2的混合物;优选2:1;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱(中性脂、糖脂和色素),然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
在本发明的研究过程中,发明人发现,现有技术中用于提高鱼脑磷脂提取率的木瓜蛋白酶在本发明的用法条件下,对于脑磷脂的提取率并不产生很大影响,但却有助于提高提取物的免疫调节活性,提高提取物诱导免疫细胞产生白介素的能力。
因此,本发明的再一目的在于提供所述的鱼脑磷脂提取物在制备免疫调节剂中的应用。尤其是作为白介素诱导剂类免疫调节剂的应用。
本发明所述的鱼脑磷脂提取物具有更好的免疫调节作用,可作用于多种免疫细胞,增加IL-1、IL-2、IL-6、TNF-a的表达。有望应用于预防和治疗免疫低下及抗肿瘤。
具体实施方式
本发明公开了一种鱼脑磷脂提取物及其制备方法,所述提取物通过下述方法制备:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加5~10U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为6~7,4℃冷藏4~6h;
该步骤中,所述的木瓜蛋白酶的添加量优选7~8U/g;pH值优选7;
(2)室温条件下,按1g匀浆:1~3ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1~2的混合物;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱(中性脂、糖脂和色素),然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
更为具体的实施方式中,所述的鱼脑磷脂提取物的其制备方法包括如下步骤:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加7~8U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为7,4℃冷藏4~6h;
(2)室温条件下,按1g匀浆:2ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1的混合物;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱(中性脂、糖脂和色素),然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
本发明另一方面阐述了所述鱼脑磷脂提取物在制备免疫调节剂中的应用。尤其是作为白介素诱导剂类免疫调节剂的应用。
具体的实施方式中,所述的鱼脑磷脂提取物可作为原料,应用于免疫调节剂类药物或食品组合物的制备。这些药物或食物组合物可通过激活免疫细胞分泌白细胞介素发挥作用,用于治疗和预防免疫低下、肿瘤等。
结合本领域现有技术,所述“药物”可以毫无疑义地理解为各种药物制剂,包括但不限于加入各种医药辅料所制得的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、栓剂、悬浮液、乳化液、喷剂、注射液或粉针剂等。根据不同剂型特点,在使用这些药物进行治疗时,可以通过各种相应的途径给药,典型但不限于可经口服给药、注射给药及粘膜给药。所谓“食品组合物”,即通常意义的食品或保健品。
以下为本发明的具体实施例,这些实施例仅为进一步说明本发明,不应当理解为对本发明任何形式的限制。
实施例1.鲣鱼鱼脑磷脂提取物的制备
(1)收集鲣鱼鱼脑5g,制备鱼脑组织匀浆,向其中添加7U/g木瓜蛋白酶(购自广州市华琪生物科技有限公司),搅拌均匀,并调节混合物pH值为7,4℃冷藏5h;然后于室温条件下,加入10ml氯仿-甲醇按照体积比2:1的混合物;搅拌均匀,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物;将所得提取物溶于少量氯仿后进行硅胶柱层析,以6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂、3倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素,然后用甲醇冲洗;所得甲醇洗脱组分脱除溶剂,得鱼脑磷脂提取物A。
(2)按(1)的操作,但添加木瓜蛋白酶浓度为120U/g,最终得鱼脑磷脂提取物B。
(3)按(1)的操作,但收集鲣鱼鱼脑5g制备鱼脑组织匀浆后,直接加入10ml氯仿-甲醇按照体积比2:1的混合物,并继续后续的步骤,最终得到鱼脑磷脂提取物C。
实施例2.鱼脑磷脂提取率
参照“大黄鱼鱼卵磷脂酶水解法提取工艺的优化”的方法(《湖南农业大学学报》2013年05期),检测并计算实施例1中三种方法获得的鱼脑磷脂提取物中鱼脑磷脂的提取率。结果如表1所示。可见,与常规鱼脑磷脂提取方法(C)相比,相同溶剂及提取处理条件下,120U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆,磷脂提取率大幅增加(B);7U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆,磷脂提取率无明显变化(A)
表1
提取物A | 提取物B | 提取物C | |
磷脂提取率 | 52% | 71% | 50% |
实施例3.鱼脑磷脂提取物诱导巨噬细胞表达白细胞介素的试验
收集对数生长期的细胞,调整巨噬细胞的浓度,并分为不同处理组接种于6孔培养板中,每孔培养液总体积为3mL。
