CN104919299A - 组合的样品检查 - Google Patents

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R.维姆伯-格-弗里伊德
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Abstract

本发明涉及一种用于样品，例如在显微镜载片（10）上的生物组织（11）的薄切片的检查的方法和装置（1000）。该方法包括样品（11）的图像（I）的生成，关于至少一个样品参数对所述图像的分析，在所述图像（I）中的图像-ROI（兴趣区域）（RI）的选择，来自样品（11）的对应样品ROI（RS）的隔离。然后利用隔离的样品-ROI（RS）执行分子测定，并且将从这些测定获得的数据链接到样品参数。样品参数可特别与特定细胞类型或组织类型的局部量相关。

Description

组合的样品检查
技术领域
本发明涉及用于样品（特别是生物组织的样品）的检查的方法和装置。而且，其涉及样品隔离单元。
背景技术
US6091842公开了一种分析仪，其中生成生物标本的图像并且针对包含细胞学材料的区域对生物标本的图像进行自动分析。然后将这些区域以临时优化的顺序自动呈现给人类操作员。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于样品的更通用检查的手段。合期望的是该检查具有高准确度和/或效率。
该目的是通过根据权利要求1所述的方法、根据权利要求2所述的装置、根据权利要求14所述的样品隔离单元和根据权利要求15所述的用途来解决的。在从属权利要求中公开了优选实施例。
根据其第一方面，本发明通过用于样品（特别是应当针对例如肿瘤细胞的存在而被检查的生物起源样品（如组织块））的检查的方法来解决上述顾虑。该方法包括以下步骤或其组合中的至少一个，其中步骤或步骤的序列可以可选地被重复一次或多次：
a)样品的图像的生成。
b)关于至少一个给定参数对所述图像的分析，所述至少一个给定参数可从图像确定并且为了引用的目的在下文将被称为“样品参数”。通常，将以空间分辨的方式，即根据图像区域或图像像素来确定样品参数。对“样品参数”的引用将在下文表示对至少一个样品参数的引用，如果多于一种类型的样品参数已被确定的话，优选表示对所有样品参数的引用。
c)在提到的图像中的兴趣区域（ROI）的选择，其中所述兴趣区域将在下文被称为“图像-ROI”。
d)来自样品的对应于上述图像-ROI的区域的隔离，其中样品的该区域将在下文被称为“样品-ROI”。“隔离”表示属于样品-ROI的样品材料与样品的其余部分物理分离。
e)利用上述样品-ROI执行至少一个分子测定。
f)测定数据到对应样品区域的样品参数的链接。
上述图像-ROI可以是图像的单个连接的片，或其可以包括多个断开的片。图像的点是否属于图像-ROI的决定取决于样品的预期检查。在肿瘤学应用中，图像-ROI可例如包含被怀疑显示肿瘤细胞的那些图像部分。
在图像-ROI和样品-ROI之间的对应通常使得
a)属于图像-ROI的图像的每个点显示属于样品-ROI的样品的位置和/或
b)属于样品-ROI的样品的每个点通过属于图像-ROI的图像的点来表示。
通常，两个关系a)和b）同时有效（双射函数），但是其还可被仅a)或仅b)有效（单射函数）的发明包括。
而且，术语“分子测定”应当在广义上被理解，包括通过其可确定样品-ROI的取决于它的化学成分的一个或多个参数的任何检查、测试或试验。作为示例，分子测定可包括特定蛋白质或核酸序列（例如肿瘤标记物）的（定性或定量）检测。
在步骤f)中的链接表示在对于样品-ROI的（多个）分子测定中确定的测定数据与对于对应样品区域（即图像-ROI）确定的样品参数的值相互关联。这可例如通过将它们一起存储在存储器、数据库或表中的给定位置处，或通过利用指针参考它们来完成。由于该链接，可然后自动地和/或通过用户考虑属于样品的相同部分的样品参数（或反之亦然）来评估测定数据。
根据第二方面，本发明涉及用于样品的检查的装置，所述装置包括以下部件或其组合中的至少一个：
a)用于生成样品的图像的图像生成单元。
b)用于关于至少一个样品参数来分析所述图像的图像分析仪。
c)用于在上述图像中选择兴趣区域（ROI）的图像选择单元，所述区域在下文被称为“图像-ROI”。
d)用于隔离来自样品的对应于图像中的上述图像-ROI并且在下文中被称为“样品-ROI”的兴趣区域的样品隔离单元。
e)用于执行利用样品-ROI的分子测定的分子检查单元。
f)用于链接测定数据到对应样品区域的样品参数的评估单元。图像分析仪、图像选择单元和/或评估单元的功能可以可选地通过同一设备，例如通过通用计算机来提供。
根据本发明的第一和第二方面的方法和装置包括以下相同创新概念：首先从样品的图像选择样品中的兴趣区域并且然后从物理样品实际提取该样品中的兴趣区域并且该样品中的兴趣区域受到分子测定，其中对应的图像数据和测定数据相互链接。特别地，该方法可利用所描述的装置来执行。因此针对方法提供的解释和定义也对于装置是有效的，并且反之亦然。
该方法和装置具有以下优点：它们允许对样品的更有教益的检查，因为标本可同时受到视觉检验和分子诊断，其中结果以空间分辨的方式相互链接。而且，可实现高精度的分子测定，因为通过样品-ROI的靶向限定来最小化非相关（干扰）样品材料的包含并且因为视觉检验和分子测定涉及完全相同材料（并且例如不涉及样品的不同薄切片）。另外的优点是很多或甚至所有的处理步骤可以是自动的，因此实现整个检查流程的高效率。
