CN104918960B - 改进的人类疱疹病毒免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

一种分离的蛋白，其包括来自两个或更多不同疱疹病毒抗原的多个CTL表位的每个的各自氨基酸序列，还包括在至少两个所述CTL表位之间的干扰氨基酸或氨基酸序列，所述干扰氨基酸或氨基酸序列包含蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列，以及任选地，与抗原处理相关的转运子(TAP)识别基序。所述分离的蛋白能够在体外快速扩大人类细胞毒性T淋巴细胞(CTL)并且作为外源蛋白施用给动物时在体内引发CTL免疫应答。通常，所述分离的蛋白包括不多于二十(20)个源自巨细胞病毒和/或爱泼斯坦‑巴尔病毒(Epstein‑Barr)抗原的CTL表位。

Description

改进的人类疱疹病毒免疫疗法
技术领域
本发明涉及人类疱疹病毒免疫疗法。具体地，本发明涉及重组蛋白，其包括源自多种人巨细胞病毒(CMV)或爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)抗原的多个细胞毒性T细胞表位，其中当在免疫治疗中使用时能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答，而不仅限于此。
背景技术
爱泼斯坦-巴尔病毒以极高的发病率存在，超过90％的成年人显示出一定的暴露迹象。EBV还作为一种终身潜伏感染持续存在以及可以是无症状的。然而，EBV可导致单核细胞增多症，也被称为腺热，其在一些个体中导致显著的发病率。EBV可与若干自身免疫疾病相关，如狼疮、类风湿关节炎和多发性硬化症。重要的是，已知EBV与许多癌症有关，如鼻咽癌(NPC)、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。NPC是常见于中国和东南亚人群的癌症(在大多数其它人群中罕见)。因为在早期阶段的症状难以识别，所以患者常呈现中级(第三期)或晚期(IV期)疾病。诊断为鼻咽癌的患者首选是放疗和化疗，很有限地选择手术。放/化疗对大多数患者有效，但是大约20％的人或者有不良应答或者复发，此组具有不良预后。呈现Ⅲ和Ⅳ期肿瘤的患者仅具有50至60％(低于单独Ⅳ期患者)的5年总生存率。NPC最常见的形式是与EBV相关联，这使得这些肿瘤易于通过靶向并杀死EBV感染的肿瘤细胞进行免疫治疗。
在健康个体中的原发性CMV一般无症状、建立偶有再活化并从粘膜表面脱落的潜伏状态。在某些情况下，原发性CMV感染伴随有单核细胞增多症样疾病的临床症状，类似于Epstein-Barr病毒所引起的症状。在两个重要的临床情况中CMV引起显著的发病率和死亡率。这些临床情况包括先天性原发性感染以及在免疫抑制成人中病毒的原发或再活化。在先天性情况中，CMV是儿童智力迟缓和其它异常如耳聋的主要原因，这种影响通过医学研究所将其分类为I级候选疫苗而得以重视[即，最有利影响-既节省了资金又挽救了质量调整生命年(QALY)]((Arvin,Fast等人,2004)。在免疫功能低下个体如艾滋病毒感染个体中的CMV相关并发症常见于CD4+ T细胞计数低于50/μl的患者中((Palella,Delaney等人,1998；Salmon-Ceron,Mazeron等人,2000)。此外，在移植患者中，包括实体器官移植和异基因造血干细胞移植接受者，CMV的影响是公认的。
初次暴露至CMV导致强烈的初级免疫应答，其保持为长期记忆应答以便在再活化后用来限制病毒复制。现在有可靠证据表明体液免疫和细胞免疫应答在控制CMV感染中起到至关重要的作用。在鼠CMV模型中进行的研究提供T细胞免疫重要性上的初始证据，其中的T细胞功能丧失与增加的病毒感染再活化和传播是一致的(Reddehase,Weiland等人,1985；Mutter,Reddehase等人,1988)。此外，病毒特异性T细胞免疫重建与从急性病毒感染恢复是一致的。在不同临床环境下人类随访研究中进一步强调病毒特异性T细胞的作用。这些研究表明，抗病毒T细胞免疫不足的异源干细胞移植患者表现出患CMV相关并发症的风险增加。对细胞免疫在控制CMV疾病中作用的可信服证据来自这种研究，其中在异源干细胞移植患者中供体来源CMV特异性CD8+T细胞的过继转移不仅恢复抗原特异性细胞免疫而且也预防CMV相关的临床并发症(Riddell,Watanabe等人,1992；Walter,Greenberg等人,1995).。
鉴于这些研究，多种CMV疫苗已经在临床前和临床试验中进行评估。
这些CMV疫苗策略已经评估了糖蛋白B(gB)、pp65和IE-1作为潜在的靶，并通过多个递送平台将其递送，这些递送平台包括减毒CMV Towne株(Jacobson,Sinclair等人,2006)，编码全长抗原和表位的重组病毒载体(Bernstein,Reap等人,2009；Zhong andKhanna 2009)、DNA(Wloch,Smith等人,2008)、致密体(Frankenberg,Pepperl-Klindworth等人,2002)、和亚基(Drulak,Malinoski等人,2000)疫苗。然而，这些方法没有显示出令人信服的临床疗效，因而并没有进入临床实践。
典型地，已经提出，为了引发保护性的、CD8+细胞毒性的T细胞应答，病毒抗原必须以核酸形式(例如，使用病毒载体递送系统)而不是以外源递送蛋白形式进行递送，以使得表达蛋白质被正确处理并提呈至T细胞(Koup&Douek,2012)。这些疫苗递送平台中的大多数，特别是减毒活疫苗以及基于病毒载体的疫苗，已经提出了一些监管问题，如觉察到的长期理论健康风险(Liu；Soderberg-Naucler2006；Anderson和Schneider 2007)。
发明内容
本发明解决对使用安全递送技术的疱疹病毒免疫疗法开发的需要。本发明涉及降低发育中胎儿和免疫损伤个体(例如固体器官和造血干细胞移植接受者和晚期HIV疾病感染者)的CMV相关损伤的风险。本发明还涉及治疗如在免疫受损移植患者中、或在预防或治疗EBV相关癌症如鼻咽癌(NPC)中存在的EBV感染的症状。
本发明意想不到地发现，与过去的假设相反，施用给个体的外源多表位蛋白可引发保护性、CD8+细胞毒性T细胞应答。
因此，本发明广义地涉及分离的多表位蛋白，其包括能够引发细胞毒性T细胞应答的多个人类疱疹病毒细胞毒性T细胞(CTL)表位。
在第一个方面，分离的蛋白包括来自两个或更多不同疱疹病毒抗原的多个CTL表位的每个各自的氨基酸序列，所述分离的蛋白还包括在至少两个所述CTL表位之间的干扰氨基酸或氨基酸序列，所述氨基酸或氨基酸序列包含蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列，以及任选地，与抗原处理相关的转运子(transporter)(TAP)识别基序，其中所述分离的蛋白作为外源蛋白施用给动物时能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
适当地，分离的蛋白包含选择表位以提供人类群体的广泛覆盖。这些包括HLAⅠ类特异性HLA-A1、-A2、-A3、-All、-A23、-A24、-A26、-A29、-A30、-B7、-B8、-B27、-B35、-B38、-B40、-B41、-B44、-B51、-B57和-B58。
合适地，所述多个表位包括总计少于二十个(20)表位。
在一个实施方案中，所述疱疹病毒是CMV。优选地，CTL表位来自选自：PP50、pp65、pp150和IE-1的CMV抗原。
在优选的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表1(SEQ ID NO:1-21)的多个CTL表位。在具体的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表2(SEQ ID NO:1-13)的多个CTL表位。
在优选的实施方案中，至少一个CTL表位包括氨基酸序列VTEHDTLLY(SEQ ID NO：11)。
在另一个实施方案中，所述疱疹病毒是EBV。
优选地，将CTL表位来自选自：BMLF1、LMP2A、BRLF1、LMP2、EBNA3A、BZLF1、EBNA3C、EBNA1和EBNA3B的EBV抗原。
在一个优选的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表3(SEQ ID NO:22-41)的多个CTL表位。
还应当理解的是，分离的蛋白可以包含来自相同或不同疱疹病毒(如CMV和/或EBV)的CTL表位。
所述分离的蛋白可进一步包括干扰氨基酸或氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列。
在一个可选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是与抗原处理相关的转运子(TAP)识别基序。
在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码第一方面的分离的蛋白。
在第三方面，本发明提供包含所述第二方面的分离核酸的遗传构建体。
优选地，所述遗传构建体是表达构建体，其中所述第二方面的分离的核酸可操作地连接于存在于表达载体中的一个或多个调节序列。
在一个实施方案中，表达构建体包括表达载体，其适于在体外生产分离的蛋白以作为重组蛋白用于随后的纯化。
在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其包含第三方面的表达构建体。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞已被转染、转化或以其它方式体外引入表达构建体，用于第一方面分离蛋白质的随后纯化目的。
在第五方面，本发明提供了生产第一方面的分离蛋白质的方法，所述方法包括在第四方面的宿主细胞中表达所述分离蛋白的步骤，并在保持所述分离的蛋白在基本上非聚集形式的条件下至少部分地纯化所述分离的蛋白。
在第六方面，本发明提供根据第五方面的方法产生的分离的蛋白。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述第一或第六方面的分离的蛋白或第三方面的遗传构建体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
优选地，药物组合物是适用于与动物中CMV和/或EBV感染相关的疾病或病症的预防或治疗处理的免疫原性组合物。
更优选地，免疫治疗组合物是引发针对CMV和/或EBV保护性免疫应答的疫苗。在这方面，应该理解的是，药物组合物可包括分别包含CMV和EBV的CTL表位的单独的分离蛋白，或可包括包含EBV和CMV表位两者的单一分离蛋白。
在一个具体实施方案中，药物组合物还包含一种或多种免疫刺激分子或佐剂。
适当地，免疫刺激分子或佐剂包含一种或多种toll样受体(TLR)激动剂。
优选地，所述TLR激动剂包括TLR4激动剂和/或TLR9激动剂。
优选的佐剂包括单磷酰脂质(MPL)和/或免疫刺激DNA，如CpG ODN1826、CpGODN2006、CpG ODN2216和/或CpG ODN2336，而不局限于此。
在第八方面，本发明提供预防或治疗性处理动物中疱疹病毒感染的方法，包括向动物施用第一或第六方面的分离蛋白，或第七方面的药物组合物的步骤，从而预防性或治疗性处理动物中疱疹病毒感染。
在具体实施方案中，所述疱疹病毒是CMV或EBV。
在第九方面，本发明提供在动物中诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答的方法，包括向所述动物施用第一或第六方面的分离蛋白、或第七方面的药物组合物的步骤，从而在所述动物中诱导或引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答。
在第十方面，本发明提供扩大用于过继免疫治疗的疱疹病毒特异性CTL的方法，所述方法包括以下步骤：
(ⅰ)使分离自动物的一种或多种细胞与第一或第六方面的分离蛋白相接触；以及
(ⅱ)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱疹病毒特异性CTL。
在具体实施方案中，所述疱疹病毒是CMV或EBV。
在第十一方面，本发明提供过继免疫治疗的方法，包括向动物施用所述第十方面的步骤(ii)产生的所述疱疹病毒特异性的CTL的步骤，从而预防性或治疗性处理所述动物的疱疹病毒感染。
在具体实施方案中，所述的疱疹病毒是CMV或EBV。
在第十二方面，本发明提供的第一或第六方面的分离的蛋白，或第三方面的遗传构建体用于预防性或治疗性处理动物中的疱疹病毒感染。
在具体实施方案中，所述疱疹病毒是CMV或EBV。
优选地，根据上述方面，所述动物是哺乳动物。
更优选地，动物是人。
附图说明
为了使本发明可以更容易地理解并放入实际效果，通过仅作为示例的方式并参考附图对本发明的优选实施方式进行说明。
图1：说明CMV多表位的设计和下游处理。作为实例显示CMV多表位20mer编码序列的设计。各表位的氨基酸序列以粗体显示；在所述表位序列之后的灰色斜体字母代表用于通过蛋白酶体处理CMV多表位蛋白的氨基酸残基，以及下划线的氨基酸序列代表TAP基序(称为CMVpoly-PTL)。合成制造编码CMV多表位蛋白的DNA序列，克隆进大肠杆菌诱导质粒pJexpress 404，并转化到大肠杆菌中进行蛋白表达和纯化。