比较由实施例1的不同制备方式得到的鱼脑磷脂提取物对巨噬细胞的细胞因子含量的影响:分别添加鱼脑磷脂提取物A、B、C,终浓度均为40μg/mL,以含增溶剂的PBS为空白对照组。将其置于二氧化碳培养箱中培育24h后,通过ELISA方法测定白细胞介素IL-1α、IL-6及TNF-a含量。检测结果如表2所示,7U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆诱导白介素IL-1α、IL-6及TNF-a含量升高,分别高于空白对照,高于120U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆,高于常规鱼脑磷脂提取方法。
表2
提取物A | 提取物B | 提取物C | 空白 | |
IL-1αpg/mL | 80 | 58 | 60 | 40 |
IL-6pg/mL | 100 | 71 | 70 | 50 |
TNF-a pg/mL | 675 | 300 | 330 | 130 |
实施例4.鱼脑磷脂提取物诱导T淋巴细胞表达白细胞介素的试验
收集对数生长期的细胞,调整T淋巴细胞的浓度,并分为不同处理组接种于6孔培养板中,每孔培养液总体积为3mL。
比较由实施例1的不同制备方式得到的鱼脑磷脂提取物对T淋巴细胞的细胞因子含量的影响:分别添加鱼脑磷脂提取物A、B、C,使其终浓度均为40μg/mL,以含增溶剂的PBS为空白对照组。将其置于二氧化碳培养箱中培育24h后,通过ELISA方法测定白细胞介素IL-2含量。检测结果如表2所示,7U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆诱导白介素IL-1α、IL-6及TNF-a含量升高,分别高于空白对照,高于120U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆,高于常规鱼脑磷脂提取方法。
表3
提取物A | 提取物B | 提取物C | 空白 | |
IL-2pg/mL | 100 | 71 | 68 | 50 |
实施例5.鱼脑磷脂提取物诱导T淋巴细胞表达白细胞介素的试验
收集对数生长期的细胞,调整T淋巴细胞的浓度,并分为不同处理组接种于6孔培养板中,每孔培养液总体积为3mL。
比较由实施例1的不同制备方式得到的鱼脑磷脂提取物对T淋巴细胞的细胞因子含量的影响:分别添加由实施例1制得的鱼脑磷脂提取物A、B、C,终浓度为100μg/mL,以含增溶剂的PBS为空白对照组。将其置于二氧化碳培养箱中培育24h后,通过ELISA方法测定白细胞介素IL-2含量。检测结果如表2所示,7U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆诱导白介素IL-1α、IL-6及TNF-a含量升高,分别高于空白对照,高于120U/g木瓜蛋白酶处理的鱼脑匀浆,高于常规鱼脑磷脂提取方法。
表4
提取物A | 提取物B | 提取物C | 空白 | |
IL-2pg/mL | 150 | 85 | 80 | 50 |
Claims (8)
1.鱼脑磷脂提取物,通过下述方法制备:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加5~10U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为6~7,4℃冷藏4~6h;
(2)室温条件下,按1g匀浆:1~3ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1~2的混合物;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱,然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
2.根据权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物,其特征在于,所述步骤(1)中木瓜蛋白酶的添加量为7~8U/g。
3.根据权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物,其特征在于,所述的步骤(1)中调节混合物pH值为7。
4.根据权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物,其特征在于,所述的步骤(2)中混合物与溶剂的比例为1g:2ml。
5.根据权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物,其特征在于,所述的步骤(2)中溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1的混合物。
6.根据权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物,其特征在于,其制备方法包括如下步骤:
(1)制备鱼脑组织匀浆,向其中添加7~8U/g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,并调节混合物pH值为7,4℃冷藏4~6h;
(2)室温条件下,按1g匀浆:2ml溶剂的比例向步骤(1)所得的混合物中加入溶剂,搅拌,静置十分钟后抽滤,收集滤液,脱水旋干得提取物I;
所述溶剂为氯仿和甲醇按照体积比2:1的混合物;
(2)将提取物I溶于氯仿后进行硅胶柱层析,以4~6倍柱体积的氯仿、2~4倍柱体积丙酮依次洗脱,然后用甲醇冲洗;
(3)甲醇洗脱组分脱除溶剂,即得鱼脑磷脂提取物。
7.权利要求1所述的鱼脑磷脂提取物在制备免疫调节剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的免疫调节剂是白介素诱导剂类免疫调节剂。
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