分子诊断（“MDx”）分析的样品材料的分析可得到对于MDx分析的质量来说是关键的参数，或提供使能MDx结果的更好解析的附加信息。例如，当选择是基于个体细胞时，获得那些细胞的安全识别。这可例如是肿瘤细胞，其通过以下参数来表征：如细胞核和细胞质之间的某一比率、细胞核的某一形状不规则性、在细胞膜中的蛋白质（例如HER2）或细胞质（细胞角蛋白）、核受体（如ER）的特别的免疫染色，或基因组参数，如某些基因（例如Her2）的复制数量或mRNA的复制数量，或其组合。可以使用某些互补的染色剂以排除误呼叫（false call），其通过利用对上皮细胞、基质细胞或免疫细胞等特异的免疫染色剂识别具有肿瘤样外表的细胞。
另一示例是使用图像参数（样品参数）用于MDx结果的解析。利用如q-PCR、微阵列、桑格测序和下一代测序之类的方法执行的MDx测试具有某些灵敏度和特异性限制。此外，当着眼于基因表达模式时，特定概况将取决于被分析的细胞类型。使用来自图像和/或图像-ROI的分析的信息可使能对表达概况的更精确解析。表达可例如被按比例调整到肿瘤细胞的级分并且针对来自其它细胞类型（例如非恶性）的标称表达概况的贡献来修正表达。可例如根据ROI中的分级存在，针对起源于非肿瘤细胞的参考基因组贡献来校正测序数据。在某些情况下，当MDx测试的结果是模糊的时候，可考虑样品选择的角色并且可建议另一更严格的选择。样品可被再访以基于来自第一MDx测试的结论识别替代的ROI。
在下文中，将描述可利用该方法和该装置两者实现的本发明的各个优选实施例。
将被检查的样品可特别是身体组织的薄切片。而且，可以在生成图像之前给样品染色，以便使特定兴趣特征（更好）可见。相应地，本发明的方法可可选地包括身体组织的薄切片的生成和/或样品的染色作为第一步骤。在本发明的装置中，可以可选地包括样品制备单元，在其中可执行这些步骤。
在样品的整个检查期间的其它时间可附加地或替代地完成染色。在本发明的一些实施例中，可例如使用MDx测试的结果来选择在样品切片上的后续染色测定。可以可选地在已经被分析并且部分移除的剩余样品切片上执行该染色。在该情况下，可包括之前的结果（例如在个体细胞基础上），而具有从后续染色获得的新结果。作为示例，MDx测定可提供关于基因突变和/或在肿瘤细胞中的某一信号传递通路的活跃性的洞悉。针对在该通路中发挥作用的蛋白质的存在和/或活化的特定染色可提供关于在基因信息和肿瘤发展和/或对某些治疗疗程的易感性之间的关系的重要信息。
样品的生成图像优选是显微图像，即其揭露裸眼不可见的细节。附加地或替代地，其优选是数字图像，因此允许通用数字图像处理流程的应用。此外，图像可通过扫描，即通过样品的较小部分的子图像的顺序生成来生成。该装置可相应地包括数字显微镜，特别是数字扫描显微镜，以允许上述特征的实施例。此外，生成的显微图像可以是明视野或荧光图像，或不同图像的组合。
在图像的生成期间优选通过盖玻片覆盖样品。这是例如当使用数字显微镜（特别是整个载片扫描器）时期望的。来自整个载片扫描器的图像分析要求高图像质量，因为病理学家需要能够提取他/她将否则从利用显微镜的操纵得到的所有信息。高图像质量要求样品被嵌入覆盖（病理学实验室中的标准流程，被称为盖玻片）。可获得商用仪器用于该步骤。因为利用数字病理学，可存储和存档数字文件来替代染色的载片，可使用载片来用于MDx的样品的检索。这具有在分析的组织和细胞与用于MDx的选择材料之间的100%匹配的优点，同时否则需要投影和插值来将图像与来自从中解剖用于MDx的ROI的样品（石蜡块）的下一切片相关。
然而，具有从相同的断片（coupe，从其已记录了数字文件）获得样品的可能性需要额外的样品制备步骤。对于ROI的移除，盖玻片是障碍。因此，其优选在样品-ROI的隔离之前被移除。可将载片与用于数字扫描的相同参考（标记物）物理对准。不需要新的图像来做出物理样品选择。可使用虚拟图像来引导采集样品-ROI并且将其从其余样品移除的激光束或机械或其它设备。可选地，可在该状态下在选择装置上获得低质量图像并且将该低质量图像映射到高质量存储图像以帮助对准和选择。
一旦已移除盖玻片，可由于上述原因在样品-ROI的移除之前和/或之后在相同载片上执行附加染色。在盖玻片之后，可获得高质量图像，将该高质量图像与所有之前测试（最重要的MDx测试）的结果一起分析和解析。
可通过适当图像处理例程自动地，通过用户的手动输入，或通过两者的混合来完成图像-ROI的选择。相应地，该装置可优选包括图像分析模块，例如具有用于数字图像的分析的相关联软件的数字微处理器。附加地或替代地，其可包括用户接口，用户接口包括输入装置，用户通过输入装置可输入涉及图像-ROI的选择的数据。一般，用户接口还将包括输出装置，例如显示器（监视器），可在其上显示样品的图像，可选地与当前定义的图像-ROI的表现一起显示。输出装置可优选允许具有可调节缩放因子的样品图像的表现。
图像分析仪将一般是具有适当图像处理软件的数字数据处理单元，通过该适当图像处理软件可自动确定样品参数。
样品参数可一般是可从样品的图像确定的任何类型的参数，例如给定化学物质的局部浓度（例如经由该物质的颜色来显露）。在优选实施例中，样品参数指示特定细胞类型或组织类型的局部量。样品参考可例如表达在给定区域中的肿瘤细胞的绝对或相对数量。特别地，其可以是在图像-ROI中的肿瘤细胞的数量和/或级分。知道对于图像-ROI的该数量可提供用于涉及该区域的测定数据的正确解析的重要线索。
如果样品参数是（至少部分）基于利用样品执行的染色测定的话，实现了本发明的另一有利实施例。可能的染色测定包括例如用于形态学的H&E（苏木精-伊红）、IHC（免疫组织化学）、FISH（荧光原位杂交）、PLA（来自瑞典Olink的邻位连接测定）、PPA（来自瑞典Olink的挂锁探针测定）、滚环扩增、RCA（瑞典，Olink），分支链DNA信号扩增，以及所有这些技术或其它测定的组合，以获得特定生物信息。染色可尤其帮助识别特定细胞类型或组织类型、和/或指示细胞的特别属性或功能或异常的分子。