图2：CMVpoly-PTL蛋白的表达和纯化。pJexpress 404质粒表达包括13、14、15或20个CMV CD8+T细胞表位的CMVpoly-PTL蛋白质，将所述质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。用IPTG诱导蛋白表达，并用SDS PAGE在诱导样品之前和之后进行分析。图A和B示出CMVpoly-PTL蛋白在大肠杆菌中表达：泳道1，分子量标记物(kDa)；泳道2、4和6未诱导的大肠杆菌细胞裂解物；泳道3、5和7诱导的大肠杆菌细胞裂解物。*表示CMVpoly-PTL蛋白。
图3：纯化的CMVpoly-PTL蛋白的SDS PAGE分析。继在Ni NTA柱纯化CMVpoly-PTL之后，通过SDS PAGE分析来自各个纯化阶段的样本。图A、B、C和D代表CMVpoly-PTL蛋白(13mer、14mer、15mer和20mer)的纯化。对于所有SDS PAGE凝胶，泳道1：分子量标记物。泳道2：在上样前溶解的蛋白。3泳道：流过。泳道4：洗涤。泳道5、6、7、8：洗脱级分。*表示CMVpoly-PTL蛋白。
图4：CMVpoly-PTL蛋白质溶解度测试和表征，以确定CMVpoly-PTL存储作为可溶性蛋白的相容缓冲系统，对纯化蛋白使用在不同pH范围的各种缓冲液组合物进行稀释，孵育在4℃，O/N，离心，在SDS PAGE上分析上清级分。图A：泳道1：分子量标记物。泳道2：用pH 5.6的25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液稀释。泳道3：用pH 3.2的25mM MES缓冲液稀释。泳道4：用pH 4.5的25mM MES稀释。泳道5：用pH为4.5的25mM MES和400mM L-精氨酸稀释。泳道6：用pH 4.3的10mM Tris和100mM NaH2PO4稀释。泳道7：用pH值4.3的10mM Tris、100mMNaH2PO4、400mM L-精氨酸稀释。泳道8：用pH7.4的PBS、50mM L-精氨酸和50mM L-谷氨酸稀释。泳道9：加水稀释。泳道10：用pH为2的100mM甘氨酸缓冲液进行稀释。图B、C&D显示CMVpoly-PTL蛋白质纯度分析。继CMVpoly-PTL多表位蛋白(13mer，14mer和15mer)在pH 5.6的MES缓冲液中透析之后，不同浓度的每种蛋白在SDS PAGE上进行分析以观察最终纯度和降解产物。
图5：在使用CMVpoly-PTL蛋白刺激来自CMV血清阳性供体的PBMC之后，扩大CMV特异性T细胞：使用重组CMVpoly-PTL蛋白(13、14和15mer)离体刺激来自各种健康CMV血清阳性供体的PBMC，以及存在重组IL 2时培养10天。用在ICS分析确定扩大的产生IFN-γ的肽特异性CD8+T细胞百分比，并且使用FIowJo对结果进行分析。图A显示使用或不使用CMVpoly-PTL蛋白刺激PBMC之后，体外扩大的CMV特异性CD8+T细胞的代表性FACS曲线。图B&C显示使用CMVpoly-PTL蛋白(13、14和15mer)刺激之后，来自不同个体的扩大的CMV特异性CD8+T细胞的整体分析。
图6：使用CMV多表位蛋白刺激之后扩大的CMV特异性CD8+T细胞的维度和质量：使用CMVpoly-PTL蛋白(13mer)刺激PBMC之后，将细胞进行分析以通过多参数流式细胞仪评估效应子功能。在FIowJo上分析证明细胞溶解功能(CD107a脱粒标记物)和细胞内细胞因子产生(IFNγ、TNF和MIP1β)的CD8+ T细胞的频率，使用的SPICE程序绘制多功能细胞因子生产。在饼图中的数据表示各个表位，以及饼图的每片代表功能的每个可能组合。
图7：具有和没有接头的CMV多表位蛋白构建体的设计方案和蛋白质纯化：图A显示没有接头的CMV多表位蛋白(SEQ ID NO：46)(简称CMVpoly)的设计。图B显示具有蛋白酶体接头的多表位蛋白(SEQ ID NO：47)(简称CMVpoly-PL)的设计。每个可选择的CD8+T细胞的表位序列以斜体和下划线表示。对于CMVpoly-PL，每个表位序列由是蛋白酶体降解靶标的氨基酸残基(以红色显示)分离。编码CMV多表位蛋白的DNA序列质克隆到IPTG诱导质粒pJexpress404，并转化到大肠杆菌中用于蛋白质表达。使用Ni-NTA亲和层析纯化多表位蛋白。
图8：体外评估具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的处理和提呈：图A显示了通过人类细胞的CMVpoly、CMVpoly-PL和CMVpoly-PTL蛋白的体外交叉提呈。使用CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白(各25μg)脉冲刺激EBV转化的LCL两小时，洗涤，过夜孵育，然后暴露于CMV特异性CD8+T细胞，所述CMV特异性CD8+T细胞对HLA A2限制性的NLV(pp65)、HLA A1限制性的VTE(pp50)、HLA B8限制性的ELR(IE1)、HLA B7限制性的RPH(pp65)和HLAB7限制性的TPR(pp65)表位特异。FACS曲线显示与CMVpoly、CMVpolyPL或CMVpoly-PTL蛋白脉冲刺激的LCL共同培养后CMV特异性CD8+T细胞产生的IFN-γ表达。图B显示了与CMVpoly(空条)、CMVpolyPL(黑色条)或CMVpoly-PTL(灰色条)脉冲刺激的LCL共培养之后产生IFN-γ的CMV表位特异性CD8+T细胞的平均值±SEM。误差代表±SEM，**或***表示统计学显著的(P<0.001或P<0.0001)，双尾学生t检验来计算。
图9：通过人类细胞的CMV多表位蛋白的交叉提呈的分析：为了鉴定肽转运子(TAP-1和TAP-2)在CMV多表位蛋白的交叉提呈中所起的作用，使用CMV-PTL蛋白脉冲刺激TAP1&2+细胞(CEM.T1)和TAP1&2细胞(CEM.T2或CEM.T2HLA B7)两小时，洗涤，过夜孵育，并暴露于HLA A2限制性的NLV(pp65)或HLA B7限制性的TPR(pp65)表位特异性的CD8+T细胞。图A显示使用CMV多表位蛋白预致敏的CEM.T1细胞暴露之后，NLV特异性T细胞产生的IFNγ表达。图B&C显示在分别暴露至CMV多表位蛋白致敏的CEM.T2和CEM.T2HLA B7细胞之后，表达IFNγ的NLV和TPR特异性CD8+T细胞的百分比。在图A、B&C所示的数据是来自两个独立实验的一个代表性实验。
图10：不同的化学抑制剂对处理和提呈多表位蛋白的效果：CEM.T1和CEM.T2细胞或者未经处理或者用抑制剂预处理后，所述抑制剂针对自噬(3-MA)、溶酶体/内含体(氯喹或巴弗洛霉素A 1)、再循环途经(伯氨喹)、半胱氨酸蛋白酶(亮肽素或E64)或酸性蛋白酶(胃酶抑素A)(图A)、蛋白酶体抑制剂、乳胞素、环氧酶素和MG132(图B)和ER驻留氨肽酶抑制剂(硫醇亮氨酸+DTT)，或其对照(单独DDT)或高尔基体抑制剂(布雷菲德菌素A或莫能菌素)(图C)，用CMV-PTL蛋白孵育。洗涤细胞，在各种抑制剂存在下孵育十二个小时，然后暴露在HLA A2限制性NLV(pp65)特异性CD8+T细胞中，然后由ICS分析评估IFN-γ表达。每个呈现数据表示在暴露于CMV-PTL致敏的CEM.T1(空条；称作T1)和CEM.T2(黑色条；称为T2)细胞之后由抗原特异性T细胞产生的相对IFN-γ表达。数据表示一式三份进行的两独立实验的平均值。误差棒代表±SEM。*或**表示统计学显著的(P<0.05或p<0.01)，通过双尾学生t检验来计算。
图11：Sec61和ATG12shRNA在多表位蛋白交叉提呈中的作用：使用编码用于Sec61β亚基或ATG12的shRNA的重组慢病毒或对照载体(pLKO)来转导(transduce)CEM T1和CEM T2细胞，在R 10介质中培养两天，在嘌呤霉素选择七天，然后用作抗原提呈细胞。图A&D显示在shRNA转导之后，在CEM.T1和CEM.T2细胞中Sec61和ATG12蛋白表达的Western印迹分析。GAPDH用作蛋白上样对照。图B-F表示，在暴露至CMVpoly-PTL致敏的Sec61β和ATG12shRNA慢病毒或对照载体转导的CEM.T1和CEM.T2细胞之后，通过CMV特异性CD8+T细胞产生的IFN-γ表达。
图12：体内评估CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL蛋白的免疫原性：为了评估CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白的免疫原性，20μg蛋白与25μg MPL(单磷酰脂质A)和50μg CpG ODN1826配制在每剂量100μL体积中。在第0天，对6-8周龄的HLA A2转基因小鼠进行皮下免疫，以及在第21天使用相同制剂给予加强剂量。在第35天处死小鼠，使用HLA A2限制性NLV(pp65)和HLA A2限制性VLE(IE-1)肽表位在体外在IL-2的存在下刺激脾细胞达10天，然后使用ICS分析评估细胞因子表达。图A显示了使用基于CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL的疫苗制剂免疫之后CMV特异性CD8+T细胞的频率。图B显示使用CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白免疫接种后，表达细胞因子(IFN-γ，TNF和/或IL-2)不同组合的CMV特异性CD8+T细胞的绝对百分比。误差棒代表平均值±SEM。*表示统计学显著(P<0.05)。
图13：具有蛋白酶体接头的爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)多表位构建体的设计方案和蛋白质纯化。图A显示具有蛋白酶体接头的EBV多表位蛋白(称为EBVpoly)的设计。每个可选择的CD8+T细胞表位序列以斜体和下划线表示。对于EBVpoly，每个表位序列是靶向蛋白酶体降解靶标的氨基酸残基(以红色显示)所分开。图B显示EBVpoly蛋白的纯化。编码EBVpoly蛋白质的DNA序列克隆到IPTG诱导质粒pJexpress 404，并转化到大肠杆菌中用于蛋白质表达。使用Ni-NTA亲和层析来纯化EBVpoly蛋白，然后用SDS-PAGE分析。EBVpoly预测尺寸为25Kd。
图14：使用EBVpoly蛋白在体外扩大来自健康血清阳性供体的EBV特异性CD8+T细胞。使用或不使用EBVpoly蛋白在体外刺激来自健康供体组(n＝8)的PBMC，在IL-2存在下培养14天，然后使用ICS分析评估细胞的EBV特异性T细胞的扩大。条形图表示在使用EBVpoly蛋白刺激之后，来自每个供体的EBV特异性CD8+T细胞的比较百分比。
图15：CMV和EBV多表位蛋白的氨基酸序列和编码核酸的核苷酸序列。A：CMV多表位是SEQ ID NO:42；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：50；B：CMV多表位是SEQ IDNO：43；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：51；C：CMV多表位是SEQ ID NO：44；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：52；D：CMV多表位是SEQ ID NO：45；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：53；E：CMV多表位SEQ ID NO:46；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：54；F：CMV多表位是SEQ ID NO:47；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：55；G：CMV多表位是SEQ ID NO：48；编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：56；H：EBV多表位是SEQ ID NO：49；编码EBV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO：57。
具体实施方式
本发明至少部分地确定了意想不到的发现：即，一种分离的蛋白，其包括多个疱疹病毒表位(诸如CMV和/或EBV表位)，在作为外源蛋白施用给个体时该分离的蛋白可引起保护性的、CD8+细胞毒性T细胞应答。看上去，施用时外源蛋白是由新的、细胞TAP非依赖性的、蛋白酶体和自噬依赖性途径进行处理，这通过在外源蛋白中加入蛋白酶体释放氨基酸进行辅助。这导致处理过的CMV表位以HLA I类依赖性提呈至CD8+细胞毒性T细胞。这个意想不到的发现也至少部分涉及到避免或减少重组蛋白质聚集的改进的重组蛋白纯化方法。使用这样的蛋白通常遇到的困难在于T细胞表位为疏水的和/或包含多个疏水性氨基酸，这意味着该蛋白质易于疏水聚集，这可能损害以所述蛋白的CTL表位以上述方式被处理的方式递送所述重组蛋白的能力。使用通常是疏水性的干扰TAP识别基序使其恶化。本文中所述的改进的重组多表位蛋白纯化方法避免了或至少降低了多表位(polytope)蛋白的聚集，从而允许多表位蛋白的有效递送和处理。本发明人还发现通过在分离的蛋白中使用使用少于二十(20)个CTL表位来优化分离的多表位蛋白的生产、纯化和免疫。接着上文，本发明利用特定的免疫原性组分，如toll样受体(TLR)激动剂，增强分离蛋白质的免疫原性。
在整个本说明书中，除非另外指出，“包括(comprise)”、“含有(comprises)”和“包含(comprising)”用于包括性而非排他地，以使所述的整数或整数组可以包括一个或多个其它未述及的整数或整数组。
