JP2021036882A - 改良されたヒトヘルペスウイルス免疫療法用タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトヘルペスウイルス免疫療法のためのタンパク質を提供する。
【解決手段】単離されたタンパク質は、２つ以上の異なるヘルペスウイルス抗原に由来する複数のＣＴＬエピトープのそれぞれの対応アミノ酸配列を含み、かつ、上記ＣＴＬエピトープのうちの少なくとも２つの間に、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列および任意選択により抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）認識モチーフを含む介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含む。該単離されたタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を迅速に増殖させることができ、かつ、ｉｎ ｖｉｖｏで外因性タンパク質として動物に投与した際にＣＴＬ免疫応答を惹起することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトヘルペスウイルス免疫療法に関する。特に、本発明は、限定されるものではないが、免疫療法に使用した際に細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答を惹起することができる複数のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）抗原に由来する複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む組換えタンパク質に関する。

エプスタイン・バーウイルスは、９０％を超える成人が何らかの曝露の徴候を示すという、極めて高い罹患率で見られる。ＥＢＶはまた、一生の潜在感染として存続し、無症候性である場合もある。しかしながら、ＥＢＶは単核球症を生じることがあり、これは人によっては重い罹患を引き起こす腺熱としても知られる。ＥＢＶは、狼瘡、関節リウマチおよび多発性硬化症などのいくつかの自己免疫疾患に関連している可能性がある。重要なこととしては、ＥＢＶは、鼻咽頭癌（ＮＰＣ：ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、バーキットリンパ腫およびホジキンリンパ腫などのいくつかの癌に関連することが知られている。ＮＰＣは、中国および東南アジアの集団に多い（他の集団ではほとんど稀である）癌である。初期段階では症状が十分に認識されないことから、患者は多くの場合、軽度（ＩＩＩ期）または進行段階（ＩＶ期）の疾患を呈する。ＮＰＣと診断された際の患者の第一選択治療は放射線療法および化学療法であり、手術の選択は限られる。放射線療法／化学療法は多くの患者に効果的であるが、およそ２０％は奏功が十分でないか再発し、この群の予後は不良である。ＩＩＩ期およびＩＶ期腫瘍を呈する患者の５年全生存率は５０〜６０％に過ぎない（ＩＶ期患者だけではさらに低い）。最も多い形態のＮＰＣは、これらの腫瘍を、ＥＢＶ感染腫瘍細胞を標的として死滅させることによる免疫療法に対し修正可能（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）とするＥＢＶに関連するものである。

健常者の原発性ＣＭＶは一般に無症候性であり、潜伏状態を確立し、時折、再活性化され、粘膜表面から放出される。場合により、一次ＣＭＶ感染は、エプスタイン・バーウイルスにより引き起こされるものと同様の単核球症様疾患の臨床症状を伴うことがある。ＣＭＶが重大な罹患および死亡を招く重要な臨床状況が２つある。これらには、先天性一次感染と免疫抑制成人におけるウイルスの一次活性化または再活性化が含まれる。先天性の場合、ＣＭＶは小児における精神遅滞、および難聴などの他の異常の主因となり、この影響は米国医学研究所によるレベルＩワクチン候補［すなわち、費用および質調整生存年（ＱＡＬＹ：ｑｕａｌｉｔｙ−ａｄｊｕｓｔｅｄ ｌｉｆｅ ｙｅａｒｓ）の両方を守る最も有利な影響としてのその分類により強調された（Ａｒｖｉｎ，Ｆａｓｔ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＨＩＶ感染者などの免疫不全者におけるＣＭＶ関連の合併症は、多くの場合、ＣＤ４^＋Ｔ細胞総数が５０／μｌ以下の患者に見られる（Ｐａｌｅｌｌａ，Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓａｌｍｏｎ−Ｃｅｒｏｎ，Ｍａｚｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．２０００）。さらに、固形臓器移植レシピエントおよび同種異系造血幹細胞移植レシピエントの両方を含む移植患者におけるＣＭＶの影響は十分認識されている。