图像-ROI的选择可至少部分基于确定的样品参数。如果样品参数指示例如肿瘤细胞的局部量，则图像-ROI可被选择为包括其中该参数在给定阈值之上的那些区域。
尽管通常可以生成接近任意形状和尺寸的图像-ROI，但是这对于样品-ROI通常不是这样，因为这必须利用实际物理样品来实现。在本发明的优选实施例中，因此根据通过可能样品-ROI设定的要求来调节图像-ROI的尺寸和/或形状。例如，图像-ROI的尺寸和/或其边界的曲率可被限制为分别比给定最小值更大或比给定最大值更小。该调节具有以下优点：仅生成能够实际被转移到物理样品-ROI内的这样的图像-ROI，因此避免在用于分子测定的样品的期望和实际选择之间的失配。该调节可优选通过适当（数字）图像处理例程，例如基于给定用户选择来自动完成。
获得兴趣细胞的纯粹级分可能是耗时的并且要求具有移除的高清晰度。前述方案允许放松对选择和平衡的要求，其具有考虑可如何移除容易或可靠切片并且控制选择的总尺寸的附加参数。对于较大的常规选择，优选连续切片。图像分析可以提供表列参数，如在潜在兴趣区域（例如总表面面积）中的每个识别的细胞类型的数量和级分。可通过包括参数（如总面积、可允许曲率和连接性）的设计标准来限制区域的形状。基于算法，给定针对每个MDx测定是特异的某一选择算法，可确定最适宜条件。不是提供同质样品，而是以该方式获得良好表征的样品，其满足关于MDx测试（如肿瘤细胞的级分）的要求和对于容易隔离的要求（如选择的ROI的几何形状参数）。
可从样品如何隔离样品-ROI存在几个可能性。一个可能性是从文献（参见Falko Fend, Mark Raffeld: "Laser capture microdissection in pathology", J. Clin. Pathol. 2000, 53:666–672）已知的激光显微解剖的应用。另一可能性是打印设备的使用，利用打印设备可将样品-ROI的指示打印在样品本身上，因此允许人类操作员（或机器）将样品-ROI从样品的其余部分分离。根据另外实施例，可在（例如数字）显微镜中表现图像-ROI，从而其与原始样品一起可被人类操作员或机器看到。
样品可优选被提供在某一载体上以允许容易操纵。例如，身体组织的薄切片将一般被提供在作为载体的显微镜载片上。一般，其上可提供样品的载体（或基板）的材料包括玻璃、透明塑料和/或玻璃和塑料的合成物，可选地具有用于与生物样品的期望交互的表面层。而且，载体可具有药筒的形状，例如具有开口腔、封闭腔或通过流体连接通道连接到其它腔的腔的药筒的形状。
前述载体可优选包括至少一个标记物，即在载体上的可容易被实际定位和在样品的图像中定位的元素。标记物因此提供参考，该参考允许将“图像坐标系统”（在图像平面中）映射到“样品坐标系统”（涉及载体上的实际样品）。该坐标映射对于样品-ROI的恰当隔离是重要的，样品-ROI的恰当隔离必须基于图像坐标在物理空间中完成。
当在载体上提供样品时，在样品-ROI从样品的其余部分隔离之后或期间，优选将样品-ROI从所述载体转移到单独保持器（容器、药筒、管等）。单独保持器可然后进一步被转移到分子检查设备用于执行对样品-ROI的期望分子测定。样品的其余部分相反可停留在载体上并且例如被存储或丢弃。
根据本发明的另外发展，在样品-ROI的隔离之后生成样品-ROI和/或其余样品的图像。该图像可利用还生成整个样品的图像的相同图像生成单元，或利用单独设备来生成。可将样品-ROI（或样品的其余部分的）的图像与整个样品的图像进行比较并且特别与选择的图像-ROI进行比较，因此允许验证实际样品-ROI是否对应于期望的兴趣区域。
已经提到了，分子测定可包括各种各样的不同测试中的一个或多个。特别地，分子测定可包括PCR（例如q-PCR、qRT-PCR、RT-PCR、qrt-PCR或数字PCR）、测序（特别是下一代测序）、或微阵列杂交、或另一分子测定技术或这些的组合。
优选将示出整个样品（以及可选地还示出选择的图像-ROI）的图像数据与在（多个）分子测定期间生成的测定数据进行组合，以使得它们是用户同时可访问的。可解析特别组织染色数据和分子测定数据以提供关于个体细胞功能或特性的附加信息。相应地，该装置优选包括用户接口，在该用户接口处可访问图像数据和测定数据。用户接口可例如包括数据的存储器和显示器（监视器），在该显示器（监视器）上可同时显示数据，优选使得在它们所源于的图像位置处显示测定数据。因此，可以以用户友好和直观的方式呈现采集的信息，促进它们的评估。
根据本发明的另一发展，隔离多个样品-ROI（基于对应多个图像-ROI），其中不同样品-ROI受到分别不同的测定。因此，将可能关于不同问题在相同样品中调查不同区域，例如搜索在一个区域中的第一标记物和在另一区域中的另一标记物。
图像-ROI和样品-ROI的前述定义和隔离可并行（同时）和/或顺序发生。（第二）图像-ROI的选择和对应的（第二）样品-ROI的隔离可以例如基于（第一）图像-ROI和对应（第一）样品-ROI的之前检查的组合结果来完成。这样的检查后续可重复甚至多于一次。
根据第三方面，本发明涉及用于在生物起源的样品（例如应当被检查例如肿瘤细胞的存在的组织块）中隔离样品-ROI的样品隔离单元，其中所述样品隔离单元包括以下部件：
- 用于生成光束的光源。
- 用于引导前述光束到在样品-ROI之外的位置使得在这些位置处的样品材料被改变以变成从样品的其余部分可分离的光引导系统。