还应当理解的是，不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”不应理解为单数不定冠词、或者排除不定冠词所指的多于一个对象或不只是单个对象。例如，“一种”蛋白质包括一种蛋白质，一种或多种蛋白质或多种蛋白质。
在第一方面，一种分离的蛋白包括来自两个或更多不同疱疹病毒抗原的多个CTL表位每个的各氨基酸序列，所述分离的蛋白还包括在至少两个所述CTL表位之间的干扰氨基酸或氨基酸序列，所述干扰氨基酸或氨基酸序列包含蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列，以及任选地，与抗原处理相关的转运子(transporter)(TAP)识别基序，其中所述分离的蛋白通过以外源蛋白施用给动物能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
通过“分离的”，是指从其天然状态移除的、或以其它方式受到人为操作的材料。分离的材料可以是实质上或基本上不含在其自然状态下通常与之相伴的组份，或者可以被操作以便在人工状态下结合在其自然状态下通常与之相伴的组份。
如本领域中公知的，“蛋白质”是指氨基酸聚合物，其包括本领域公知的天然和/或非天然氨基酸、D-或L-氨基酸。
“肽”是具有不多于五十(50)个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是指具有多于五十(50)个氨基酸的蛋白质。
如本文所使用的，分离的蛋白可以称为分离的多表位或多表位蛋白。例如，分离的“CMV多表位”，“EBV多表位”或分离的“CMV多表位蛋白”或“EBV多表位蛋白”。
另外，在本发明的上下文中，“外源的”蛋白或多表位蛋白是动物外部产生的随后向动物施用的蛋白。有效地，外源的蛋白质是施用或可施用到动物，而不是将编码所述蛋白的核酸或遗传构建体递送至动物后通过动物原位生产或表达(例如，由动物的细胞或组织)。优选的外源的蛋白质是在分离的宿主细胞中离体产生的重组蛋白，例如细菌宿主细胞。
如本文所用，“CTL表位”是肽、或所述肽的氨基酸序列，其能够刺激或激活细胞毒性T淋巴细胞以在合适的MHC I类分子环境中识别靶细胞提呈表位。靶细胞的识别可以包括或导致细胞因子的产生(例如，IFN-γ、IL-2、MIP-1β和/或TNF)，改变细胞表面标记物表达(例如，CD107a)和/或裂解和/或杀死靶细胞。
通常，尽管非排他地，CTL表位包括源自、获自或基于相应的疱疹病毒抗原的7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸。
多表位蛋白优选地包括源自多个不同CMV蛋白抗原的多个CMV和/或EBV CTL表位。优选地，该表位为选自pp50、pp65、pp150和IE-L的CMV抗原的表位，和/或选自BMLF1、LMP2a、BRLF1、LMP2、EBNA3A、BZLF1、EBNA3C、EBNA1以及EBNA3B的EBV抗原的表位。
适当地，CMV和/或EBV多表位蛋白包括选择的CTL表位以提供群体的广泛覆盖。在人类中，这其中就包括HLAⅠ类特异性HLA-A1，-A2、-A3、-All、-A23、-A24、-A26、-A29、-A30、-B7、-B8、-B27、-B35、-B38、-B40、-B41、-B44、-B51、-B57、-B58和-cw6。
在某些实施方案中，CTL表位限制在表1或表2中显示的HLA I类特异性中。
在具体的实施方案中，CMV多表位蛋白包括多个HLA I类限制性的CTL表位，其选自表1(SEQ ID NO：1-21)或表3(SEQ ID NO：22-41)。
在具体的实施方案中，EBV多表位蛋白包括选自表3(SEQ ID NO:22-41)的多个HLAI类限制性CTL表位。
还应当理解的是，本发明考虑包含源自相同或不同疱疹病毒(如CMV和/或EBV)的CTL表位。因此，分离蛋白的一个实施方案包括来自CMV和EBV抗原两者的CTL表位。
合适地，所述多个表位包括总计少于二十个(20)表位。
在一个具体的实施方案中，所述多个表位包括总计十(10)至十五个(15)表位。
一个具体实施方案提供了一种分离的蛋白，其包含如表2所示的十三个(13)个CMVCTL表位。在一个优选实施方案中，所述表位的至少一个包括CMV氨基酸序列VTEHDTLLY(SEQID NO：11)。
全长，连续多表位蛋白包含如SEQ ID NO：42-48所示的氨基酸序列，并显示在图15A-G。
还应当理解，如在国际公开WO 03/000720所述，可以使用其它CMV CTL表位。
一个具体实施方案提供了一种分离的蛋白，其包含如在表3中所示的十三个(13)个EBV CTL表位。全长、连续的EBV多表位蛋白包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，如图15H所示。
还应当进一步理解的是，其它EBV CTL表位可以使用，如在国际公开WO95/024925；WO 97/45444；WO 99/02550和WO 04/041849所述。
分离的多表位蛋白可进一步包含一种或多种HLA II类限制性CTL表位。
本领域技术人员可以理解，可定制选择表位以适应任何人群、种族或其它个体的组。
纳入疱疹病毒多表位的其它标准包括以下：(i)具有很少或没有序列变异；(ⅱ)选自具有最少亚型的HLA；(iii)在健康血清阳性中具有高频率的CTL应答；和(iv)基于表位疏水性，其中个体表位中的新相继次序被布置为使得疏水性是沿着多表位长度均匀分布以帮助细胞间移动。
此外，应当理解的是，构成的CTL表位的特定数量和次序可以容易地改变而同时保持宽的HLA I类限制性的免疫原性。
除了CTL表位，分离的蛋白可进一步包括干扰氨基酸或氨基酸序列。干扰氨基酸或氨基酸序列可以存在于至少两个CTL表位氨基酸序列之间，或在每个相邻的CTL表位氨基酸序列之间。
适当地，干扰氨基酸或氨基酸序列相对所述的CTL表位氨基酸序列进行定位或放置以有利蛋白酶体体处理，和运送蛋白酶体产生的、各CTL表位肽进入内质网(ER)用于后续使用HLA-I类分子提呈。
在一个实施方案中，所述干扰氨基酸或氨基酸序列是蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列。
蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列的非限制性实例是或包括AD、K或R。
在一个可选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是TAP识别基序。典型地，TAP识别基序可以符合下式：(R/N：I/Q：W/Y)n，其中n是≥1的任意整数。
TAP识别基序的非限制性实例包括RIW、RQW、NIW和NQY。
在一个优选形式中，CMV和/或EBV的CTL表位通过蛋白酶体释放氨基酸序列连接或接合，任选地TAP识别基序在每个表位的羧基末端。
TAP识别基序、蛋白酶体释放氨基酸及其相对于CTL表位氨基酸序列的位置的非限制性实例分别示于表1和表2，并且也显示在图1(SEQ ID NO：58)和图15A-H(SEQ ID NO：42-49)中所示的多表位氨基酸序列中。
令人惊奇的是，一旦施用，包含干扰氨基酸或氨基酸序列的外源蛋白通过新的、细胞TAP非依赖性蛋白酶体和自噬依赖性途径进行处理。这导致处理的CMV表位经HLA I类依赖性提呈至CD8+细胞毒性T细胞。
因此，TAP氨基酸序列可以被省略或不存在，在这种情况下，建议或预期TAP-非依赖性途径可以充分地处理该分离的蛋白以促使通过HLA-I类分子进行提呈。
在另一个实施方案中，分离的多表位蛋白可进一步包括一种或多种CD4+辅助性T细胞表位。
还应当理解，本文所描述的分离的蛋白可以进行进一步的修改、变化和/或衍生过程，而不脱离本发明的概念。
氨基酸序列中的变异可以是在疱疹病毒多表位蛋白中天然存在的序列变异结果。
在本领域中可以理解，一些氨基酸可以改变为其它具有广泛相似性质而不改变分离蛋白活性性质的氨基酸(保守取代)。
通常情况下，进行保守取代以使得氨基酸性质如电荷、亲水性、疏水性和/或侧链大小或“蓬松性(bulkiness)”被保留或至少改变最少。
可以在肽合成或通过编码核酸诱变容易地实现氨基酸取代的引入。
核酸的诱变方法的非限制性实例提供在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY的第九章中,Ausubel等人,同上,Stemmer,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747,Shafikhani等人,1997,Biotechniques 23304,Jenkins等人,1995,EMBOJ.144276-4287和Zaccolo等人,1996,J.Mol.Biol.25558和试剂盒，诸如QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)和DiversifyTM随机诱变试剂盒(Clontech公司)。
通常，本发明关注的蛋白质变体个别地或组合地与组成型CTL表位序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％或甚至更优选地至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，这可以包括CTL表位的一(1)个、两(2)个、三(3)个氨基酸残基的保守变异或取代。
在本文中使用的术语“序列同一性”以其最广泛的意义包括使用标准算法进行合适的比对的精确氨基酸匹配的数目，与所述序列在比较窗中一致性的程度有关。使用计算机算法可以确定序列同一性，例如公开于Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.253389中的，如程序的GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST家族。序列分析的详细讨论见于CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的19.3单元中，Ausubel等人编.(John Wiley&Sons IncNY,1995-1999)。
如本文所用，本发明的“衍生”蛋白质已被改变，例如本领域中所理解的通过缀合、融合其它蛋白序列、通过与其它化学部分络合或通过翻译后修饰技术。
氨基酸的“附加”可包括与其它蛋白质的氨基酸序列融合，例如，协助重组蛋白纯化和/或鉴定的“融合伴侣”或“表位标签”。
融合伴侣的公知的例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS 6)，它们特别用于通过亲和层析分离融合多肽。对于通过亲和层析纯化融合蛋白的目的，用于亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽、直链淀粉、和镍或钴缀合树脂。许多这样的基质以“试剂盒”的形式提供，如用于(HIS6)融合伴侣的QIAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。
另一个本领域中公知的融合伴侣是绿色荧光蛋白(GFP)。此融合伴侣用作荧光“标签”，其允许本发明的融合蛋白以通过荧光显微镜或流式细胞仪来鉴定。当评估本发明的融合多肽的亚细胞定位时，或分离表达本发明的融合多肽的细胞时，GFP标签是有用的。流式细胞方法，如荧光激活细胞分选(FACS)在后一种应用中特别有用。
优选地，融合伴侣还具有蛋白酶切割位点，如Xa因子或凝血酶，其允许相关的蛋白酶部分消化本发明的融合蛋白，从而从其中释放本发明的重组蛋白。然后释放的蛋白质可以从通过随后的色谱分离从融合伴侣分离。
根据本发明的融合伴侣还包括在其范围内的“表位标签”，其通常为特异性抗体可用的短序列。表位标签的公知例子对于特定的单克隆抗体是容易获得的，包括c-myc、流感病毒血细胞凝集素和FLAG标签。
本发明考虑的其它衍生物包括但不限于，修饰侧链、生物素化、荧光染料修饰、在肽、多肽或蛋白质的合成中并入非天然氨基酸和/或其衍生物，使用交联剂以及加强本发明分离的蛋白构象约束的其它方法。本发明关注的侧链修饰的实例包括：氨基修饰，如通过酰化；通过O-酰基异脲形成接着进行衍生激活碳二亚胺进行的羧基修饰；巯基修饰，如通过过甲酸氧化为磺基丙氨酸方法；形成水银衍生物；形成混合二硫化物；色氨酸残基的烷基化；酪氨酸残基的硝化；以及通过烷基化进行的组氨酸残基的咪唑环修饰；而不限于此。
非天然氨基酸的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明的上述分离的蛋白。
本发明的分离的核酸可以用于在动物体内表达重组蛋白质，或在宿主细胞中用于随后重组蛋白纯化的目的。
本领域技术人员将理解可以利用遗传密码子简并性的优点以改变氨基酸序列的编码核苷酸序列。
在一个特定实例中，可以根据在生物体或细胞类型中密码子偏好或使用对核苷酸序列进行工程化从而优化在所述生物体或细胞类型中编码蛋白质的翻译和表达。
如本文所用的术语“核酸”指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA和DNA，所述DNA包括cDNA和基因组DNA。
核酸可以包括基因编码的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或经修饰的碱基如肌苷、甲肌苷(methylinosine)和甲肌腺苷(methyladenosine)、硫代和甲基胞嘧啶，而不局限于此。
如本文所用的术语“重组”是指通过人工操作遗传材料而人工产生的，例如在本领域中理解为通常落入“重组DNA技术”范围的技术。