ＣＭＶへの一次曝露は強い一次免疫応答の誘導をもたらし、これが長期記憶応答として維持され、再活性化後のウイルス複製を制限する働きをする。現在、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方がＣＭＶ感染を制御する上で重要な役割を果たすという確かな証拠がある。マウスＣＭＶモデルで行われた研究では、Ｔ細胞免疫の重要性に関する最初の証拠が得られ、Ｔ細胞機能の欠如がウイルス感染の再活性化および播種の増大と同時に生じた（Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ，Ｗｅｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｍｕｔｔｅｒ，Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．１９８８）。さらに、ウイルス特異的Ｔ細胞免疫の再構築が急性ウイルス感染からの回復と同時に見られた。その後の、様々な臨床状況下でのヒトにおける研究で、ウイルス特異的Ｔ細胞の役割がさらに強調された。これらの研究では、抗ウイルスＴ細胞免疫が不十分であった同種異系幹細胞移植患者は、ＣＭＶ関連合併症を発症するリスクの上昇を示すことが示された。ＣＭＶ疾患の制御における細胞性免疫の役割についての確信的証拠は、ドナー由来ＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子移入が、抗原特異的細胞性免疫を回復させただけでなく、同種異系幹細胞移植患者のＣＭＶ関連臨床合併症を防いだという研究から得られた（Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｗａｌｔｅｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９５）。

これらの研究を考慮して、多様なＣＭＶワクチンが前臨床試験および臨床試験で評価されてきた。
これらのＣＭＶワクチンストラテジーは、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｐｐ６５およびＩＥ−１を潜在標的として評価し、これらは弱毒ＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．２００６）、全長抗原およびエピトープをコードする組換えウイルスベクター（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｒｅａｐ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｚｈｏｎｇ ａｎｄ Ｋｈａｎｎａ ２００９）、ＤＮＡワクチン（Ｗｌｏｃｈ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００８）、濃染顆粒ワクチン（Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇ，Ｐｅｐｐｅｒｌ−Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００２）、およびサブユニットワクチン（Ｄｒｕｌａｋ，Ｍａｌｉｎｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０００）を含む多くの送達プラットフォームによって送達されてきた。しかしながら、これらのアプローチで確信的な臨床有効性を示したものはなく、臨床実施に取り入れられていない。

一般に、防御的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起するためには、ウイルス抗原が、外因性として送達されるタンパク質としてではなく、核酸形態で（例えば、ウイルスベクター送達系を使用して）送達されなければならず、そうすれば、発現されたタンパク質が適切にプロセシングされ、Ｔ細胞に提示されるとの提案がなされている（Ｋｏｕｐ＆Ｄｏｕｅｋ，２０１２）。これらのワクチン送達プラットフォームの大多数、特に、弱毒生ワクチンおよびウイルスベクターに基づくワクチンは、認知される長期の理論的健康リスクなどのいくつかの規制上の懸念を浮上させた（Ｌｉｕ ；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ ２００６；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２００７）。

本発明は、安全な送達技術を用いて、ヘルペスウイルス免疫療法の開発の必要性に対処する。本発明は、発達中の胎児、ならびに固形臓器移植および造血幹細胞移植のレシピエントおよび進行したＨＩＶ疾患を有する患者などの免疫不全者に対するＣＭＶ関連傷害のリスクを軽減することを対象とする。本発明はまた、例えば免疫不全の移植患者において、または鼻咽頭癌（ＮＰＣ）などのＥＢＶ関連癌の予防または治療において、既存のＥＢＶ感染の症状を治療することも対象とする。

本発明は驚くことに、過去の仮説とは対照的に、対象に投与された外因性のポリエピトープタンパク質が防御的ＣＤ８^＋細胞溶解性Ｔ細胞応答を惹起し得るという発見から生まれた。

よって、本発明は、広義には、細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起することができる複数のヒトヘルペスウイルス細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ）エピトープを含む単離されたポリエピトープタンパク質を対象とする。

第１の態様において、単離されたタンパク質は、２つ以上の異なるヘルペスウイルス抗原に由来する複数のＣＴＬエピトープのそれぞれの対応アミノ酸配列を含み、かつ、前記ＣＴＬエピトープの少なくとも２つの間に、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列および任意選択により抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）認識モチーフを含む介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含み、前記単離されたタンパク質は、外因性タンパク質として動物に投与した際に細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答を惹起することができる。