所述样品隔离单元可特别在上述种类的装置中使用。其具有以下优点：其允许通过利用光束适当地处置样品中不属于兴趣区域的部分的简单和通用的在样品中的兴趣区域的隔离。由于可控制光束的灵活性和精度，因此可能隔离几乎任何任意形状的样品-ROI。
根据第四方面，本发明涉及用于从生物样品隔离样品-ROI的方法，所述方法包括以下步骤：
- 生成光束。
- 引导前述光束到在样品-ROI之外的位置使得那里的样品材料被改变以变成从其余部分可分离。
上述的样品隔离单元和方法是基于相同创新概念，即通过光束处置在样品-ROI之外的样品的区域。提供用于样品隔离单元的解释和定义因此还对于该方法是有效的，并且反之亦然。在下文中，将描述与样品隔离单元和该方法两者有关的本发明的各个优选实施例。
优选地，以描述的方式处置在样品-ROI之外的所有位置。换言之，处置样品-ROI的整个补充物。
通常，本发明包括样品材料对光束的任何反应，通过该反应所述材料变得从样品-ROI（即从未处置的样品材料）可分离。例如，样品材料可被固定（“烧进”）到样品被提供于的载体，因此允许未处置的样品-ROI从所述载体的稍后选择性移除。
在本发明的优选实施例中，通过光束对样品-ROI之外的样品材料的改变包括样品材料的消融。因此，简单移除非期望的样品材料，留下期望的样品-ROI。该方案的优点是样品材料的消融特别对于几乎所有种类的生物组织是可能的，前提是施加足够的光能到相应区域。而且，样品-ROI到另一容器或保持器的转移是不必要的，这进一步简化工作流程。
根据前述方案的另外发展，可提供废品储留槽用于收集消融的样品材料。废品储留槽可优先是可更换的，使得其可不时被更新，例如在样品-ROI的每个隔离之后。提供废品储留槽避免了消融的样品材料的不受控堆积的问题，其可能例如导致样品-ROI的污染。
为了使能和/或支持通过光束对样品材料的改变，样品材料可包括在光处置之前已被添加的光敏试剂。该试剂可例如是用于显微调查并且分子或化学剂所耦合的染色剂，并且可通过光激活其来破坏染色区域。
用于在样品-ROI之外的样品材料的改变的光束可以特别包括高功率LED光束或激光光束，其具有允许高强度的空间良好定位施加的优点。
在典型情况下，施加的光束的功率密度高于大约0.1mW/μm2，优选高于大约1.0mW/μm2 -。当施加调制光束（例如脉冲激光）时，前述值指代在光施加的整个时间段上确定的平均功率密度。
通常，光束的光将有利地具有包括被生物组织良好吸收的波长的光谱。这样的波长可一般包括UV（紫外）光（大约100nm到380nm）和/或IR（红外）光（大约800nm到大约1mm），但是还包括可见光。IR光特别适合（生物）样品材料的消融。
在一个实施例中，光束可适于同时光照考虑中的整个样品。在另一实施例中，光引导系统可包括用于跨越样品或其部分扫描光束的扫描元件（例如可移动镜和/或可移动样品保持器）。在该情况下，光束仅一次到达样品的小的有限部分，其中在整个样品或其部分上顺序和反复地移动这些部分。
在前述实施例的每个中，必须注意光束不（或至少未以超过给定阈值的强度）到达在样品-ROI中的位置。如果光引导系统包括用于（完全或部分）抑制光束的生成和/或传播（如果其将到达在样品-ROI内的位置的话）的光控制元件的话，这可实现。
假如光束的上述扫描，光控制元件可控制光引导系统的扫描元件，使得其将光束仅引导到期望位置。替代地，扫描元件可被设计为扫描样品的整个区域，并且如果光束将被引导到在样品-ROI内的位置时，光控制元件抑制光束的生成（例如通过关闭光源）或光束的传播（例如通过闭合光闸）。
根据本发明的另一实施例，前述光控制元件可适于接收定义样品-ROI的位置数据。这允许样品隔离单元的灵活应用，如仅必须传输适当数据，以便使其隔离任何期望形状的样品-ROI。特别地，从每个样品隔离不同、个体的样品-ROI因此变得可能。
本发明的其它实施例包括以下特征中的至少一个：
- 在样品-ROI的隔离之后生成样品-ROI和/或其余样品的图像。
-- 将样品-ROI从载体转移到单独保持器。
- 利用隔离的样品-ROI执行分子测定，所述测定优选包括PCR步骤、测序步骤和/或微阵列杂交。
- 样品ROI对应于已从样品的图像选择的“图像-ROI”（兴趣区域）。
已经提到的是，可特别在根据第一方面的方法中以及根据本发明的第二方面的装置中应用样品隔离单元和对应方法。因此可从该方法和装置的描述中获得关于样品隔离单元的另外信息。
本发明进一步涉及上述装置或样品隔离单元针对分子诊断、分子病理学，特别是针对肿瘤学应用、生物样品分析、化学样品分析、食品分析和/或法医分析的用途。可例如在直接或间接附着到目标分子的磁珠或荧光颗粒的帮助下完成分子诊断。
附图说明
根据下文描述的实施例，本发明的这些和其它方面将变得清楚，并且将参考下文描述的实施例来阐明本发明的这些和其它方面。
在图中：
图1示意性示出根据本发明的样品的检查；
图2示意性示出根据本发明的样品隔离单元；
图3和4示出非期望材料的消融之后的样品-ROI的照片。
在图中同样的参考数字指代相同或相似部件。
具体实施方式
患者材料（组织和细胞）的病理学诊断调查是很多治疗决策的基础，特别是在肿瘤学中。来自活检的标准、薄切片被呈现在显微镜载片上并且根据某些方案被染色以使组织的形态可视化。最近，针对疾病特有生物标记物的原位染色正被发展用于靶向药物的伴随诊断。可利用明视场显微镜完成评定。载片在调查之后需要被存储长时间段，作为备份，假如诊断需要被再评定的话。
数字病理学是新技术，其中通过数字扫描器替代显微镜，数字扫描器自动扫描被染色的组织切片并且以数字格式存储图像，该格式具有足够分辨率和颜色渲染，使得病理学家可从数字图像做出与他/她将在显微镜下直接做出的诊断相同的诊断。后者意味着数字图像可替代物理载片。替代载片来存储数字图像。原始活检样品当然也总是被存储。