“多核苷酸”是指具有八十(80)个或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)个连续的核苷酸。
“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，例如适当标记用于在Northern或Southern印迹中检测互补序列。
“引物”通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续的核苷酸，其能够退火到互补核酸“模板”，以及通过激活DNA聚合酶，如Taq聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或SequenaseTM以模板依赖性方式扩增。
“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
分离的核酸的一个实施例包括如SEQ ID NO:50-57中任一项所示的和在图15中所示的核苷酸序列。
根据本发明还包括分离的核酸，其编码如上所述的分离的蛋白的变体和/或衍生物。
在一些实施方案中，核酸变体编码如上所述的分离的蛋白变体。
在其它实施方案中，核酸变体编码本文所公开的分离的蛋白、或其变体，所述核酸变体采用的核苷酸序列改变由遗传密码子冗余所造成。在一种特定形式中，这种变体是“密码子优化”的以在特定生物体或细胞类型中表达。
分离的核酸变体可以与编码分离多表位蛋白的分离核酸在高严谨洗涤条件下杂交。
高严谨条件包括和包含：
(ⅰ)用于在42℃杂交的至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺、以及至少约0.01M到至少约0.15M的盐，用于在42℃洗涤的和至少约0.01M到至少约0.15M的盐；
(ⅱ)用于在65℃杂交的1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS，和用于在超过65℃的温度中洗涤约1小时的(a)0.1×SSC、0.1％SDS；或(b)0.5％BSA、1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)、1％SDS；以及
(iii)0.2×SSC、0.1％SDS用于在或超过68℃洗涤约20分钟。
在另一个实施方案中，分离核酸变体可具有与参考核酸相比的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的序列同一性。参考核酸的非限制性实例包括如SEQ ID NO：50-57中的任一项所述的核苷酸序列。
本发明的另一个方面提供了一种遗传构建体，其包括本发明的分离的核酸、或其变体。
遗传构建体可便于分离的核酸的增殖、克隆和/或表达。
在一个优选形式中，遗传构建体是表达构建体，其包括可操作地连接至存在于表达载体中的一个或多个调控序列的本发明的分离核酸。
“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体，如质粒，或整合入宿主基因组的载体。合适地，所述表达载体提供所述一个或多个调控核苷酸序列。通过“可操作地连接”是指，所述调控核苷酸序列相对于本发明的重组核酸定位以启动、调节或以其它方式控制转录。
调控核苷酸序列通常与用于表达的宿主细胞相适应。本领域已知多种类型的合适的表达载体和合适的调控序列用于多种宿主细胞。
典型地，所述一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于，启动子序列，前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和沉默子、增强子或激活序列。
对于启动子，组成型启动子(如CMV、SV40、牛痘、HTLV1和人延伸因子启动子)和诱导型/阻遏启动子(如tet-阻遏启动子和IPTG-，金属硫蛋白(metallothionin)-或蜕皮激素诱导启动子)是在本领域众所周知的并且本发明所考虑的。还应当理解的是，启动子可以是杂合的启动子，其结合一个以上的启动子元件，例如但不限于SRα启动子，其是HTLV1元件和SV40启动子的杂合体。
优选地，所述表达构建体还包括一个或多个适于选择转化的细菌目的的选择性标记(如bla、kanR和tetR)或选择转化的哺乳动物细胞目的的选择性标记(如潮霉素，G418和嘌呤霉素)。
表达构建体可以通过一些公知技术中的任一个通过转染、转化或以其它方式引入到宿主细胞中，所示公知技术包括但不是限于热休克、电穿孔、DEAE葡聚糖转染、显微注射，脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、原生质体融合、微粒轰击、病毒转化等。
合适用于蛋白质表达的条件将根据表达载体和宿主细胞的选择而变化。这很容易由本领域技术人员通过常规实验确定。
用于表达的合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞，如细菌细胞包括大肠杆菌(例如DH5α)、酵母细胞如毕赤酵母(Pichia pastoris)、在杆病毒表达系统中使用的Sf9细胞、哺乳动物细胞系，例如人胚胎肾(HEK)293细胞、CHO细胞、COS细胞、CV1细胞、Jurkat和NIH3T3细胞，而不局限于此。
本发明的另一个方面提供了一种以重组形式生产本文所公开的分离的蛋白的方法，所述方法包括在如上文所述的宿主细胞中表达分离的蛋白的步骤，以及在保持分离的蛋白在基本上非聚集形式的条件下至少部分地纯化分离的蛋白。
由本文中的“非聚集的”是指该分离蛋白质的主要部分在水溶液中(通常不存在变性剂如尿素、SDS或鈲氯化物)是可溶形式。
因为CTL表位和TAP序列的疏水性，所述分离的蛋白在细菌中的表达往往产生以包涵体的形式(IB)聚集的蛋白质。虽然IB可以溶解并用亲和基质(如Ni-NTA基质)纯化重组蛋白，然而包含二十(20)个CMV CTL表位的分离的蛋白对这种处理具有抵抗性。因此，本发明的优选形式提供了分离的蛋白，其包含少于二十(20)个CMV和/或EBV CTL表位。考虑到在表1和2中的每个CMV CTL表位包括8-13个氨基酸，少于二十(20)个CMV CTL表位相当于不到160-240个组成的、表位氨基酸。
此外，保持可溶形式的纯化的重组蛋白有困难，也是不能将多表位蛋白作为引发CD8+CTL应答的外源蛋白成功施用的主要因素。如实施例中更详细描述的，保持相容性缓冲液系统表明所述分离的多表位蛋白需要在酸性pH的MES或甘氨酸缓冲液以保持溶解。
因此，本发明的实施方案提供了以重组形式生产本文所公开的分离的蛋白的方法，所述分离的蛋白具有少于二十(20)个CMV CTL表位或160-240个组成型表位氨基酸，所述方法包括如上文所述的在细菌宿主细胞中表达所述分离的蛋白的步骤，以及在维持所述分离的蛋白基本非聚集形式的条件下至少部分地纯化所述分离的蛋白，其中所述条件包括维持分离的重组蛋白在酸性条件下在MES缓冲液中，或在甘氨酸缓冲液中。
酸性条件可以是低于7的任意pH，优选在pH 2-6范围或更优选在约pH 2.5至约pH值5.6的范围中。
生产重组蛋白质的一般指导可见于标准操作规程，例如，Sambrook等人,MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,1989)，特别是第16和第17章。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel等人编,(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2001),特别是第10和第16章；以及CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等人,(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2001，特别是第1、5和6章。
在涉及施用至人的表达构建体的实施方案中，本发明的表达构建体适用作DNA疫苗。
在特定的形式中，本发明的表达构建体可以是构建体，其利用病毒来源的表达和递送载体，如痘病毒和腺病毒或DNA质粒载体。
当作为疫苗递送系统时，病毒来源的表达构建体可以以VLP或作为“裸”核酸构建体的形式施用至动物。
在一个具体的实施方案中，根据本实施方案的表达构建体包括牛痘病毒启动子，如存在于质粒载体上的p7.5启动子。例如，如Khanna等人,1992.J Exp Med.176169所提供的，使用标记救援重组生产TK-重组牛痘病毒。
在更优选的实施方案中，本发明提供了用于在疫苗递送系统中使用的基于腺病毒的表达构建体。基于腺病毒的构建体能够感染广谱性的哺乳动物和人类细胞，包括静态和增殖细胞类型。
这种基于腺病毒的表达构建体可以包括组成型或诱导/阻遏启动子，例如通过四环素诱导型/阻遏系统的方式。
基于腺病毒表达构建体的一种形式是从至少缺乏E1基因的复制能力不足的A5腺病毒衍生的。
特别形式是Ad5/F35基于腺病毒的表达构建体，下面详细提供疫苗递送系统。还参考到Yotdna等人,2001,Gene Therapy 8 930，涉及腺病毒表达载体的Ad5/F35实施方案。
应当理解，本发明的分离的蛋白、编码其的分离的核酸和表达构建体可用于治疗性和/或预防性处理疱疹病毒相关疾病或病症，如动物中，优选人中的巨细胞病毒相关或爱泼斯坦-巴尔相关疾病和/或病症。
在人类中，CMV感染可引起伴有长期发热的单核细胞增多症样综合征，和/或温和肝炎。在某些高危人群中疾病可能会更严重，如在妊娠中胎儿的感染期间，与儿童一起工作的人中，以及在免疫功能低下者，如老年人、器官移植接受者和感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的人中。CMV也可以与一些癌症如神经胶质瘤相关联。因此，本发明提供药物组合物和/或预防或治疗CMV感染的方法，优选在人类中。
EBV感染可引起严重的单核细胞增多症，并且还与多种癌症和可能的自身免疫性疾病相关联。因此，本发明提供药物组合物和/或预防或治疗CMV感染的方法，优选在人类。
这样的药物组合物和方法适用于递送重组形式的分离的蛋白，或通过表达构建体如病毒递送载体编码的分离的蛋白。在这方面，应该理解的是，药物组合物可包含单独的分离蛋白，其分别包含CMV和EBV CTL表位，或可包含单一的分离蛋白，其包含EBV和CMV表位两者。
合适地，药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”指的是可以被安全地用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。取决于具体的施用途径，可以使用在本领域中公知的各种载体。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐的无机酸盐，和如醋酸盐、丙酸盐和丙二酸盐的有机酸)、和无致热原的水。
描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的一个有用参考是Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.NJ USA,1991)，其以引用并入本文。
可以采用任何安全的施用途径用于向患者提供本发明的组合物。例如，可采用口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮施用等。
剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊剂、栓剂、气雾剂、经皮贴剂等。这些剂型也可包括专门为此目的而设计的注射或植入控制释放装置，或经改造而用于以这种方式发挥额外作用的植入物的其它形式。治疗剂的控制释放，可以通过用疏水性聚合物包被该药剂而起作用，疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸、以及某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。此外，控制释放可通过使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球而起作用。
优选的药物组合物是“免疫原性组合物”，其引发CT：应答，从而提供对这种免疫治疗应答的疱疹病毒(例如，CMV和/或EBV)的预防和/或治疗，而不一定引发保护性免疫应答。
在一个优选形式中，所述免疫原性组合物可以是疫苗，其用于在人类受试者引发保护性的基于CD8+CTL的免疫应答以保护免受CMV感染，或治疗出现的疱疹病毒(例如，CMV和/或EBV)感染。
在一个具体实施方案中，包括免疫原性组合物和疫苗的药物组合物，包含本文所公开的分离的蛋白和所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
如将在实施例中更详细地描述，包括多个CMV和/或EBV CTL表位的分离的蛋白在病毒健康携带者中高效产生CMV特异性的CD8+T细胞应答。此外，在使用蛋白刺激后，扩大的CD8+T细胞显示出IFN-γ、TNF、MIP-1β和CD107a的强表达。建议的是，CD8+T细胞的这些功能特征对于预测CTL-介导的免疫应答和病毒清除的功效是重要的。
可选择的实施方案提供一种药物组合物，包括免疫原性组合物和疫苗，所述药物组合物包含编码本文所公开的分离蛋白的核酸表达构建体(包括DNA疫苗)和所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。根据可选择的实施方案，包括免疫原性组合物和疫苗的药物组合物可以包含表达构建体，其利用的病毒载体，例如前述的腺病毒载体或痘病毒衍生载体。