好適には、該単離されたタンパク質は、広いヒト集団被覆率を提供するように選択されたエピトープを含む。これらには、ＨＬＡクラスＩ特異性ＨＬＡ−Ａｌ、−Ａ２、−Ａ３、−Ａｌｌ、−Ａ２３、−Ａ２４、−Ａ２６、−Ａ２９、−Ａ３０、−Ｂ７、−Ｂ８、−Ｂ２７、−Ｂ３５、−Ｂ３８、−Ｂ４０、−Ｂ４１、−Ｂ４４、−Ｂ５１、−Ｂ５７および−Ｂ５８が含まれる。

好適には、前記複数のエピトープは、合計２０個未満のエピトープを含む。
一実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶである。好ましくは、ＣＴＬエピトープは、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ１５０およびＩＥ−ｌのうちから選択されるＣＭＶ抗原に由来する。

好ましい実施形態では、単離されたタンパク質は、表１（配列番号１〜２１）から選択される複数のＣＴＬエピトープを含む。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、表２（配列番号１〜１３）から選択される複数のＣＴＬエピトープを含む。

好ましい実施形態では、ＣＴＬエピトープの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号１１）を含む。
別の実施形態では、ヘルペスウイルスはＥＢＶである。

好ましくは、ＣＴＬエピトープは、ＢＭＬＦ１、ＬＭＰ２ａ、ＢＲＬＦ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＢＺＬＦ１、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１およびＥＢＮＡ３Ｂのうちから選択されるＥＢＶ抗原に由来する。

好ましい実施形態では、単離されたタンパク質は、表３（配列番号２２〜４１）から選択される複数のＣＴＬエピトープを含む。
また、単離されたタンパク質は同じまたは異なるヘルペスウイルス（例えば、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ）由来のＣＴＬエピトープを含んでよいと考えられる。

単離されたタンパク質は、介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含んでよい。
好ましい実施形態では、介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列である。

任意選択の実施形態では、介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）認識モチーフである。
第２の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。

第３の態様において、本発明は、第２の態様の単離された核酸を含む遺伝子構築物を提供する。
好ましくは、遺伝子構築物は、前記第２の態様の単離された核酸が発現ベクター中に存在する１つ以上の調節配列に作動可能に連結されている発現構築物である。

一実施形態において、発現構築物は、単離されたタンパク質を、その後精製される組換えタンパク質としてｉｎ ｖｉｔｒｏで製造するのに好適な発現ベクターを含む。
第４の態様において、本発明は、第３の態様の発現構築物を含む宿主細胞を提供する。

別の実施形態では、宿主細胞は、続いての第１の態様の単離されたタンパク質をその後精製する目的で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて発現構築物でトランスフェクションされているか、形質転換されているか、または他の方法で発現構築物を導入されている。

第５の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質を生産する方法を提供し、前記方法は、第４の態様の宿主細胞内で単離されたタンパク質を発現させる工程、および前記単離されたタンパク質を実質的に非凝集形態で維持する条件下で、前記単離されたタンパク質を少なくとも部分的に精製する工程を含む。

第６の態様において、本発明は、第５の態様の方法に従って生産された単離されたタンパク質を提供する。
第７の態様において、本発明は、第１もしくは第６の態様の単離されたタンパク質または第３の態様の遺伝子構築物と、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

好ましくは、医薬組成物は、動物においてＣＭＶおよび／またはＥＢＶ感染に関連する疾患または病態の予防的処置または治療的処置において使用するために好適な免疫原性組成物である。

より好ましくは、免疫療法組成物は、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶに対する防御免疫応答を惹起するためのワクチンである。これに関して、医薬組成物は、それぞれＣＭＶ ＣＴＬエピトープおよびＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む別個の単離されたタンパク質を含んでもよいし、またはＥＢＶエピトープとＣＭＶエピトープの両方を含む単一の単離されたタンパク質を含んでもよいと考えられる。