居于上述形式的分析之后，还可利用如q-PCR和测序之类的分子方法（简称为“分子诊断”或“MDX”）来调查组织和细胞活检。该所谓的分子病理学随着新分子生物标记物的出现越来越重要。通常病理学家基于形态学信息决定运行分子测试以识别癌症组织的生物特性用于正确的治疗选择。因为很多分子生物标记物不能在组织上被原位定量，或至少不能以要求的精度被定量，所以在从活检获得的样品（通常来自已经从活检获得的断片）上执行单独的分子诊断测试（如PCR或测序）。在DNA或mRNA标记物的测量之前通过细胞溶解来处理该组织切片。因此，空间信息丢失。
肿瘤组织通常由很多不同细胞类型（不仅仅是癌细胞）构成，并且甚至癌细胞可在肿瘤的不同区域中在分子构成中区别很大。分子分析的结果将因此取决于被用作分子测试的样品的组织切片的精确成分。癌细胞被稀释得越多，测试结果将越不灵敏和不确定。此外，在癌细胞群体内的异质性还将引起在MDX测定中的噪声，减小灵敏性和特异性以及再现性。
在不久的将来，还将变得重要的是，从具有癌组织薄切片的载片选择其他细胞类型，例如特别类型的免疫细胞；而且从来自除了癌之外的疾病的组织载片，还将需要选择特别细胞类型来执行分子诊断。
利用数字病理学，当前不存在在活检断片的子切片上运行分子测试的可能性。由于以不同起源的良性细胞（例如内皮、纤维原和免疫细胞）对目标细胞的稀释以及癌细胞异质性，在全部断片上的测试具有次优精度和灵敏度。利用常规病理学，不可能精确地标记用于分子分析的组织切片，因为用于分子测试的样品必须来自新的载片，由于被染色和检验的样品需要被存储。
尽管分子诊断信息对于癌症（和其它疾病）的正确诊断来说具有越来越大的重要性，但是其实际上未被病理学家频繁使用。如上文解释的，主要问题是从用于MDX测试的组织活检切片定义代表性、良好定义的样品。手动选择是不精确的，由于通常肿瘤组织（或其它疾病组织）的异质性以及组织切片相对于肿瘤（或其它疾病）位置的不精确位置。手动选择可能建立污染，对于放大甚至非常低的污染浓度的PCR来说尤其如此。手动选择不允许对被选择用于MDX的组织的良好注释。计算机辅助的组织选择遭受在接连载片之间的参考损失的问题，因为不能从被用于原位染色（其是用于选择的基础）的完全相同组织切片做出选择。
因此，存在需要基于病理学图像对用于分子测试的样品材料的精确选择。
为了解决该需要，提出一种新的方案，根据该方案首先从样品的图像选择样品中的兴趣区域（ROI），并且然后从物理样品实际提取样品中的兴趣区域（ROI），并且该兴趣区域（ROI）受到分子测定。
在该方案的示例性实施例中，根据某一临床指示，来对组织载片进行染色，例如利用HER2免疫组织化学或免疫荧光染色（IHC）或染色测定的组合。然后通过数字扫描器扫描载片，并且可通过计算机程序来分析得到的图像以识别和指示共有特征的区域。可将那些区域呈现给病理学家以进行确认和调整（如果必要的话）。从那些区域，可通过表现被选择用于MDX测试的样品的部分的软件程序来自动或半自动定义兴趣区域（被称为“样品-ROI”）。将典型的参数注释到该样品-ROI，如在给定示例中的HER2的平均表达，以及在细胞上的表达的统计学分布和在该选择中的细胞成分。可将该选择的样品-ROI的坐标传送到样品隔离单元，样品隔离单元负责用于MDX的样品的物理选择。可将选择的“样品-ROI”转移到转移设备或直接转移到被用于MDX测试的一次性设备。MDX测试可包括样品制备和分子分析，如qRT-PCR、qrt-PCR、测序或下一代测序、或微阵列杂交、或这些的组合。该分析的结果可最终与来自组织选择算法的信息相关并且可选地与组织的数字图像（其中还指示了被选择用于MDX的样品-ROI）一起被解析和呈现给病理学家。
图1示意性图示根据本发明的适合于根据描述的流程对身体组织的样品11的检查的装置1000。
检查在样品制备单元100处开始，其中在用作载体的显微镜载片10上制备身体组织的薄切片11。通常，通过从嵌入石蜡的活检切割大约4-8微米的薄切片来获得组织样品。将所谓的断片放置在显微镜玻璃载片10上在水膜上以从显微切片应力松弛，并且然后让其变干。
而且，样品11可以可选地通过适当染色剂12，例如通过苏木精&伊红（H&E）或IHC来染色。存在可获得用于不同应用的若干染色方案。可以在工作台上通过在包含试剂的不同溶液中浸泡具有断片的载片来手动执行染色方案，但是还可以以自动方式执行染色方案。
可以在显微镜载片10上打印或在显微镜载片10中雕刻一个或多个标记物M，其可稍后用作用于将图像坐标与载片10上的实际坐标相关的参考点。而且，具有样品11的载片10优选被覆盖有盖玻片（未示出）以便允许在稍后扫描期间的高图像质量。
在制备步骤之后，将具有样品11的载片10转移到图像生成单元200，图像生成单元200可特别是数字扫描显微镜。
样品的数字图像I由显微镜200生成并且被传达到样品选择单元300，样品选择单元300在此通过具有显示器（监视器）301、存储器303和输入设备304（如键盘和鼠标）的工作站302来实现。样品的图像I可被显示在监视器301上以允许病理学家的视觉检验。病理学家可识别在图像中的兴趣区域RI，并且相应地标记它。