任何适宜的方法可考虑用于生产这种疫苗。示例性方法包括，例如NewGeneration Vaccines(1997,Levine等人,Marcel Dekker,Inc.New York,Basel,HongKong)中描述的那些，其通过引用并入本文。
药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性处理方法可以包括一个或多个用于施用至动物的免疫刺激分子或佐剂。
合适的免疫刺激分子和佐剂包括但不限于：TLR激动剂、脂多糖及其衍生物如MPL、弗氏完全或不完全佐剂，十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂，二甲基双十八铵溴化物、N,N-双十八基-N′、N′双(2-羟乙基丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油醇和聚醚多元醇；多胺，如吡喃、硫酸葡聚糖，聚IC羧乙烯聚合物；肽，如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸，促吞噬肽；油乳剂；和矿物凝胶，如磷酸铝，氢氧化铝或明矾；淋巴因子、咪喹莫特、Guardiquimod、QuilA和免疫刺激复合物(ISCOMS)。
药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性处理方法可以包括一个或多个其它用于施用给动物的TLR激动剂。优选地，所述一个或多个TLR激动剂包括TLR4激动剂和/或TLR9激动剂。
优选的TLR4激动剂是脂多糖(LPS)或衍生物或LPS的组分。这些包括源自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)的单磷酸脂质A和合成的TLR4激动剂，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐(AGP)。优选的TLR4激动剂是MPL。
TLR9识别特定未甲基化的CpG寡核苷酸(ODN)序列，其从哺乳动物DNA中区分出微生物DNA。CpG ODN寡核苷酸包含在特定序列环境中未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。这些CpG基序在细菌DNA中比在哺乳动物DNA具有20倍更高的频率。已经描述三种类型的刺激性ODN：A、B和C型。
TLR9激动剂的非限制性实例包括CpG ODN1826、CpG ODN2006、CpG ODN2216和CpGODN2336，虽然不局限于此。
通常，药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性治疗方法可以使用任何安全施用途径，可以采用向患者提供本发明的药物组合物。例如，口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮等也可使用。肌内和皮下注射是适当的，例如，用于施用免疫原性组合物、蛋白质(proteinacious)疫苗和DNA疫苗。
对于治疗疱疹病毒感染的方法，如CMV或EBV感染和/或与其相关的疾病或病症、或CMV或EBV感染的结果，本发明考虑过继免疫治疗。
优选地，虽然不是唯一地，发明考虑使用体外产生的自体CTL的过继免疫治疗。
目前的方法很难扩大疱疹病毒(例如，CMV或EBV)CTL，并且通常基于或者使用CMV裂解物或个体肽表位。
本发明的分离的蛋白通过促进扩大广泛关注的T细胞应答预计比任意现有技术方法更有利。
因此，扩大用于过继免疫治疗的疱疹病毒特异性CTL的方法，包括以下步骤：
(a)使分离自动物的一种或多种细胞与本文公开的分离的蛋白相接触；以及
(b)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱疹病毒特异性CTL。
此外，过继免疫治疗的方法包括施用在步骤(b)所产生的所述疱疹病毒特异性的CTL给动物的步骤，从而预防性或治疗性处理所述动物的疱疹病毒感染。
优选地，动物是哺乳动物，例如人。
在一个实施方案中，本发明提供在人中自体过继免疫治疗的方法，包括以下步骤：
(A)使分离自人的一种或多种细胞与本文公开的分离的蛋白相接触；
(B)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱疹病毒特异性CTL；以及
(C)施用所述疱疹病毒特异性CTL给所述人，从而预防或治疗性处理所述动物的疱疹病毒感染。
在具体实施方案中，所述疱疹病毒是CMV或EBV。
为了使本发明可以容易地理解并实践，具体的实施方案现在将通过下列非限制性实施例的方式加以说明。
实施例
实施例1：
CMV多表位蛋白的纯化和免疫原性
材料和方法
CMV多表位载体的构建
设计一系列CMV多表位插入体编码来自五个不同抗原(pp65、IE-1、pp50、pp150和gB)的多个HLA I类限制性的T细胞表位。这些多表位序列编码13、14、15或20个不同的HLA I类限制性的CD8+表位(参见表1)。
以这种方式设计多表位序列，以使得每个表位序列之前加上蛋白酶体释放的氨基酸序列(AD或K或R)和TAP识别基序(RIW、RQW、NIW或NQY)。此外，在每个多表位蛋白的C末端插入体六组氨酸标签以允许使用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行纯化。基于大肠杆菌的密码子利用率将每个构建体的氨基酸序列翻译成DNA序列，合成地构建所述插入体(DNA2.0，California，美国)，并在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子下克隆至表达质粒(pJexpress404)。这些合成设计的多表位构建体被转化到化学感受态大肠杆菌DH5α(Invitrogen、Carlsbad,CA,美国)，然后质粒使用QIAGEN大提试剂盒(QIAGEN,Hilden,德国)纯化。
蛋白表达
使用CMV多表位表达载体转化化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen,California,美国)。转化的细胞铺在添加100μg/mL氨苄青霉素(LB氨苄)的Luria Bertani(LB)琼脂上，然后将板在37℃孵育过夜。挑取一个分离的菌落，接种到10ml的LB氨苄培养基中，并在摇床上在37℃和200rpm下过夜生长。少量过夜培养物接种到50mL的LB氨苄肉汤中生长12小时，然后1％的培养物转移到2L的LB氨苄肉汤，然后使其生长直至O.D在600nm处达到0.6。通过加入1mM/mL的IPTG来进行CMV多表位蛋白诱导。允许这些细胞再生长4小时，通过在12-15％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析未诱导和诱导的样品来测定蛋白质表达水平。
CMV多表位蛋白纯化
在诱导阶段结束时，大肠杆菌培养物以10,000rpm离心15分钟来收集，将细胞沉淀再悬浮于补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Mannheim,德国)的80mL裂解缓冲液(25mMTris pH 7.4、0.5％Triton X100、150mM NaCl、0.5mg/mL溶菌酶)，然后孵育在冰上30分钟。通过在冰上超声4×5分钟循环进行细胞裂解，每个循环之间有10分钟的休息时间。将裂解物在13,000rpm离心30分钟，使用SDS-PAGE分析上清液和沉淀级分。由于大多数的蛋白质以包涵体(IB)的形式发现于沉淀级分中，在室温中在搅拌下使用裂解缓冲液(无溶菌酶)洗涤IB一次达两小时，然后溶解于150mL的增溶缓冲液中(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH8.0)在4℃下过夜。通过以13,000rpm离心30分钟来纯化可溶性蛋白，上清液用于多表位蛋白的纯化。
为了纯化CMV多表位蛋白，我们用5mL的Ni-NTA(QIAGEN，Hilden，德国)金属亲和层析基质。使用5倍柱体积的蒸馏水来洗涤基质，随后用3倍柱体积的增溶缓冲液来平衡。可溶性蛋白加样在该柱上，流速调节至1mL/分钟。用10倍柱体积的洗涤缓冲液1(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH 6.3)和20倍体积的洗涤缓冲液2(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH 5.9)洗出未结合的蛋白质和杂质。用洗脱缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH4.3)洗脱结合的蛋白，然后使用SDS-PAGE分析洗脱的级分。阳性的级分汇集起来，使用Bradford测定试剂盒(Bio-Rad,Hercules,California,美国)按照生产商的说明来进行CMV多表位蛋白评估。纯化的蛋白进行溶解性试验(以确定以可溶形式储存蛋白质的正确的缓冲组合物)，其中将80μL纯化的蛋白稀释至800μL的具有不同pH范围的各种组合物的缓冲液。这些包括(a)25mM MES缓冲液pH 5.6；(b)25mM MES缓冲液pH 3.2；(c)25mM MES pH4.5；(d)25mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH 4.5和400mM L-精氨酸；(e)10mM Tris和100mMNaH2Po4pH 4.3；(6)10mM Tris、100mM NaH2Po4和400mM L-精氨酸pH 4.3；(f)PBS、50mM L-精氨酸和50mM L-谷氨酸pH7.4；(g)稀释在水中；(h)100mM pH 2的甘氨酸缓冲液。将这些样品孵育在4℃下过夜，以13,000rpm离心25分钟，使用SDS-PAGE对上清液级分进行分析。CMV多表位蛋白使用25mM MES缓冲液在pH 5.6进行透析。使用Ultracel-10K离心柱((Millipore,County Cork,爱尔兰)来随后采用0.22μ膜过滤器通过无菌过滤浓缩CMV多表位蛋白，用BIO-RAD Bradford蛋白分析试剂盒来估算总蛋白，以及使用SDS-PAGE来分析各种CMV多表位蛋白的浓度以确定多表位蛋白的最终纯度。将纯化的蛋白质以1ml等分储存在-70℃中。
使用多表位蛋白体外刺激和扩大来自健康供体的CMV特异性的T细胞
来自健康的病毒携带者的外周血单核细胞(PBMC)与25μg纯化的多表位蛋白在37℃、6.5％CO 2下孵育2小时。孵育后，这些PBMC与未脉冲刺激的PBMC混合并重新悬浮在添加有10％FCS的RPMI 1640介质中(称为生长介质)。这些细胞在37℃、6.5％CO 2下培养在24孔板中达10天。在第三天和第六天，向培养物补充1mL含100U重组IL-2的生长介质。使用标准的ICS分析来评估这些体外扩大细胞的T细胞特异性。另外，还使用多参数流式细胞仪对这些培养物中的T细胞的多功能能力进行评估。
分析通过人类细胞处理和提呈的来自CMV多表位蛋白的CD8+T细胞表位
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的LCL和HEK 293细胞用作这些分析中的抗原提呈细胞。用25-100μg CMV多表位蛋白在37℃、6.5％CO2中脉冲刺激这些细胞两小时，然后用RPMI 1640介质洗涤两次，再悬浮于生长介质中，并在37℃、6.5％CO2孵育过夜。过夜孵育后，在37℃、6.5％CO2中以反应物对刺激物比率4:1下，抗原提呈细胞暴露于CMV特异性T细胞中四小时，然后使用ICS分析对于T细胞评估细胞因子表达。
酶抑制实验
为了评估参与CMV多表位蛋白处理的各种蛋白酶的作用，LCL预先用不同的抑制剂处理，然后用作抗原提呈细胞。这些抑制剂被特异性靶向以抑制溶酶体/内含体酸化(80μM氯喹和10mM巴弗洛霉素A1)、再循环途径(200μM伯氨喹)、半胱氨酸蛋白酶(100μM亮肽素和100μM E64)、酸性蛋白酶(胃蛋白酶抑制剂A)、自噬介质(10mM 3-甲基腺嘌呤(3-MA))、蛋白酶体复合物(10μM乳酸胱氨酸、1μM环氧酶素和MG132)、高尔基转运子(1μg/mL布雷菲德菌素A和0.7μg/mL莫能菌素(monensin))或氨肽酶(30μM硫醇亮氨酸(leucinethiol)以及0.5mM二硫苏糖醇(DTT))。使用这些抑制剂进行预处理，然后细胞与25μg CMV多表位蛋白在37℃、6.5％CO2中一起孵育两小时，用RPMI 1640介质洗涤两次，再悬浮于生长介质中，并在37℃、6.5％CO2孵育过夜。过夜孵育后，在37℃、6.5％CO2中在反应物对刺激物比率4:1下将细胞暴露至CMV特异的T细胞达四小时，然后使用ICS分析对于T细胞评估细胞因子表达。
使用短发夹RNA(shRNA)沉默Atg12或Sec61
