CN104922701A - 一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：在N₂保护下，将锂皂石分散于超纯水中，搅拌10～15分钟，得到锂皂石分散液；在N₂保护下，将三价铁盐和二价铁盐溶解于盐酸水溶液中，再逐滴加至锂皂石分散液中，搅拌10～15分钟，得到混合溶液；在N₂保护下，将NaOH水溶液加入到上述的混合溶液中，在75-85℃水浴中搅拌反应1-3小时，即得到黑色的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒；步骤2：将制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒磁分离，去除上层溶液中未负载Fe₃O₄纳米颗粒的锂皂石；离心，去除离心沉淀物，即为纯化的LAP-Fe₃O₄分散液。本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒粒径分布均匀、粒径较小，弛豫率高、造影效果显著，具有良好的胶体稳定性，具有产业化实施的前景。

Description

一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明属于核磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种一步“共沉淀法”制备锂皂石修饰的四氧化三铁纳米颗粒用作肿瘤诊断MRI造影剂的制备方法。

背景技术

核磁共振成像(MRI)是目前临床用于肿瘤诊断的常用分子影像学技术。作为分子影像学的重要组成部分，造影剂可以大大地提高成像诊断的灵敏性，但是临床使用的钆基小分子造影剂存在血液循环时间过短、无组织特异性等缺陷。而磁性氧化铁纳米颗粒虽然已作为MRI造影剂应用于临床疾病诊断，但仍存在弛豫率较低，无法实现对疾病进行灵敏的检测等问题。因此，发展具有较高驰豫率的四氧化三铁纳米颗粒是提高MRI成像效果的关键。

锂皂石是一种无机片层状粘土纳米材料，具有良好的胶体稳定性、生物相容性和生物降解性。前期研究表明锂皂石修饰的γ-Fe₂O₃的r₂弛豫率显著提高(Tzitzios et al.，Journal of Materials Chemistry 2010，20，5418-5428)，同时锂皂石能够借助其特殊的尺寸范围和表面性质延长药物在肿瘤部位的作用时间(Wanget al.，Langmuir，2013，29，pp 5030-5036)。因此，本发明选择层状纳米粘土颗粒锂皂石负载四氧化三铁纳米颗粒，构建具有良好胶体稳定性和成像效果的纳米MRI造影剂。

检索国内外文献，尚没有发现关于用“一步共沉淀法”制备LAP-Fe₃O₄纳米颗粒及其用于肿瘤诊断MRI造影剂研究的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒用于肿瘤诊断的MRI造影剂及其制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。所用的修饰剂LAP为廉价和环境友好的材料，具有产业化实施的前景。

为了解决上述问题，本发明提供了一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：在N₂保护下，将锂皂石(LAP)分散于超纯水中，搅拌10～15分钟，得到锂皂石分散液；在N₂保护下，将三价铁盐和二价铁盐溶解于盐酸水溶液中，再逐滴加至锂皂石分散液中，搅拌10～15分钟，得到混合溶液；在N₂保护下，将NaOH水溶液加入到上述的混合溶液中，在75-85℃水浴中搅拌反应1-3小时，即得到黑色的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒；

步骤2：将制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒磁分离，去除上层溶液中未负载Fe₃O₄纳米颗粒的锂皂石；离心，去除离心沉淀物，即为纯化的LAP-Fe₃O₄分散液。

优选地，所述的步骤1中的锂皂石分散液的浓度为6～10mg/mL。

优选地，所述的步骤1中的二价铁盐为四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)，三价铁盐为六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)，两者的摩尔比为1∶1.8～1∶2.0。

优选地，所述的步骤1中的盐酸水溶液的浓度为1.0％～1.5％。

优选地，所述的步骤1中的锂皂石、二价铁盐和三价铁盐的投料质量比为0.5∶0.248∶0.676～0.5∶0.285∶0.773。

优选地，所述的步骤1中的锂皂石与NaOH水溶液中所含有的NaOH的质量比为0.5∶1.5～2.0。

优选地，所述的步骤1中的搅拌速度为1000～1500rpm。

优选地，所述的步骤1中的水浴温度为80℃，反应时间为2小时。

优选地，所述的步骤2中的离心的转速为5000～6000rpm，离心时间为5～10分钟。

一种用于肿瘤诊断的MRI造影剂，其特征在于，含有上述方法制备的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒。

本发明利用一步“共沉淀法”合成磁性LAP-Fe₃O₄纳米颗粒并通过磁分离和离心对材料进行纯化。

本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。经过裸鼠体内成像造影实验，本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有显著的T₂加权造影效果，在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用价值。