该图像-ROI RI的识别可优选通过自动图像分析例程来辅助（或完成由其完成）。作为第一非限制性示例，软件工具可识别个体细胞并且基于IHC染色的载片的数字图像（可选地被重叠有来自H&E扫描的信息）来计算考虑中的生物标记物的评分。该工具可然后计算具有细胞数量的相应统计资料的相似或相同评分的区域，在（多个）该区域中的细胞的评分的平均和直方图。如由病理学家请求的，可针对总大小、连续性和评分统计来优化该区域，可选地考虑由组织选择技术导致的约束。作为计算的结果，确定图像-ROI RI，其可与对应的统计资料一起被可视化在屏幕301上和/或在显微镜200中（在查看样品载片的同时）。可然后由病理学家利用光标的帮助来手动调节和选择图像-ROI RI。作为第二非限制性示例，可在第一步骤中由病理学家做出在图像-ROI RI内或外的区域的粗略选择来定义图像-ROI RI的识别。可例如通过包括表示用户针对快速定义所述区域做出的某一数量的点击的点的边界线的显示，来识别该区域。在第二步骤中，可以在算法（例如刚刚在上一个段中描述的那个）中使用该区域，来精化边界线的位置。在该效果中，算法可显著提供所述区域的粗略分割以允许个体核或细胞的识别。对于在视野中的每个个体细胞，可计算特征（例如染色摄取、细胞类型、细胞增殖、细胞大小、细胞形态等）。如本领域熟知的，可然后通过搜索具有类似特征的邻近细胞或核来执行实现对图像-ROI RI的更精确识别的区域的调整。可使用如k最近邻或在线机器学习之类的分隔技术。
优选地，病理学家可以以任何放大率标记位置。该标记将一般基于组织形态来完成，组织形态是用于关于病变的恶性或存在的不同细胞类型的决定的基础。可选择和标记无限数量的图像。当完成时，软件可以以适当放大率向病理学家提供所选择的图像-ROI的概览，并且将该区域调节到可稍后由样品隔离单元400处理的必要分辨率，样品隔离单元400负责样品的物理选择/隔离用于分子测试。建立文件，其包含图像-ROI RI（正和负选择）的边界的实际（图像的和/或样品的）坐标以及可由样品隔离单元400解析的必要参考。
可将前述文件用作设备的输入或作为样品隔离单元的输入，该设备可将该信息传递到载片，例如通过打印技术以仅仅指示可然后被手动或通过另一设备移除的区域，该样品隔离单元能够直接移除所指示的切片并且将它们转移到样品保持器，样品保持器可被引入分子测试仪器（或样品制备仪器）中。
在示出的实施例中，具有样品11的显微镜载片10接着被转移到样品隔离单元400，其中对应于所选择图像-ROI RI的样品ROI RS被隔离（例如通过正选择或负选择）并且被从样品的其余部分分离。优选地，该样品-ROI RS被转移到单独保持器（例如试管20）。而且，样品隔离单元可优选能够连续移除若干区域并且将那些递交给单独分子测试。如果在载片10上的样品11被覆盖有盖玻片，这将在样品-ROI的隔离发生之前被移除。
可以以若干方式执行组织的实际物理选择和转移。它们之一是通过激光显微切割（LMD）。LMD是可用于在细胞到带或到容器内的激光诱发转移的帮助下从组织载片选择个体细胞或组织部分的技术。该技术允许组织的精确转移。LMD激光可在载片上移动并且替代地，载片可在静止激光束下移动。在后一情况中，所有样品将在相同光斑下被收集，从而收集设备可非常紧凑。
在数字病理学扫描中，仪器在物镜之下移动考虑中的载片。可使用工具来找到其中存在样品的区域，以便优化扫描时间。这样的扫描流程的目前应用要求具有物理参考坐标。由于在载片尺寸中的容限，优选在载片上具有指示器，如前述标记M，其可由具有图像扫描的数字扫描器来同时读取。替代方案是使用机械止动器并且将载片抵靠止动器推动以进行可再现定位。另一替代方案是在负责选择的样品隔离单元中包括扫描功能并且使用软件工具来利用通过特征识别描绘的表面将新扫描的图像与原始图像重叠。
在样品-ROI RS的隔离之后，可从组织载片10扫描新图像以确认和控制选择。该图像可以与原始图像和MDX分析的结果一起在工作站302上存档。
具有样品-ROI RS的试管20在最终步骤中被转移到分子检查单元500，其中利用样品-ROI执行兴趣测定。具有样品的其余部分的显微镜载片10可以被可选地存储在存储单元600中用于后续存取和验证，或其可仅被丢弃。利用载片10的稍后处理步骤可特别包括后续检查，后续检查包括利用另一兴趣区域的例如至少一个新（特别是不同的）染色和/或至少一个新（特别是不同的）分子测定。
在分子检查单元500中，若干分子技术可以是可用的，用于选择的样品-ROI的分析，如PCR（在该术语下包括若干技术，如q-PCR、RT-PCR、qrt-PCR、数字PCR等），其用于检测癌细胞中的单点基因突变或任何其它DNA突变、DNA缺失、DNA插入、DNA重排或复制数量扩增或其它结构改变、和/或确定在癌细胞中基因或其它转录的DNA序列的RNA表达的程度，或RNA或DNA测序（下一代测序），其用于确定在癌细胞中的遗传变异的较广谱，例如在全基因组或全外显子组上，或靶向于基因组的较小区域，靶向于外来体，或转录组，并且在多种深度进行。依据癌细胞的基因突变和它们对应的RNA表达概况解释结果，其与预后或可选地对某一治疗的敏感性相关，如通过靶向药物，或实际评估已经开始或结束的治疗的效果（治疗监测）。而且，这样的分子分析的结果可耦合到相同样品切片的基于图像的分析，并且被一同报告并且还被组合解释。
图2示意性示出根据本发明的优选样品隔离单元400。样品隔离单元400大体允许在组织病理学调查之后从薄切片选择组织样品材料的新方式。该方案的必要步骤是应当不是样品-ROI的部分的所有材料的移除，可选地接着将所有其余材料全部转移到试管20内用于进一步的分析。
非希望材料的移除可特别基于激光消融。如上文解释的，可通过软件工具基于接在组织病理学染色之后的病理检验来选择将被移除的区域。可在非希望材料的移除之后生成其余样品的图像，以进行用于MDX分析的输入材料的精确文档化和表征（例如定量）。
图2中示出的特殊样品隔离单元400包括光源401，通过光源401生成例如（激光）光束L。利用光引导系统引导光束L到提供于载片10上的样品11上，光引导系统例如包括扫描元件（如可移动镜402和/或光闸）。光引导系统进一步包括接收定义在载片10上的期望样品-ROI的数据并且可打开和关闭光源401和/或控制扫描元件402的移动的控制单元403。因此，光源和/或光引导系统可被控制以使得通过光束L照射仅在样品-ROI之外的位置。