编码ATG12shRNA(克隆ID NM_004707.2-485s1c1，(CCGGTGTTGCAGCTTCCTACTTCAACTCGAGTTGAAGTAGGAAGCTGCAACATTTTT；SEQ ID NO：59)或Sec61shRNA的(克隆ID NM_006808.2-410s1c1，CCGGCCCAACATTTCTTGGACCAAACTCGAGTTTGGTCCAAGAAATGTTGGGTTTTTTG；SEQ ID NO：60)的大肠杆菌宿主中的基于慢病毒的载体购自Sigma-Aldrich。使用大规模的质粒纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化编码shRNA的质粒。通过在HEK293T细胞中将shRNA载体或对照载体(pLKO.1puro)与包装载体pHR 8.2ΔR、以及包膜载体，pCMV-VSV-G(水泡性口炎病毒糖蛋白G)进行共转染来产生慢病毒。转染之后48和72小时，收获含有慢病毒的上清，0.45μm过滤，并储存在-80℃。通过在1mL含有慢病毒的上清中重悬3×105CEM.T1、CEM.T2细胞或LCL，并在800g和32℃下离心30分钟进行转导。在转导后48小时加入嘌呤霉素(1μg/mL)。使用相同的慢病毒载体在第十天再次感染细胞以产生完全敲除(knock down)，在转导后5-7天细胞用于下游分析。
Western印迹
如前所述(Ausubel 1995)，进行Western印迹分析。简言之，将慢病毒shRNA感染的细胞在PBS中洗涤，并根据制造商的说明用RIPA缓冲液在冰上裂解(Thermo Scientific,Rockford,IL,美国)。使用DC蛋白质分析试剂盒((Bio-Rad实验室,Hercules,CA,美国)对蛋白质进行定量。裂解物与SDS-PAGE上样缓冲液进行混合并在12-15％的SDS-PAGE凝胶中分离，然后转移到硝酸纤维素膜(在预冷转移缓冲液(含20％甲醇的1X Tris-甘氨酸)使用Mini Trans-Blot装置(Bio-Rad,CA,美国)在100V持续1小时。转移后，在洗涤缓冲液(含0.05％V/V吐温20的PBS)洗涤硝酸纤维素膜三次，然后在封闭缓冲液孵育(含5％脱脂乳的PBS)中，在室温下在振荡器上1小时。将膜孵育在兔抗Sec61(Thermo Scientific,澳大利亚)或兔抗ATG12((Cell Signaling Technology,Danvers,MA)的一抗溶液(在封闭缓冲液稀释)在4℃下在摇床上中过夜。用洗涤缓冲液将膜洗涤6次，每次10分钟，然后与缀合到辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗(Chemicon,澳大利亚)(在封闭缓冲液中稀释)于室温下孵育1小时。将硝酸纤维素膜在洗涤缓冲液中洗涤，使用ECL试剂(Merck,Darmstadt,德国)孵育，然后蛋白质在X射线胶片上可见。
统计分析
统计分析，使用Graph Pad软件或Microsoft Office Excel 2007进行。对于CD8+T细胞应答，计算平均值±SD并用学生t检验来确定p值。误差条表示S.E.M。用*、**和***标示之处表示与对照相比分别代表p<0.05、P<0.01和P<0.001统计学显著性。
结果
CMV多表位蛋白的纯化和表征
编码13、14、15或20个最小的CD8+T细胞表位的CMV多表位插入体如图1中所示进行设计。在表1中显示这些多表位序列中每个所包含的CMV表位的综合列表。这些CMV多表位构建体转化到大肠杆菌中，蛋白表达的条件进行了优化，并在SDS-PAGE上进行分析。从这些实验中获得的结果表明，CMV多表位蛋白(13、14、15和20mer)可以在37℃下使用在IPTG诱导启动子下的细菌表达系统成功表达(图2A&2B)。因为线性CD8+T细胞表位的疏水性，CMV多表位蛋白以包涵体(IB，数据未显示)的形式聚集。溶解这些IB和使用Ni-NTA基质来纯化来自编码13、14或15个表位的构建体的CMV多表位蛋白。这一步纯化方法使我们能够纯化这些CMV多表位蛋白至同质性(图3A-C)。然而，尽管使用两种不同的变性剂：8M尿素和6M盐酸胍溶解IB，CMV多表位20mer的纯化并未成功。溶解CMV多表位后，20mer蛋白质仍留在沉淀级分中；在洗脱级分中没有检测到蛋白质(图3D)。从鉴别维持的兼容缓冲系统的溶解度试验得到的数据表明CMV多表位蛋白需要在酸性pH的MES或甘氨酸缓冲液保持溶解(图4A)。CMV多表位纯化之后，在SDS-PAGE上分析不同浓度的蛋白以检查完整性。在图4B-D提供的数据，显示了最少杂质和重组多表位蛋白的分子量分别为约19、21和25kDa，其分别与13、14和15mer多表位的理论计算分子量匹配。这种一步纯化步骤使我们从2L培养物中得到80mg的13mer、4mg的14mer和15mg的15mer蛋白质。
使用多表位蛋白刺激后，体外扩大来自PBMC的CMV表位特异性的CD8+T细胞
为评估CMV多表位蛋白的免疫原性，我们使用各种HLA型的CMV血清阳性供体PBMC进行几个体外实验来扩大CMV特异性的CD8+T细胞。用纯化的CMV多表位蛋白体外刺激来自健康供体的PBMC，然后使用ICS分析来评估抗原特异性，并与体外应答做比较。从这些实验中获得的数据表明，13、14和15mer CMV多表位蛋白诱导对包含在多表位中的表位特异的CMV特异性的CD8+T细胞的快速扩张(图5A)。在大多数情况下，占主导地位的CD8+T细胞应答是针对包含在CMV多表位中的多个表位的。例如，在图5A中提供的数据显示在针对来自个体供体PBMC的多个表位的CMV特异性的CD8+T细胞百分比上显著增加。此外，我们还表明，CMV多表位之内的所有表位都有能力从PBMC中扩大CMV特异性的CD8+T细胞，这些应答范围从CD8+T细胞的2至40％(图5B和5C)。特别令人感兴趣的是QIK表位，我们的体外扩大的研究表明，对此表位特异的T细胞在使用多表位蛋白刺激后可以扩大(图5B)。相反，观察到极少的QEF特异性的T细胞扩大，表明该表位可能无法由人类细胞进行有效处理。这些结果清楚地表明，包含在所述多表位蛋白的CD8+T细胞表位可以由人类细胞有效的处理，并提呈，使用多表位蛋白致敏人类PBMC诱导CMV特异性T细胞的快速扩大。
使用多表位蛋白刺激之后的扩大CD8+T细胞显示多功能谱(profile)
大量的文件证据表明，多功能CD4+和CD8+T细胞应答在提供针对各种病毒和微生物病原体的预防上是至关重要的(Betts,Gray等人2006；Darrah,Patel等人2007；Millington,Innes等人2007)。另外，在CMV的上下文中，多功能CD8+T细胞在肝脏移植后防止高水平病毒复制(Nebbia,Mattes等人2008)。这些观察结果清楚地显示所述多功能性的CD8+T细胞应答是强效CMV疫苗开发的先决条件。在我们的后续实验中，我们分析由多表位蛋白扩大的CMV特异性的CD8+T细胞的效应物功能。设计这些分析以用来评估这些效应细胞进行细胞溶解功能(CD107a动员)的能力和表达多种细胞因子(IFN-γ、TNF和MIP-1β)的能力。在图6中显示来自这些分析之一的代表性数据。使用多表位扩大的大多数CMV特异性CD8+T细胞显示强的细胞溶解功能(如CD107a动员所示)，并表达多种细胞因子(IFNγ+、TNF+和MIP1β+)。
具有或不具有接头(linker)的CMV多表位构建体的合理设计、蛋白表达和纯化
为了描述间隔序列在多表位蛋白的处理和提呈中的精确作用，我们设计了编码不具有蛋白酶体接头的13个最小CD8+T细胞表位(CMVpoly)和具有蛋白酶接头的13个最小CD8+T细胞表位(CMVpoly-PL)(图7A&7B)。将CMV多表位构建体转化到大肠杆菌，优化蛋白表达的条件，并使用Ni-NTA色谱纯化多表位蛋白。从这些实验中获得的结果表明，无论是CMVpoly和CMVpoly-PL都可以成功地表达并可使用细菌表达系统纯化至均质。
体外评估具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的免疫原性
为调查CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL蛋白的处理和提呈，我们将人类淋巴母细胞系(LCL)与CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL过夜孵育，然后使用细胞内的IFN-γ分析来评估CMV特异性T细胞组的活化。在图8A呈现的代表性FACS图显示：来自CMVpoly-PL或PTL的HLA A2限制性的NLV(pp65)、HLA A1限制性的VTE(pp50)、HLA B7限制性的RPH和TPR(pp65)比CMVpoly脉冲刺激的LCL能更有效地被处理和提呈给CMV特异的T细胞。更重要的是，使用CMVpoly-PL或者CMVpoly-PTL脉冲刺激的LCL刺激之后，CMV特异性的T细胞活化比CMVpoly刺激后显著更高(图8B)。总的来说，这些数据表明，为促进对外源递送的多表位蛋白处理和提呈至抗原特异性的CD8+T细胞，需要表位之间的蛋白酶体和/或TAP接头。
通过TAP-非依赖性途径但是涉及蛋白酶体和自噬依赖性途径交叉提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位
为准确的确定来自外源加载的多表位蛋白的CD8+T细胞表位的处理和提呈途经，在下一组实验中，我们在TAP+(CEM.T1)和TAP-(CEM.T2和CEM.T2-HLA B7)LCL中脉冲刺激多表位蛋白，然后暴露这些细胞至CMV特异性T细胞。在图9中的数据表示，TAP+和TAP-B细胞都能有效地提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位。为了描述多表位提呈的机制，我们使用CEM.T1和CEM.T2细胞作为抗原提呈细胞来刺激HLA A2限制性的NLV特异性CD8+T细胞。首先用抑制剂来预处理这些抗原提呈细胞，所述抑制剂针对溶酶体/内含体酸化(氯喹和巴弗洛霉素A1)中、再循环途径(伯氨喹)、半胱氨酸蛋白酶(亮肽素和E64)以及酸性蛋白酶(胃酶抑素A)，然后使用多表位蛋白脉冲刺激。在图10A中的数据显示，不是阻断提呈多表位蛋白，而是溶酶体、再循环途径和半胱氨酸蛋白酶抑制剂显著增加使用多表位蛋白脉冲刺激的CEM.T1和/或CEM.T2细胞的T细胞识别。这些观察结果表明，使用亮肽素、E64或胃蛋白酶抑制剂A进行预处理可以保护多表位蛋白中的CD8+T细胞表位免受半胱氨酸和酸性蛋白酶的降解。出乎意料的是，氯喹和巴弗洛霉素A1对多表位蛋白的交叉提呈显示出相反效果。虽然氯喹增强了在CEM.T2细胞中的抗原提呈，而使用巴弗洛霉素A1进行预处理则显著降低了多表位脉冲刺激的抗原提呈细胞的T细胞识别(图10A)。以前的研究已经表明，巴弗洛霉素A1也是空泡H+ATP酶的强效和特异性抑制剂，并通过抑制自噬体和溶酶体之间的融合来防止自噬泡的成熟。为探索多表位蛋白处理是否可能涉及自噬途径，我们使用PI3K抑制剂、3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理抗原提呈细胞，然后暴露于CMV特异性T细胞。呈现在图10A中的数据显示3-MA处理也影响来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位的呈递。这些观察结果表明，有可能多表位蛋白的交叉提呈是通过自噬依赖性途径。
在下一组实验中，我们研究了蛋白酶体复合物在多表位蛋白交叉提呈中的潜在作用。使用蛋白酶体抑制剂乳胞素、环氧酶素和MG132预处理CEM.T1和CEM.T2细胞，然后用多表位蛋白脉冲刺激。然后，对这些细胞评估CD8+T细胞表位的提呈。在图10B中表示的数据表明，所有三种蛋白酶抑制剂完全阻断了来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位的提呈。要注意的是CD8+T细胞表位的提呈不取决于免疫蛋白酶体的表达，因为不表达蛋白水解复合物的这些成分的CEM.T2细胞，能有效地处理来自多表位蛋白的CD8+表位。我们接下来集中在分泌途径及ER驻留氨基肽酶在提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位中的潜在作用。在图10C中表示的数据表明，使用布雷菲德菌素A和莫能菌素进行预处理能显著阻断提呈给CD8+T细胞，而硫醇亮氨酸处理对CEM.T1和CEM.T2的T细胞识别影响极小。这些结果表明，多表位蛋白经由蛋白酶体依赖性而ER非依赖性途径处理，其可能涉及逆转位(retrotranslocation)途径，降解错误折叠的ER蛋白。
为进一步阐明逆转位和自噬介导的途径在多表位交叉提呈中的影响，使用慢病毒感染CEM.T1和CEM.T2细胞，所述慢病毒表达shRNA用于沉默Sec61β亚基和ATG12(自噬调节子12)基因。在图11A-C中提供的数据表明，尽管shRNA表达大大减少Sec61β亚基的表达，这种表达的缺失对来自多表位蛋白的T细胞表位提呈影响极小。相反，在CEM.T1和CEM.T2细胞两者中ATG12表达的下调显著降低对CMV多表位蛋白致敏的细胞的识别。总之，这些观察结果表明多表位蛋白的交叉提呈是通过新的途径发生的，其同时涉及蛋白酶体和自噬途径。
实施例2
结合佐剂的CMV多表位蛋白的免疫原性
材料和方法
具有MPL和CpG ODN1826的CMV多表位疫苗制剂
通过在100μL体积中每剂量混合20μg的CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL与25μg的MPL(TLR4激动剂)和50μg的CpG ODN1826(TLR9激动剂)来配制CMV多表位疫苗。TLR激动剂从InvivoGen(San Diego,CA,美国).购得。
小鼠免疫
含有具有破坏小鼠MHC I类的人HLA-A*0201的HHD 1小鼠进行饲养并在QIMR下保持在无特定病原体的条件下。所有协议都遵照QIMR动物伦理委员会。使用上述特定的佐剂组合配制的CMV多表位疫苗对每组中至少5个(M1-5)六到八周龄小鼠在尾巴的基部进行皮下免疫(s.c.)。使用相同的疫苗制剂在第21天对小鼠进行加强，以及在第35天处死小鼠，用细胞内细胞因子染色(ICS)分析来确定多表位特异性CD8+T细胞应答。