本发明使用X射线衍射(XRD)、傅里叶转换红外光谱(FTIR)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、动态光散射和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过核磁共振成像仪测定纳米颗粒的T₂弛豫性能和r₂弛豫率，然后通过MTT法和相差显微镜评价纳米颗粒的生物相容性，最后进行细胞和裸鼠体内肿瘤模型的磁共振成像实验，考察LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的体外细胞和体内肿瘤模型的MRI成像效果，并通过组织分布实验研究LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在生物体内的代谢过程。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用简单的一步共沉淀法制备具有良好稳定性的LAP稳定的Fe₃O₄纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，操作简单易行，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；

(2)本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有优于Fe₃O₄纳米颗粒的r₂弛豫率，以及对肿瘤部位的被动靶向性。因此，制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒可以用作MR成像的T2造影剂。

附图说明

图1是LAP(a)，Fe₃O₄(b)和LAP-Fe₃O₄(c)的X射线衍射图；

图2是LAP，Fe₃O₄和LAP-Fe₃O₄的红外光谱图；

图3是本发明制备的LAP-Fe₃O₄和对照组Fe₃O₄纳米颗粒的TEM图和直径分布柱状图，其中，图3(a)和图3(b)是Fe₃O₄纳米颗粒的TEM图和直径分布柱状图，图3(c)和图3(d)是LAP-Fe₃O₄的TEM图和直径分布柱状图。

图4是本发明制备的LAP-Fe₃O₄和对照组Fe₃O₄纳米颗粒的T₂弛豫时间倒数与铁浓度的线性关系图；

图5本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在铁浓度为0.005-0.08mM的T₂加权的MR成像图；

图6是MTT法测得HeLa细胞经过PBS缓冲液(对照)、LAP-Fe₃O₄和对照组材料Fe₃O₄在铁浓度为10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL和100μg/mL下处理24小时后的细胞活力图；

图7是HeLa细胞经过PBS缓冲液(a)、LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(b-f)在不同铁浓度下(依次为10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL和100μg/mL)处理24小时后的相差显微镜细胞形貌图；

图8是HeLa细胞经过PBS缓冲液(a)、LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(b-f)(Fe浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2mM)处理4小时后的普鲁士蓝染色图；

图9是HeLa细胞经过PBS缓冲液和本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(Fe浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2mM)处理4小时后，HeLa细胞吞噬量随Fe浓度的变化关系；

图10是HeLa细胞经过PBS缓冲液和不同铁浓度的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒处理4小时后的T₂加权MR成像图片(a)和信号值柱状图(b)。

图11是尾静脉注射本发明制备得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒([Fe]＝930μg/mL，0.1mL)后不同时间点裸鼠肿瘤的T₂加权MR成像图片(白色圆圈指示肿瘤位置)；

图12是尾静脉注射本发明制备得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒([Fe]＝930μg/mL，0.1mL)后不同时间点裸鼠肿瘤的MRI信号值变化。

图13是尾静脉注射本发明制备得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒([Fe]＝5mg/mL，0.1mL)组织裸鼠体内代谢的组织分布图；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，具体步骤为：

在N₂保护下，将0.5g锂皂石(LAP)均匀分散在50mL超纯水中，在N₂氛围下以1000rpm的速度搅拌10分钟，得到锂皂石分散液；在N₂保护下，将0.721g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)和0.263g四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)溶于2.67mL水中，加入0.089mL的HCl(37％)溶液使六水合氯化铁和四水合氯化亚铁溶于所形成的盐酸水溶液中，再逐滴加至锂皂石分散液中，并于N₂保护下以1000rpm的速度磁力搅拌10分钟，得到混合溶液；然后，在N₂保护下，将10mL NaOH水溶液(含有2g NaOH)迅速加入上述混合溶液中，N₂保护下混合均匀，于80℃水浴中以1000rpm的速度磁力搅拌反应2小时；自然冷却，得到黑色的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒；(以上操作均在N₂保护下完成)

