CN104928296A

CN104928296A - 一种CpG寡核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN104928296A
Application number: CN201510076090.7A
Authority: CN
Inventors: 冯宝章
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明涉及一种CpG寡核苷酸及其应用，将其与反基因V-erbB寡核苷酸联合应用，能强化后者的治疗作用，从而有效治疗高危MDS和原位癌。

Description

一种CpG寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及癌症基因诊断和基因治疗领域，尤其涉及一种CpG寡核苷酸及其应用。

背景技术

现有技术中已经研究并阐明白血病等癌症发病的原理和病因。癌症发病有以下步骤：1，致病基因V-erbB突变/扩增；2，其调节基因缺失/失活；3，癌变基因TS扩增。骨髓等组织干细胞从只有致病基因突变/扩增的癌前干细胞，发展为拥有致病基因和癌变基因双扩增的癌干细胞；4，癌干细胞表面多个生长因子受体与其微环境中多种生长因子间的互动，推动癌干细胞集落向癌瘤发展；5，在转化生长因子及其受体等因素介导下发生癌瘤细胞侵润和转移，并形成新部位的癌瘤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CpG寡核苷酸，强化反基因V-erbB寡核苷酸的治疗作用，从而治疗高危MDS和原位癌。

本发明提供的CpG寡核苷酸，

其序列如下：

5‘GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3’

反基因V-erbB寡核苷酸则有如下序列：

5’ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3’。

进一步地，应用含有上述序列的CpG寡核苷酸，经硫代修饰后单独或联合反基因V-erbB寡核苷酸制备成各种药用剂型，用于白血病和肿瘤的治疗。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：本发明的CpG寡核苷酸强化反基因V-erbB寡核苷酸的治疗作用。

附图说明

图1为本发明的使用适应症MDS疾病发展演进图。

具体实施方式

本发明实施例的CpG寡核苷酸，强化反基因V-erbB寡核苷酸的治疗作用，从而治疗高危MDS和原位癌；

其序列如下：

5‘GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3’

反基因V-erbB寡核苷酸则有如下序列：

5’ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3’。

本发明实施例，应用含有上述序列的CpG寡核苷酸，经硫代修饰后单独或联合反基因V-erbB寡核苷酸制备成各种药用剂型，用于白血病和肿瘤的治疗。

实施例1：本发明的CpG寡核苷酸在大鼠MDS基因治疗中的应用。

请参阅表3所示，联合应用两种寡核苷酸治疗MDS，显效时间明显缩短，从单用反基因寡核苷酸治疗后2-3月缩短为7-10天。甚至可治愈红白血病。

图1为本发明使用适应症MDS疾病发展演进图：本图显示MDS-RA发展白血病的过程。难治性贫血(RA)可单独用反基因V-erbB寡核苷酸治疗，而高危MDS则必须联合CpG寡核苷酸治疗，急性白血病(AL)则用本研究发明的晚期癌治疗策略作治疗。早期RA，则应用本研究另一项发明的V-erbB PCR基因诊断试剂盒作癌前基因诊断，而后用反基因V-erbB寡核苷酸治疗。其它肿瘤的早期诊断和治疗原则上适用上述模式。

一、动物模型：

应用二甲基苯蒽(DMBA)诱发Wistar大鼠MDS。所用剂量为35mg/kg，每周1次，共计3次，3-4个月后发生MDS或白血病，少数发生肉瘤。并证明它与人类MDS和白血病有相同的C-erbB重排/扩增以及N-ras点突变。大鼠MDS包括RA、RAEB和RAEBT三个亚型。难治性贫血(RA)可发展为原始和早幼粒细胞增多的RA，即RAEB和转化中的RAEB，即RAEBT和白血病(AL)。主要依据大鼠股骨骨髓原始和早幼粒细胞百分比来判断。采用大鼠MDS进行基因治疗研究，其突出优点是大鼠可以在活体情况下作治疗前后多次骨髓穿刺而不必杀死动物。这是小鼠模型作不到的。

二、给药方法：

1.尾静脉注射：用3％巴比妥钠注射液0.3-0.5ml腹腔注射，将MDS大鼠麻醉以便作尾静脉注射。使用前用无菌生理盐水溶解上述寡核苷酸粉针剂备用。剂量(D)为0.56mg/kg/天(1xD)或0.28mg/kg/天(0.5xD)。连续给药3天为一个疗程。2-3个月后作骨髓穿刺，检查骨髓象变化并观察疗效。观察和诊断指标参照人类MDS诊断和分类标准进行。

2.口服给药：根据MDS大鼠日平均饮水量，将反基因V-erbB寡核苷酸溶解于自来水中供其饮用，并照常喂养。剂量为0.56mg/kg/天，连续饮用3天为一个疗程。观察和判断疗效标准同上。