脾细胞的制备
通过CO2窒息处死小鼠，并将脾脏收集在3mL的小鼠T细胞培养介质(补充有10％FBS、100IU/mL青霉素、200μg/mL硫酸链霉素、β巯基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸钠的DMEM)中。单细胞悬浮液通过用注射器的柱塞轻轻捣碎脾脏制备。将细胞以1200rpm离心5分钟，重新悬浮于3mL的氯化铵和Tris缓冲液(0.017M Tris碱在0.89％氯化铵，pH7.4)，在室温下孵育5分钟以耗尽红细胞。将细胞离心，用含2％FBS的PBS洗涤两次并重新悬浮于5mL的小鼠T细胞培养介质中。为除去多余的组织和细胞碎片，最终细胞悬浮液通过70μm的细胞过滤网(Becton Dickinson,San Diego,美国)过滤。然后用台盼蓝排除法测定细胞存活率。
体外刺激和扩大来自免疫小鼠的CMV特异性T细胞
在37℃、6.5％CO2，在100μL小鼠T细胞培养介质中，使用1μg的HLA A2限制的NLV和VLE肽刺激来自接种小鼠的约5×106个脾细胞达2小时。孵育后，加入1mL小鼠T细胞培养介质，将细胞转移到24孔板并在37℃、6.5％CO2中培养10天。在第三天和第六天，对培养物补充1mL的含100U的重组IL-2的T细胞培养介质。使用标准的IFN-γICS分析评估这些体外扩大细胞的T细胞特异性。此外，使用多参数流式细胞仪对这些培养物中的T细胞也评估多功能能力。
细胞内细胞因子染色以评估在小鼠T细胞中的IFN-γ应答
NLV和VLE的体外刺激后，50μL的小鼠T细胞培养介质中大约2×105小鼠脾细胞加入到所需的孔中。为刺激这些细胞，加入0.2μg NLV和VLE肽，然后含有0.3μL布雷菲德菌素A的150μL DMEM(BD Pharmingen公司，圣地亚哥，CA)加入到每个孔中，并孵育在37℃、10％CO2四小时。用含2％FCS的PBS(洗涤缓冲液)洗涤细胞两次，染色由APC缀合的抗CD3，FITC缀合的抗CD4和PerCP-Cy5.5缀合的抗CD8单克隆抗体的表面重新悬浮在洗涤缓冲液并在4℃孵育30分钟。将细胞用洗涤缓冲液洗涤两次，用100μL/孔的Cytofix/Cytoperm固定并用Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后，用PE缀合的抗IFN-γ单克隆抗体在4℃下对细胞进行30分钟细胞内染色，用Perm/Wash缓冲液将细胞洗涤两次，并在BD FACSCanto II上获得。
多参数流式细胞仪评估在疫苗接种小鼠中的免疫应答
疫苗接种后，如上所述离体刺激脾细胞。将细胞用FITC-缀合的抗CD4和PerCP-Cy5.5缀合的抗CD8在4℃进行表面染色30分钟。在洗涤后，固定和透化后，使用PE缀合的抗IFN-γ、PE-Cy7缀合的抗TNF以及APC缀合的抗IL2抗体对细胞进行细胞内染色。在BDFACSCanto II上获得细胞，使用FlowJo软件和Boolean gate分析对数据进行分析。
结果
在最初的研究中，基于CMV编码的糖蛋白B(gB)和多表位蛋白的亚基疫苗制剂与人相容的TLR激动剂组合进行了测试。多表位蛋白包含多个来自CMV不同抗原的最小的HLA I类限制性的CD8+T细胞表位。这种亚基疫苗产生持久的抗病毒抗体，Th1型CD4+和CD8+T细胞应答。由疫苗诱导的体液免疫应答显示强的中和能力以及抗原特异性T细胞表达保持长期记忆的多种细胞因子。此外，这种亚基CMV疫苗，通过TLR4和TLR9的激活，激活表达IL12p70、IFN-α，IL-6和TNF-α的不同树突细胞(DC)子集，其在抗原特异性T细胞的活化中发挥关键作用。
具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的免疫原性的体内评价
为了确定CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL的免疫原性，我们接下来评价了结合TLR4和TLR9激动剂的多表位蛋白的免疫原性。使用CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL免疫表达人HLA A2MHC I类等位基因的HHD-1转基因小鼠。接种后，使用HLA A2限制性的NLV和VLE肽在体外刺激脾细胞。为分析在体外刺激的脾细胞中建立的CMV多表位特异的应答，使用细胞内IFN-γ分析来评估CMVpoly特异性(HLA A2限制性表位NLV和VLE)CD8+T细胞的存在。有趣的是，与体外数据一致的是，与使用CMVpoly疫苗制剂免疫的小鼠相比，使用CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL疫苗制剂免疫的小鼠显著地更高频率地诱导CMV多表位特异性的CD8+T细胞(图12A)。此外，还有大量的证据表明，基于T细胞疫苗的保护效力与多功能效应的频率相关。因此在随后的实验中，我们评估了CMV特异性CD8+T细胞应答的功能质量。在体外扩大来自免疫小鼠的脾细胞之后，使用多参数流式细胞仪来确定IL-2、TNF和IFN-γ生产的模式。在图12B中表示的数据清楚地表明，CD8+T细胞显示更高的多功能性；最重要的是，与使用CMVpoly疫苗相比，在使用CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL疫苗免疫的小鼠中，更高频率的CD8+T细胞是IFN-γ和TNF生产者。总之，这些观察结果清楚地表明，基于佐有TLR4和TLR9激动剂两者的CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL的CMV疫苗制剂最有效地诱导具有多功能能力的CMV特异性CD8+T细胞。
讨论
新出现的证据表明在健康CMV血清阳性个体中的CMV特异性CD8+T细胞应答针对多个CMV抗原，主要为pp65和IE1，但还针对其它结构、早期/晚期抗原和免疫调节剂(pp28、PP50、pp150、IE2gH、gB、US2、US3、US6和UL18)(Elkington,Walker等人,2003；Elkington,Shoukry等人,2004；Manley,Luy等人,2004；Khan,Bruton等人,2005；Sylwester,Mitchell等人,2005)。这些CD8+T细胞应答在对动物模型以及在人体中的CMV免疫、控制病毒复制和防止渐进感染的临床表现中发挥关键作用(Quinnan,Kirmani等人,1982；Rook,Quinnan等人,1984；Reddehase,Weiland等人,1985)。这些观察表明，可诱导针对多种抗原的T细胞应答的针对CMV的疫苗可能会加强对CMV相关疾病的防护。因此，为靶向多种抗原，特别是为诱导CD8+T细胞应答，在此研究中我们已经提出了基于多表位疫苗技术的新重组。基于多表位的疫苗提供了强效方法来诱导针对来自多个抗原的多个保守表位的免疫应答，而无需使用可包含未知或致病物的全长抗原。
通过共价连接多个HLA I类限制性T细胞表位来设计一系列CMV多表位蛋白(13mer、14mer、15mer和20mer)以增强针对在不同种族群体中若干抗原的CMV特异性的CD8+T细胞应答。在CMV多表位构建体中选择的表位源自CMV的高度保守的多个抗原，包括pp65、pp50、pp150、DNA酶和IE-1(Brytting,Wahlberg等人,1992；Retiere,Imbert等人,1998；Solache,Morgan等人,1999)。为增强CMV多表位的免疫原性，选择的CD8+T细胞表位与接头序列连接，所述接头序列由蛋白酶体释放氨基酸序列(AD或K或R)以及在每个表位的羧基末端的TAP(与抗原处理相关的转运子)识别基序(RIW、RQW、NIW或NQY)所组成。在这方面，公布的数据显示，使用氨基酸残基以提供所述多表位蛋白的蛋白酶体处理(Ishioka,Fikes等人,1999；Kuttler,Nussbaum等人,2000；Livingston,Newman等人,2001)，对于将蛋白酶体产生的肽转运进入内质网(ER)而言，TAP识别基序是必不可少的(Uebel,Wiesmuller等人,1999；Bazhan,Karpenko等人,2010)。在大肠杆菌中13mer、14mer和15mer CMV多表位蛋白成功表达为重组蛋白，并使用Ni-NTA色谱纯化。然而，由于CMV多表位20mer的高疏水性，我们试图制备该多表位的尝试是不成功。优化蛋白表达的条件和纯化方法是一致的。大约2升摇瓶培养产生相当量的多表位蛋白。
下一步，我们通过刺激健康供体PBMC来增强CMV表位特异性的CD8+T细胞的频率，从而在体外实验测试CMV多表位蛋白的免疫原性。从这些研究中的数据清楚地表明，在健康病毒携带者中，这些CMV多表位蛋白非常高效地产生CMV特异性CD8+T细胞的应答。有趣的是，我们的结果显示同时扩增多个CMV肽特异性的CD8+T细胞应答的可行性，以及在使用多表位蛋白刺激CMV特异性的CD8+T细胞后这些扩大的CD8+T细胞显示出IFN-γ、TNF、MIP-1β和CD107a的强表达。T细胞的这些功能表征在预测T细胞介导的免疫应答和病毒清除功效上高度重要[综述在((Seder,Darrah等人,2008)]。除了扩大来自健康供体的病毒特异性CD8+T细胞，我们也使用人B细胞(LCL)和上皮细胞(HEK293)测试多表位蛋白质的免疫原性。在这种情况下，由CMV多表位编码的大多数HLA限制性表位处理并有效地提呈给抗原特异性T细胞，证实了多表位蛋白通过MHC I类途径运送表位用于提呈的特性。
虽然许多研究已经表明，外源的蛋白质被内化、处理和通过MHC I类分子在抗原提呈细胞上得以提呈，但是外源加载的多表位蛋白的处理和由抗原提呈细胞的提呈从未报道过。在一般情况下，外源抗原通过树突状细胞的交叉提呈已被证明使用三个不同途径进行操作。第一个提出的模型采用将外源抗原从吞噬内体转移到细胞质的间接途径以用于蛋白酶体依赖处理。然后，将处理的肽通过经典MHC I类机制(Huang,Bruce等人,1996)装载至内质网。第二个模型是直接的、蛋白酶体非依赖途径，由此抗原得以处理并以MHC I类完全装载在内含体区室(Shen,Sigal等人,2004)。
第三种建议的模型利用内质网组分递送到内吞细胞器或将进入的抗原运送至内质网((Guermonprez,Saveanu等人,2003；Houde,Bertholet等人,2003)。事实上，在有效疫苗的开发中，针对癌症的免疫治疗以及针对自身抗原的免疫耐受以防止自身免疫中，外源抗原交叉提呈至天然CD8+T细胞是诱导细胞毒性T细胞应答的前提(Rock和Shen 2005)。因此，我们阐明了在涉及抗原提呈的不同阶段中在各种化学抑制剂的存在下通过CEM.T1和CEM.T2细胞处理并交叉提呈CMV多表位的途径。
我们的结果清楚地表明，多表位通过TAP非依赖性、蛋白酶体和自噬依赖性途径被降解成肽。使用蛋白酶体抑制剂和自噬抑制剂处理的CEM.T1和CEM.T2细胞防止CD8+T细胞表位的有效提呈，而使用溶酶体、再循环途径、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶和ER驻留氨基肽酶抑制剂则增强提呈。此外，我们还观察到在使用布雷菲德菌素A和莫能菌素处理后减少由CEM.T1和CEM.T2呈递的CD8+T细胞表位。这种效果可能是对提呈CD8+T细胞表位的间接效果，因为已知这些抑制剂是阻断新合成的MHC I分子运输到细胞表面。
因为通过蛋白酶体而不是ER抑制剂来阻断CD8+T细胞表位的处理和呈递，我们假设CD8+T细胞表位提呈经由逆转位途径介导，由此外源抗原内化到吞噬体，然后通过Sec61通道递送到胞液，在被转移到在ER中的MHC I类分子之前被蛋白酶体降解为寡肽(Ackerman,Giodini等人,2006；Rock 2006)。然而，敲除在CEM.T1和CEM.T2中的Sec61β亚基蛋白对提呈CD8+T细胞表位没什么影响，表明逆转位途径可能不参与多表位编码的CD8+T细胞表位的处理和提呈。
尽管我们没有发现逆转位途经在处理多表位蛋白中的任何证据，我们确实发现在敲除ATG12之后自噬途径作用的证据。ATG12是泛素样调节子，并且其共价缀合至另一自噬调节子ATG5，并在自噬形成和延伸中起了至关重要的作用(Mizushima,Noda等人,1998；Mizushima,Sugita等人,1998)。因此，我们的结论是通过新的TAP非依赖性、蛋白酶体和自噬依赖途径，经由CEM.T1和CEM.T2细胞来处理和提呈来自多表位蛋白的CD8+T细胞表位。
这种途径很难与以前提出的交叉提呈模型相调和，然而记录的证据表明，蛋白酶体和自噬途径之间的协作对细胞中蛋白质量控制是必不可少的(Ding,Ni等人,2007)。另外，虽然在交叉提呈的文献中从未报道过蛋白酶和自噬依赖途径，已经显示其参与内源性过表达蛋白的降解(Webb,Ravikumar等人,2003)。
因此，基于这些观察，我们推测，多表位蛋白通过新的蛋白酶体和自噬依赖途径进行处理和提呈。总之，多表位蛋白可以使用原核表达系统以稳定的形式表达为重组蛋白。这些多表位的蛋白具有高度免疫原性，并且可以优先进入蛋白酶体和自噬体相关途径同时由抗原提呈细胞交叉提呈。
实施例3
与佐剂组合的EBV多表位蛋白的免疫原性
材料和方法
EBV多表位构建体的构建
设计EBV多表位以编码来自9个不同抗原(BMLF1、BRLF1、BZLF1、LMP2、LMP2A、EBNA1、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C)的多种HLA-I类限制T细胞表位。表位HLA限制性、氨基酸序列和这些表位氨基酸位置列在表3中，以及在图13A中图示说明。