将制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒溶液磁分离3次，去除上层溶液中未负载Fe₃O₄纳米颗粒的锂皂石和其他杂质。将制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒溶液以5000rpm离心10分钟，去除离心沉淀物，得到纯化的LAP-Fe₃O₄分散液，并定容到50mL。取3mL的LAP、Fe₃O₄(对比例1)和LAP-Fe₃O₄(实施例1)分散液进行冷冻干燥得到LAP、Fe₃O₄和LAP-Fe₃O₄纳米颗粒粉末，对其进行XRD和FT-IR等测试；用超纯水分别配制浓度为0.5mg/mL的LAP、Fe₃O₄(对比例1)和LAP-Fe₃O₄(实施例1)纳米颗粒悬浮液1.5mL，用于测表面电势和水动力直径；取Fe₃O₄(对比例1)和LAP-Fe₃O₄(实施例1)纳米颗粒水溶液各5μL，然后用超纯水分别配制成100μL的纳米颗粒悬浮液，并取5μL纳米颗粒悬浮液滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试，并分别随机测量200个纳米颗粒的直径计算其颗粒大小；将本发明制备的Fe₃O₄(对比例1)和LAP-Fe₃O₄(实施例1)纳米颗粒水溶液通过ICP-OES测试法测定Fe元素的浓度，接着在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.005、0.01、0.02、0.04和0.08mM的水溶液2mL，通过磁共振成像仪测定材料在不同的Fe浓度下的T₂弛豫效应；结果如下：

(1)X射线衍射(XRD)测试结果

如图1所示，为LAP、Fe₃O₄与LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的X-射线衍射图谱。结果表明本发明合成的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有220、311和400处的衍射峰，与四氧化三铁纳米颗粒的衍射峰位点非常吻合，说明反应制得了晶型良好的四氧化三铁纳米颗粒。且其具有001、100、005和110处的衍射峰，与LAP的衍射峰位点吻合。两者表明LAP成功的负载Fe₃O₄形成稳定的纳米颗粒。

(2)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试结果

如图2所示，为LAP、Fe₃O₄与LAP-Fe₃O₄的FT-IR图谱。结果表明：本发明合成的LAP-Fe₃O₄在1019cm^-1和598cm^-1处分别具有Si-O与Fe-O的振动峰，与LAP和Fe₃O₄纳米颗粒中的振动峰重合，说明Fe₃O₄纳米颗粒已经负载到LAP之上，形成稳定的复合纳米结构。

(3)纳米颗粒Zeta电势及水合粒径测试结果

本发明制备得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒、LAP以及Fe₃O₄纳米颗粒的表面电势和水合粒径测定结果如表1所示。LAP表面电势和水合粒径分别为-34.9mV和113.1nm，对照组材料Fe₃O₄纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为+20.03mV和117.8nm。在负载Fe₃O₄之后，LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的表面电势明显提高到-15.9mV，水合粒径增大为210.2nm，说明锂皂石成功地负载了Fe₃O₄纳米颗粒。

表1.LAP、Fe₃O₄和LAP-Fe₃O₄在水中的电势和水合粒径

(4)透射电子显微镜(TEM)测试结果

通过TEM观察Fe₃O₄(图3(a)和3(b))纳米颗粒和本发明制备的LAP-Fe₃O₄(图3(c)和3(d))纳米颗粒的形态和粒径。两种纳米颗粒均具有清晰的边界和良好的分散性，而且从图中可以明显看出本发明制备的LAP-Fe₃O₄中锂皂石在四氧化三铁纳米颗粒周围，起到一定的稳定作用。经过统计分析后得到Fe₃O₄平均直径为8.3±1.6nm，本发明制备的LAP-Fe₃O₄中Fe₃O₄的平均直径为9.3±2.0nm，尺寸略有增大。

(5)r₂弛豫率测量结果

r₂弛豫率反映磁性纳米颗粒作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的T₂弛豫时间的倒数拟合计算得到。图4为本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒和对照组材料Fe₃O₄的T₂弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图。可以看出这两种Fe₃O₄纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.005-0.08mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的LAP-Fe₃O₄和对照材料Fe₃O₄的r₂弛豫率分别为455.45mM^-1s^-1和247.61mM^-1s^-1。本发明所制备的LAP-Fe₃O₄的弛豫率是对照材料Fe₃O₄的近2倍，因此，LAP-Fe₃O₄可作为MRI分子影像学诊断中的优良T₂信号衰减造影剂。

实施例2

用实施例1所得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒配制铁浓度依次为0.01、0.02、0.04和0.08mM的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒溶液水溶液各1mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe浓度下的T₂弛豫效应(附图5)。

如图5所示，为本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在铁浓度为0.01-0.08mM的T₂加权的MR成像图，从图中可以看出随着铁浓度(0.01-0.08mM)的升高，信号逐渐减弱，并且呈良好的线性关系。结果说明本发明制备的LAP-Fe₃O₄材料是一种良好的磁共振T₂信号衰减造影剂。