三、结果

1、尾静脉注射给药治疗

以1xD和0.5xD两个剂量治疗17只大鼠MDS，并以8只大鼠MDS为空白对照。发现在2-3个月观察期内，17只治疗鼠骨髓原始和早幼粒细胞％均有下降(表1)，原始和早幼粒细胞从平均9.6％下降到3.6％(P＜0.01)。其中94.1％(16/17)骨髓象恢复正常或接近正常(表2)。治疗观察期动物体重平均增加98克，且生育能力完好。空白对照组8只MDS中，3只从RA发展为RAEB，4只死于内脏出血，未见MDS逆转为正常者。

表1基因治疗前后MDS大鼠骨髓形态观察

*这只大鼠观察期间死于炎症；**这只大鼠发生肉瘤并转移到骨髓，A-4大鼠基因治疗后原始+早幼粒细胞百分比没达到正常水平。

2、口服给药治疗

以1×D、0.5×D和0.25×D三种剂量分别对14只大鼠MDS进行治疗。在相同的观察期内，仅1xD剂量组8只MDS有效，其余2个剂量组均无效，请结合图1所示。

3、复方韦尔柏反基因寡核苷酸治疗：

以上2种治疗均以单方韦尔柏(V-erbB)反基因寡核苷酸进行治疗。为了探讨免疫刺激剂即CpG寡核苷酸在治疗中的作用，我们将上述两种寡核苷酸联合应用，对3只大鼠进行治疗，其结果见表3。从表3可见，联合应用治疗MDS，显效时间明显缩短。复方对MDS和AEL有效，但对AML无效。

表2 33只大鼠MDS基因治疗方案和结果

*A组治疗后8-12个月未见MDS复发或发展为白血病。

表3复方韦尔柏注射液治疗结果

G＝粒系 E＝红系 RAEB：原始细胞增多型RA(难治性贫血)

AEL：急性红白血病、AML急性髓细胞白血病。AEL可发展为AML

实施例2：本发明的CpG寡核苷酸在高发区食管癌早期基因治疗中的应用：

一、病例：河北省磁县食管癌高发区食管上皮非典型增生患者41例原位癌5例。均为普查时可疑患者在内规镜下咬取组织经食管碘染后病理确诊。

二、治疗方法：非典型增生患者采用反基因V-erbB寡核苷酸(ODN)治疗(第一方案)，原位癌用反基因V-erbB寡核苷酸(ODN)联合CpG寡核苷酸治疗(第二方案)。

寡核苷酸的配制：每支EP管内装有ODN粉末10单位，-20C冷冻保存。使用之前用1毫升无菌生理盐水溶解备用。

使用方法：于内规镜下向病变部位喷洒0.3毫升，隔日1次，连续三次为一个疗程。治疗之后2小时内禁食禁饮。1-2个月后内规镜下复查，取用药后病变部位上皮组织少许，进行病理检查和疗效判断。治疗后5年复查，对每位患者行食管内规镜及病理检查。疗效判断标准：病理学上将食管上皮分为正常，单纯性增生，非典型增生(包括轻度，中度和重度增生3种)，原位癌和侵润癌。患者用药后由中度或重度增生逆转为轻度增生后正常者为有效，保持不变者为无效。从中度重度增生转为原位癌者为癌性进展。

三、治疗效果：41例食管非典型增生患者，应用第一方案治疗，33例有效，有效率80.5％，8例无效，其中癌性进展1例。与此同时应用第二方案治疗5例原位癌，3例有效，转为重度增生，轻度增生，轻度食管炎各一例。1-2个月后第一次随访，非典型增生患者仅两例复发。表明一个疗程治疗，多数患者疗效巩固。治疗后5年复查结果，41例非典型增生患者返回医院接受复查19例。经过治疗重中度增生患者由原来15例减为3例，有效率80％(12/15)，与治疗后1-2个月复查结果相同；无重度增生者。19例中已有16例趋于正常。因其治疗已过5年，故而认定为痊愈，痊愈率84.2％。原位癌治疗4例2例有效。复查中发现1例原来诊断有误，应诊断为原位癌且疗效明显，现在诊断为轻度食管炎，说明其原位癌已痊愈。因此，原位癌有效率为60％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种CpG寡核苷酸的应用，其特征在于，其与反基因V-erbB寡核苷酸配合，强化后者的治疗作用，从而有效治疗高危MDS和原位癌；

其序列如下：

5‘GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3’

反基因V-erbB寡核苷酸则有如下序列：

5’ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3’。

2.根据权利要求1所述的CpG寡核苷酸的应用，其特征在于，应用含有上述序列的CpG寡核苷酸，经硫代修饰后单独或联合反基因V-erbB寡核苷酸制备成各种药用剂型，用于白血病和肿瘤的治疗。