实际上，可以以具有大约3mW/μm2的功率密度的脉冲来使用脉冲激光。激光的典型波长是例如355nm和405nm。利用较短的波长，组织的吸收增大，但是基板的吸收也增大，假如希望在闭合隔间中操作的话。生物材料的吸收在绿色中具有最小值，除非组织被染色有在该范围内吸收的标志。如果使用IR激光，水的吸收随着波长而增大。这发挥作用，因为根据设备和测定，组织可以是干的或浸透水。
负选择（即非希望材料的移除）可以是非常快的，因为材料的可能恶化是无关紧要的。可以采用扫描激光或聚焦高功率LED光束来用于材料的消融，这是基于由于辐射的吸收所致的热效应。被消融的材料可浓缩或沉积在废品储留槽或表面404上，废品储留槽或表面404可以可选地在每次运行后被替换。
辐射的射束L可在光引导系统402中通过致动器和光闸来控制并且可以以高分辨率刻出任何图案（由光学路径中的部件确定）。可通过机械装置或通过缓冲溶液将其余样品-ROI转移到试管中。可在闭合或打开系统中执行流程。还可使用激光消融来标记可然后被手动单独选择的多个区域。
描述的方案是基于通过热消融移除材料的扫描束。与激光显微解剖（其中以精确受控方式将细胞从载片转移到基板或杯）相比，在此消融了在最终样品中不是希望的所有材料，从而仅选择的样品材料（样品-ROI）停留在载片上并且可处置载片，犹如整个切片将受到MDX。这意味着下游流程将与是否已发生选择无关。
可软件控制光引导系统402。软件控制允许用户友好可视界面的使用，该可视界面允许在交互计算机屏幕或等同工具上对选择区域的描画，同时放大或缩小，可选地与来自先期的染色（如IHC或ISH或支持病理学家的正确选择的任何其它方法）的图像的重叠组合。
取决于使用的光源，可存在足够功率来在一个或两个维度上扩展激光束。可根据需要被移除的表面的特征来调制该扩展。可跳过空隙。可使用标准载片，但是专用的基板也是可以的以促进消融过程或到MDX的样品转移或两者。而且，扫描流程仅要求光束和样品的相对移动并且可因此还包括其中例如经由可移动台（附加地或替代地）移动样品保持器10的实施例。
在一示例中，使用在355nm下的1W的UV激光来从标准显微镜载片消融FFPE组织样品。图3示出在三角形状Inv_RS的消融之后样品11的照片。可看出可从组织切片以锐利界面移除非常干净的区域。可推断，被移除的组织的分辨率在选择的条件处好于50微米。在移除的区域之间中的组织是稳定的，并且可利用留下后面的组织获得相同分辨率。使用的组织是在4微米的厚度处的乳房组织。在激光消融之前利用H&E染色该组织。
图4示出具有（负）“米奇老鼠”形状的较大区域的消融的结果。图像证明了还可容易地并且在任何期望形状下移除大区域。
总之，描述了一种用于基于组织病理学染色来选择和注释用于MDX分析的样品材料的方法。使用以细胞间基础的组织化学评分作为用于在表现用于MDX分析的样品的染色的载片上确定兴趣区域的选择标准。可通过自动算法和/或可选地与通过病理学家的手动调节组合地完成选择。替代地，可与通过算法自动调节组合地，通过病理学家手动地完成粗略选择。可从该选择在细胞类型、数量和评分上建立统计数据。将该信息链接到MDX分析。MDX分析仅并且精确地使用所描述区域的组织材料。这通过(i)使用相同载片用于（免疫）组织化学和MDX样品选择，和(ii)具有包含所有信息的数字图像从而被染色的载片不需要被保持原封不动和存储来变得可能。将计算机辅助的兴趣区域的选择与自动物理样品移除组合，自动物理样品移除与MDX样品制备和检测技术接合。该方法得到了用于MDX的良好定义的样品输入。利用MDX结果的评估来考虑该输入。以该方式，可将MDX结果注释到细胞类型和相同细胞的组织化学评分，这使得病理学诊断更加精确和可再现。通过消除较少相关组织，这些测定的精度和准确度将改进，得到改进的诊断。该方案可以与数字病理扫描器组合，数字病理扫描器可存储用于诊断的相关病理图像，做出实际载片的存储用于稍后冗余参照。总体流程可包括以下步骤中的一个或多个：
1、具有样品的载片的染色（例如IHC）。
2、载片的数字扫描。
3、得到的图像文件的存储（例如PACS、IMS）。
4、图像的解析（例如通过CAD）。
5、用于MDX的区域（“图像-ROI”）的选择（可选地使用优化算法）。
6、用于MDX的区域的注释（包括评分统计资料）。
7、用于MDX的区域（“样品-ROI”）的物理选择。
8、在选择之后的样品的图像的扫描和存储。
9、样品转移到（多个）MDX保持器（药筒、管……）。
10、具有剩余物的载片的存储。
11、选择的样品的MDX分析。
12、利用图像的评分统计资料（来自6）对MDX结果的注释。
13、MDX的解析（可选地使用评分统计资料作为用于解析算法的输入）。
14、利用MDX结果对图像的注释。
15、染色和MDX的组合结果的解析。
16、选择和MDX分析的可能新循环。
根据本发明的另一方面，描述了一种允许来自组织的样品材料的精确和高效选择用于进一步分析（如qPCR和/或测序）的方法和设备。该方法基于破坏/移除除了被选择用于分析的部分之外的所有样品材料（与必须使被选择的材料不被影响的冗长乏味正选择形成对照）。这可通过使在暴露区域处的材料蒸发的激光照射（例如扫描IR激光）非常高效地完成。可通过手或机器人容易地将其余样品转移到试管或药筒中用于MDX分析。该方法可被直接应用在标准玻璃载片上的被调查组织切片上。在选择之后的检验可容易完成，因为选择的材料未被改变并且未位移。通过利用软件控制致动的聚焦射束，高分辨率是可能的。取决于激光功率，可以实现高速。该系统可链接到数字病理扫描器和图像分析软件以进行兴趣区域的选择和输入材料的表征。