实施例3

以HeLa细胞为模型细胞来评价本发明制备LAP-Fe₃O₄纳米颗粒对细胞存活率的影响。在DMEM培养基中加入实施例1所得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒配制铁浓度分别为10、20、50、75和100μg/mL的培养液。

将1×10⁴/孔HeLa细胞种植于96孔板中，置于5％CO₂和37℃下使用200μL DMEM培养基培养过夜贴壁，弃去培养基，每孔更换180μL DMEM培养基，并分别添加20μL不同浓度的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(最终Fe元素浓度为0、20、50、75和100μg/mL)和PBS缓冲液(对照组)，每种浓度设定5个平行样。将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24h。倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，向每孔加入20μL(5mg/mL)MTT和180μL DMEM培养基，37℃下避光培养4小时，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，摇晃15min后在酶标仪上检测各孔在λ＝570nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞存活率，其中以生理盐水处理的细胞为空白对照，细胞存活率记为100％(附图6)。

通过MTT比色法来评价本发明制备得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的细胞毒性，结果如图6所示，以HeLa细胞(人宫颈癌细胞)为模型细胞。实验结果显示LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在浓度10～100μg/mL范围内HeLa细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上。说明LAP-Fe₃O₄具有良好的细胞相容性。同时，本发明还通过相差显微镜观察材料对HeLa细胞状态的影响，如图7所示。加入所配制的铁浓度分别为10、20、50、75和100μg/mL的培养液以及对照共培养24小时后，细胞贴壁生长，状态良好，与PBS处理的细胞相比没有明显的变化。这一结果进一步证明材料在给定浓度范围内具有良好的细胞相容性。

实施例4

为了考察HeLa细胞对实施例1制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的吞噬情况，将2×10⁵/孔的HeLa细胞接种在12孔板中，并加入1mLDMEM培养基，在5％CO₂，37℃条件下培养过夜，使其贴壁，弃去培养基，每孔更换900μL DMEM培养基，并分别添加100μL不同浓度的本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(最终Fe元素浓度为0.1-1.2mM)和PBS缓冲液(对照组)共培养4h。弃去培养基，用PBS缓冲液洗3-5次，然后用2.5％的戊二醛(1mL)4℃条件下避光固定15min，PBS洗3次，加入1mL普鲁士蓝染液(Perls stain A1和Perls stainA2等量混合)，37℃下避光培养30min，PBS洗3次，在相差显微镜下观察其颜色变化(附图8)。实验结果显示，随着材料浓度的不断增加，细胞被染的蓝色越变越深，这一结果说明HeLa细胞对LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有明显的吞噬作用。

实施例5

为了进一步定量分析HeLa细胞对实施例1制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的吞噬情况，将2×10⁵/孔的HeLa细胞接种在12孔板中，并加入1mL DMEM培养基，在5％CO₂和37℃条件下培养过夜，使其贴壁，弃去培养基，每孔更换900μL DMEM培养基，并分别添加100μL不同浓度的本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(最终Fe元素浓度为0.1-1.2mM)和PBS缓冲液(对照组)共培养4h，弃去培养基，PBS洗3-5次，通过胰酶消化，离心，用1mL王水(盐酸/硝酸；体积比3∶1)消化，然后利用ICP-OES测试法测量细胞吞噬的Fe浓度。结果显示(附图9)，经LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(1.2mM)处理的细胞，其吞噬量达到13.65pg/cell。这一结果说明LAP-Fe₃O₄纳米颗粒易于被肿瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。

实施例6

在体内实验之前，本发明评价了本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的细胞MR成像效果。在DMEM培养基中加入实施例1所得到的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒，配制铁浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的培养液。

将HeLa细胞以1×10⁶/孔密度种植于6孔板中，在5％CO₂和37℃下以2mLDMEM培养基培养过夜贴壁，弃去培养基，每孔更换180μL DMEM培养基，并分别添加20μL不同浓度的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒(最终Fe元素浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM)和PBS缓冲液(对照组)，在5％CO₂和37℃下共同培养6小时。弃去培养基，用PBS缓冲液洗3-5次，胰酶消化，离心，悬浮于1mL的PBS缓冲液中(含0.5％琼脂糖)。用临床核磁共振系统扫描样品，记录不同浓度材料共培养细胞的信号强度(附图10)。

如图10所示，为HeLa细胞经过PBS缓冲液和不同铁浓度的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒处理4小时后的T₂加权MR成像图片(a)和信号值柱状图(b)，