以这种方式设计多表位序列以使得每个表位序列之前有蛋白酶体释放氨基酸序列(AD或K或R)，以及六组氨酸标签插入体在每个多表位蛋白的C-末端以允许用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行纯化。每个构建体的氨基酸序列根据大肠杆菌的密码子利用率来翻译成DNA序列，然后合成地构建插入体((DNA2.0,California,美国)，并克隆到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子下的表达质粒(pJexpress 404)上。合成设计的EBV多表位被转化到化学感受态大肠杆菌DH5α((Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)中，以及对质粒使用QIAGEN大提试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)进行纯化。
蛋白表达
使用EBV多表位表达载体来转化化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen,California,美国)。转化的细胞铺在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LuriaBertani(LB)琼脂(LB-氨苄)，并将板在37℃孵育过夜。选取分离的菌落，接种到10ml的LB-氨苄肉汤并在37℃和200rpm下生长过夜。少量过夜培养物接种到50mL的LB氨苄肉汤中生长12小时，然后将1％的培养物转移到2L的LB氨苄肉汤中，之后生长直到OD在600nm处达到0.6。EBV多表位蛋白的诱导是通过加入1mM/mL的IPTG进行的。这些细胞允许再生长4小时，通过在15％的SDS-PAGE上分析未诱导和诱导的样品来确定蛋白表达水平。
EBV多表位蛋白纯化
在诱导阶段结束时，大肠杆菌的培养物通过在10,000rpm离心15分钟收获，将细胞沉淀再悬浮于补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Mannheim,德国)的80mL裂解缓冲液(pH值7.4的25mM Tris、0.5％TritonX100、150mM氯化钠，0.5mg/mL溶菌酶)，在冰上孵育30分钟。细胞裂解物在冰上以4×5分钟循环进行超声，每个循环之间有10分钟的休息时间。将裂解物在13,000rpm离心30分钟，使用SDS-PAGE分析上清液和沉淀的级分。由于大多数的蛋白质以包涵体(IB)的形式发现于沉淀级分中，在室温中在搅拌下使用裂解缓冲液(无溶菌酶)洗涤IB一次达两小时，然后溶解于150mL的增溶缓冲液中(100mM NaH2PO4、10mM Tris,8M尿素、0.5％Triton X 100、pH 8.0)在4℃下过夜。通过以13,000rpm离心30分钟来澄清可溶性蛋白，上清液用于多表位蛋白的纯化。
为了纯化EBV多表位蛋白，我们用5mL的Ni-NTA(QIAGEN，Hilden，德国)金属亲和层析基质。使用5倍柱体积的蒸馏水来洗涤基质，随后用3倍柱体积的增溶缓冲液来平衡。可溶性蛋白加样在该柱上，流速调节至1mL/分钟。用10倍柱体积的洗涤缓冲液1(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH 6.3)和20倍体积的洗涤缓冲液2(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH 5.9)洗出未结合的蛋白质和杂质。用洗脱缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素pH4.3)洗脱结合的蛋白，然后使用SDS-PAGE分析洗脱的级分，结果显示在图13B中。阳性的级分汇集起来，纯化的EBV多表位蛋白使用25mM MES缓冲液在pH3.5进行透析。在透析之后，使用Ultracel-10K离心柱((Millipore、County Cork,爱尔兰)随后采用0.22μ膜过滤器通过无菌过滤来浓缩EBV多表位蛋白。使用Bradford分析试剂盒((Bio-Rad,Hercules,California,美国))来估算最后的EBV多表位蛋白。
使用多表位蛋白体外刺激和扩大来自健康供体的EBV特异性的T细胞
来自健康的病毒携带者的外周血单核细胞(PBMC)与25μg纯化的EBV多表位蛋白在37℃、6.5％CO2下孵育2小时。孵育后，这些PBMC与未脉冲刺激(un-pulsed)的PBMC混合并重新悬浮在添加有10％FCS的RPMI 1640介质中(称为生长介质)。这些细胞在37℃、6.5％CO2下培养在24孔板中达14天。在第3、6和9天，向培养物补充1mL含100U重组IL-2的生长介质。使用标准的ICS分析来评估这些体外扩大细胞的T细胞特异性。
结果
具有蛋白酶体接头的EBV多表位蛋白的设计和纯化
已有很好使用的操作规程来设计、表达和纯化重组的多表位蛋白，以用于针对CMV的免疫治疗。在随后的研究中，我们扩展这样的方法来设计另一重组多表位蛋白以用在治疗EBV相关恶性肿瘤的免疫疗法中。特别是，在用于治疗EBV相关复发霍奇金病和鼻咽癌中，EBV特异性CD8+T细胞被认为是更有效的。然而，EBV特异性CD8+T细胞的生产有若干局限性限制，例如复杂的生产过程，以及最为常见的这种方法需要传染临床级的病毒材料，例如重组的腺病毒载体用于递送抗原至抗原提呈细胞。因此为了克服这些问题，我们设计了新的可使用的细菌表达系统来表达的EBV多表位。在图13A中概述设计的EBV多表位，其编码来自9个不同抗原(BMLF1、LMP2A、BRLF1、LMP2、EBNA3A、BZLF1、EBNA3C、EBNA1和EBNA3B)的20个最小CD8+T细胞表位，并且在多表位序列的每个表位中通过蛋白酶体接头隔开。在这些表位序列中每个所包含的EBV表位综合列表见于表3。EBV多表位构建体转化到大肠杆菌中。蛋白表达的条件进行了优化，并使用Ni-NTA基质对表达的蛋白进行纯化。与CMV多表位蛋白的结果相一致，从这些实验中获得的数据表明EBV多表位可以使用细菌表达系统成功表达，并且蛋白质可纯化至均质(图13B)。
体外评估具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的免疫原性
为了确定EBV多表位扩大EBV特异性CD8+T细胞的潜在效力，使用纯化的重组EBV多表位蛋白来刺激来自许多不同供体的PBMC。刺激后，使用细胞内细胞因子分析来评估扩大的EBV特异性CD8+T细胞。在图14中显示的数据表明，与未刺激的PBMC相比，使用EBV多表位刺激之后，有相当比例的供体显示EBV特异性CD8+T细胞的扩大。有趣的是，来自每个供体的细胞识别多个HLA I类等位基因限制性表位，大部分供体具有更高频率的针对至少3个不同表位的扩大的CD8+T细胞。
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表1：在CMV多表位13、14、15&20mer中包含的HLA-1类限制性表位的列表
表2
*CTL表位序列以粗体表示，TAP序列以斜体表示，以及蛋白酶体处理序列以下画线表示。SEQ ID NO指粗体表位序列。
表3 在EBV多表位20mer中包含的HLA-1类限制性表位的列表
整个说明书的目的是描述本发明的优选实施方案，而不限制本发明到任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，鉴于本公开内容，本领域技术人员将理解在示例的具体实施方案中可以进行各种修改和改变而不脱离本发明的范围。
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献以全文引用的方式并入本文。

Claims (33)

1.一种蛋白，其包括由i)来自两个或更多个不同的来自疱疹病毒的抗原的多个CTL表位和ii)干扰氨基酸序列组成的氨基酸序列，其中所述CTL表位中的每个被由a)AD、K和/或R中的一个或两个和任选的b)与抗原处理相关的转运子(TAP)识别基序序列组成的一个干扰氨基酸序列隔开，其中所述蛋白作为外源蛋白施用给动物时能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述CTL表位限制到HLA-I类特异性HLA-A1、-A2、-A3、-A11、-A23、-A24、-A26、-A29、-A30、-B7、-B8、-B27、-B35、-B38、-B40、-B41、-B44、-B51、-B57和/或-B58。
3.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白包括至少一个来自巨细胞病毒(CMV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的CTL表位。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述蛋白包括至少一个来自巨细胞病毒(CMV)的CTL表位，并且至少一个CMV CTL表位来自pp50、pp65、pp150和/或IE-1。
5.根据权利要求4所述的蛋白，其中至少一个CTL表位由选自SEQ ID NO:1-21所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白包括SEQ ID NO:1-13所示的CTL表位氨基酸序列的每一个。
7.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白包括SEQ ID NO:11所示的CTL表位氨基酸序列。
8.根据权利要求3所述的蛋白，其中至少一个CTL表位包括至少一个EBV CTL表位，所述EBV CTL表位源自选自以下的抗原：BMLF1、LMP2a、BRLF1、LMP2、EBNA3A、BZLF1、EBNA3C、EBNA1和EBNA3B。
9.根据权利要求8所述的蛋白，其中至少一个CTL表位由选自SEQ ID NO:22-41所示的氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述TAP识别基序具有式：(R/N:I/Q:W/Y)n，其中n为1。
12.根据权利要求1所述的蛋白，其包括少于二十(20)个的CTL表位。
13.根据权利要求12所述的蛋白，其包括十(10)个、十一(11)个、十二(12)个、十三(13)个、十四(14)个、十五(15)个、十六(16)个、十七(17)个、十八(18)个或十九(19)个CTL表位。
14.根据权利要求1所述的蛋白，其包括来自相同疱疹病毒的表位。
15.根据权利要求1所述的蛋白，其包括来自不同疱疹病毒的表位。
16.根据权利要求1所述的蛋白，其中各CTL表位之前为由AD、K和/或R中的一个或两个组成的氨基酸序列。
17.一种核酸，其编码根据权利要求1-16中任一项所述的蛋白。
18.一种遗传构建体，其包括根据权利要求17所述的核酸，所述核酸可操作地连接至表达载体中的一个或多个调控序列。
19.一种包括根据权利要求18所述的遗传构建体的宿主细胞。
20.一种产生根据权利要求1-16中任一项所述的蛋白的方法，所述方法包括在保持蛋白基本上非聚集形式的条件下至少部分纯化所述蛋白的步骤。
21.一种药物组合物，其包括(i)根据权利要求1-16中任一项所述的蛋白；(ii)根据权利要求20所述的方法所产生的蛋白；和/或(iii)根据权利要求18所述的遗传构建体；以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，还包括免疫刺激分子或佐剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述免疫刺激分子或佐剂是TLR激动剂，其包括TLR4激动剂和/或TLR9激动剂。
24.根据权利要求21所述的药物组合物，其是用于在人中引发针对疱疹病毒的保护性免疫应答的疫苗。
25.根据权利要求21所述的药物组合物，其是用于在人中引发针对CMV和/或EBV保护性免疫应答的疫苗。
26.权利要求1-16中任一项所述的蛋白，或权利要求21所述的药物组合物在制备用于预防性或治疗性处理动物中疱疹病毒感染或与疱疹病毒相关的癌症的药物中的用途。
27.权利要求1-16中任一项所述的蛋白，或权利要求21所述的药物组合物在制备用于在动物中诱导或引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答的药物中的用途。
28.权利要求1-16中任一项所述的蛋白在扩增疱疹病毒特异性CTL的体外方法中的用途，包括以下步骤：
(a)使来自动物的一种或多种细胞与根据权利要求1-16中任一项所述的蛋白相接触；以及
(b)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞体外扩增疱疹病毒特异性CTL。
29.通过权利要求28所述的方法产生的疱疹病毒特异性CTL。
30.权利要求29所述的疱疹病毒特异性CTL在制备用于预防性或治疗性处理动物中疱疹病毒感染或与疱疹病毒相关的癌症的药物中的用途。
31.权利要求29所述的疱疹病毒特异性CTL的用途，其中所述疱疹病毒特异性CTL为CMV-特异性CTL。
32.权利要求29所述的疱疹病毒特异性CTL的用途，其中所述疱疹病毒特异性CTL为EBV-特异性CTL。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的用途，其中所述动物是人。
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