提出的方案的重要优点是单个组织切片，这隐含了所选择图像ROI到样品-ROI的100%精确映射和MDX样品的100%完整注释。而且，由于MDX样品的定量输入和减小的异质性，可实现更精确和更可再现的MDX结果，允许更好的解析。该流程还要求较少的处置（无手动步骤）和较少的组织（单个断片）。其产生了成为一体的染色和选择和MDX结果的数字文件，并且最终解析包括所选择的MDX样品的组织病理学评分。
本发明可以被应用到分子病理学中，特别用于基于在癌细胞中的分子改变的识别的患者分层的肿瘤学应用，但是还用于其他疾病的诊断/监测。
尽管已经在图和前述描述中详细图示和描述了本发明，但是这样的图示和描述应当被认为是说明性或示例性而非限制性的；本发明不限于公开的实施例。本领域技术人员根据对图、公开文本和所附权利要求的研究在实践要求保护的发明时能够理解和实现公开实施例的其它变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其它元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在相互不同从属权利要求中记载某些措施的简单事实不表明这些措施的组合不能被用于改进。在权利要求中的任何参考符号不应当被解释为限制范围。

Claims (15)

1. 一种用于样品（11）的检查的方法，所述方法包括以下步骤：
a)所述样品（11）的图像（I）的生成；
b)关于至少一个样品参数对所述图像进行分析；
c)在所述图像（I）中的兴趣区域的选择，所述区域被称为“图像-ROI”（RI）；
d)来自所述样品（11）的对应于所述图像-ROI（RI）并且被称为“样品-ROI”（RS）的兴趣区域的隔离；
e)利用所述样品-ROI执行分子测定；
f)将测定数据链接到对应样品区域的所述样品参数。
2. 一种用于样品（11）的检查的装置（1000），包括：
a)用于生成所述样品（11）的图像（I）的图像生成单元（200）；
b)用于关于至少一个样品参数来分析所述图像的图像分析仪；
c)用于在所述图像（I）中选择兴趣区域的图像选择单元（300），所述区域被称为“图像-ROI”（RI）；
d)用于隔离来自所述样品（11）的对应于所述图像-ROI（RI）并且被称为“样品-ROI”（RS）的兴趣区域的样品隔离单元（400）；
e)用于执行利用所述样品-ROI（RS）的分子测定的分子检查单元（500）；
f)用于链接测定数据到对应样品区域的所述样品参数的评估单元（301、302、303、304）。
3. 根据权利要求1所述的方法，
特征在于，在所述图像（I）的所述生成之前和/或在所述分子测定的所述执行之后染色所述样品（11）。
4. 根据权利要求1所述的方法，
特征在于，在图像（I）的所述生成期间通过盖玻片覆盖所述样品（11）。
5. 根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述图像选择单元（300）包括自动图像分析模块和/或用户接口（301、304）。
6. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述样品参数指示特定细胞类型或组织类型的局部量。
7. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述样品参数是至少部分基于利用所述样品执行的染色测定。
8. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述图像-ROI（RI）的所述选择是至少部分基于所述样品参数。
9. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，根据通过可能样品-ROI（RS）设定的需求来调整所述图像-ROI（RI）的形状和/或大小。
10. 根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述样品隔离单元（400）包括激光显微解剖设备和/或打印设备。
11. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述样品（11）被布置在包括至少一个标记物（M）的载体（10）上。
12. 根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所执行的测定包括PCR步骤、测序步骤和/或微阵列杂交或另一分子诊断技术。
13. 根据权利要求1所述的方法，
特征在于，所述图像选择包括执行在所述图像中的区域的手动粗略选择，和执行算法来自动调节精化所述区域，由此获得所述图像-ROI的更精确定义。
14. 一种用于来自样品（11）的被称为“样品-ROI”（RS）的兴趣区域的隔离的样品隔离单元（400），其特别用于根据权利要求2所述的装置（1000），
特征在于，所述样品隔离单元（400）包括：
- 用于生成光束（L）的光源（401）；
- 用于引导所述光束（L）到在所述样品-ROI（RS）之外的位置和/或在所述样品-ROI（RS）之内的位置使得在那的样品被改变以变成从其余部分可分离的光引导系统（402）。
15. 根据权利要求2所述的装置（1000）或根据权利要求14所述的样品隔离单元（400）针对分子病理学、特别针对肿瘤学应用的用途。
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