如图10(a)所示，随着Fe浓度的升高，LAP-Fe₃O₄纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号减弱的趋势，说明随着材料浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加，LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的成像效果逐渐增强。图10(b)是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的升高，细胞的MRI信号值逐渐降低。这些结果表明本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有很好的细胞磁共振成像效果。

实施例7

为了评价本发明材料在动物体内实际的成像效果，在裸鼠体内构建HeLa移植瘤模型，通过尾静脉注射本发明实施例1所得的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的生理盐水溶液(铁含量为930μg/mL，0.1mL)，用临床核磁共振系统采集得到裸鼠的磁共振图象(附图11)，测定肿瘤部位的MRI信号值(附图12)。

如图11所示，与注射前相比，在注射LAP-Fe₃O₄的生理盐水溶液(Fe：930μg/mL，0.1mL)后2小时到4小时内，裸鼠肿瘤部位明显变暗，说明LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在肿瘤部位富集，展示出LAP-Fe₃O₄纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。6小时后，MR成像效果显示肿瘤部位的信号强度有一定程度的增强，表明材料已经逐渐的从肿瘤部位代谢排出。图12是相应注射时间点的肿瘤部位MRI信号值变化。在注射后，裸鼠肿瘤部位的MRI信号值逐渐降低，在4小时达到最低。6小时后，肿瘤部位的MRI信号值回升，这一结果与图9相一致。体内成像结果说明本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒能够在体内循环过程中被动靶向到肿瘤部位，具有良好的肿瘤MR成像效果。

实施例8

以实施例7构建的HeLa肿瘤模型裸鼠来研究本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒在生物体内各组织的分布代谢情况(附图13)。向裸鼠尾静脉注射本发明实施例1制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液([Fe]＝5mg/mL，0.1mL)，分别在12h和24h处死裸鼠；取出各个器官并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-OES测定各个组织器官中铁的含量，并以空白老鼠作为参考对照。如图13所示，在注射材料12h后，肝、脾和肺中铁的含量较注射前均明显增加，而在注射材料24h之后，裸鼠体内的铁逐渐减少，说明本发明制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒能在裸鼠体内正常的代谢清除。

对比例1

将0.721g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)和0.263g四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H2O)溶于2.67mL水中，加入0.089mL的HCl(37％)溶液，并于N₂保护下80℃搅拌10分钟；然后将混合溶液逐滴加入60mL的NaOH(2g)溶液中，N₂保护下持续搅拌混合均匀，于80℃反应2小时；自然冷却，得到黑色的Fe₃O₄纳米颗粒。将制备的Fe₃O₄纳米颗粒溶液磁分离3次，离心10分钟去除大颗粒沉淀，然后取上层溶液定容到50mL。取5mL上层液冷冻干燥，用于X-射线衍射检测，结果见附图1。

Claims (9)

1.一种锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：在N₂保护下，将锂皂石(LAP)分散于超纯水中，搅拌10～15分钟，得到锂皂石分散液；在N₂保护下，将三价铁盐和二价铁盐溶解于盐酸水溶液中，再逐滴加至锂皂石分散液中，搅拌10～15分钟，得到混合溶液；在N₂保护下，将NaOH水溶液加入到上述的混合溶液中，在75-85℃水浴中搅拌反应1-3小时，即得到黑色的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒；

步骤2：将制备的LAP-Fe₃O₄纳米颗粒磁分离，去除上层溶液中未负载Fe₃O₄纳米颗粒的锂皂石；离心，去除离心沉淀物，即为纯化的LAP-Fe₃O₄分散液。

2.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的锂皂石分散液的浓度为6～10mg/mL。

3.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的二价铁盐为四水合氯化亚铁，三价铁盐为六水合氯化铁，两者的摩尔比为1：1.8～1：2.0。

4.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的盐酸水溶液的浓度为1.0％～1.5％。

5.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的锂皂石、二价铁盐和三价铁盐的投料质量比为0.5：0.248：0.676～0.5：0.285：0.773。

6.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的锂皂石与NaOH水溶液中所含有的NaOH的质量比为0.5：1.5～2.0。

7.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的水浴温度为80℃，反应时间为2小时。

8.如权利要求1所述的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的离心的转速为5000～6000rpm，离心时间为5～10分钟。

9.一种用于肿瘤诊断的MRI造影剂，其特征在于，含有权利要求1-8中任 一项所述的制备方法所制备的锂皂石负载磁性四氧化三铁纳米颗粒。