１つの特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の免疫刺激性分子またはアジュバントをさらに含む。
好適には、免疫刺激性分子またはアジュバントは、１つ以上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ：ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニストを含む。

好ましくは、ＴＬＲアゴニストとしては、ＴＬＲ４アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストが含まれる。
好ましいアジュバントとしては、限定されるものではないが、モノホスホリル脂質（ＭＰＬ）および／または免疫刺激性ＤＮＡ、例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６、ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６および／またはＣｐＧ ＯＤＮ２３３６が含まれる。

第８の態様において、本発明は、動物においてヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する方法であって、前記動物に第１もしくは第６の態様の単離されたタンパク質、または第７の態様の医薬組成物を投与し、それにより、前記動物におけるヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する工程を含む方法を提供する。

特定の実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶまたはＥＢＶである。
第９の態様において、本発明は、動物において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘導する方法であって、前記動物に第１もしくは第６の態様の単離されたタンパク質、または第７の態様の医薬組成物を投与し、それにより、前記動物において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘導または惹起する工程を含む方法を提供する。

第１０の態様において、本発明は、養子免疫療法用のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる方法であって、
（ｉ）動物から単離された１つ以上の細胞を第１または第６の態様の単離されたタンパク質と接触させる工程、および
（ｉｉ）前記１つ以上の細胞を培養し、それにより、前記１つ以上の細胞由来のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる工程
を含む方法を提供する。

特定の実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶまたはＥＢＶである。
第１１の態様において、本発明は、第１０態様の工程（ｉｉ）で生産された前記ＣＭＶ特異的ＣＴＬを動物に投与し、それにより、前記動物のＣＭＶ感染を予防的にまたは治療的に処置する工程を含む養子免疫療法を提供する。

特定の実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶまたはＥＢＶである。
第１２の態様において、本発明は、動物におけるヘルペスウイルス感染の予防的処置または治療的処置に使用するための、第１もしくは第６の態様の単離されたタンパク質、または第３の態様の遺伝子構築物を提供する。

特定の実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶまたはＥＢＶである。
好ましくは、上述の態様によれば、動物は哺乳類である。
より好ましくは、動物はヒトである。

本発明がより容易に理解できるよう、また、実効下に置けるように、本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照しながら、単に例として説明する。

ＣＭＶポリエピトープおよび下流プロセシングの設計の例示。ＣＭＶポリエピトープ２０マーコード配列の設計を一例として示す。個々のエピトープアミノ酸配列を太字で示す；エピトープ配列の後のグレーの斜体の文字は、プロテアソームによるＣＭＶポリエピトープタンパク質のプロセシングのためのアミノ酸残基を表し、下線のアミノ酸配列は、ＴＡＰのモチーフ（ＣＭＶポリ−ＰＴＬと呼ばれる）を表す。ＣＭＶポリエピトープタンパク質をコードするＤＮＡ配列は合成により作製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）誘導性プラスミドｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４にクローニングし、大腸菌へ形質転換し、タンパク質発現および精製を行った。 ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質の発現および精製。１３、１４、１５または２０個のＣＭＶ ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含むＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質を発現するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへ形質転換した。タンパク質発現をＩＰＴＧで誘導し、誘導前後のサンプルを、ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分析した。パネルＡおよびＢは、大腸菌におけるＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質の発現を示す：レーン１は分子量マーカー（ｋＤａ）；レーン２、４および６は誘導が行われていない大腸菌細胞溶解液；レーン３、５および７は誘導が行われた大腸菌細胞溶解液。^＊は、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質を示す。 Ｎｉ ＮＴＡカラムでのＣＭＶポリ−ＰＴＬ精製後の、精製されたＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。種々の精製段階からのサンプルをＳＤＳＰＡＧＥにより分析した。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質（１３マー、１４マー、１５マーおよび２０マー）の精製を表す。全てのＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに関して、レーン１：分子量マーカー。レーン２：ロード前の可溶化タンパク質。レーン３：フロースルー。レーン４：洗液。レーン５、６、７および８：溶出画分。^＊は、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質を示す。 可溶性タンパク質としてのＣＭＶポリ−ＰＴＬ保存に適合するバッファー系を決定するための、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質溶解度試験および特性決定。精製タンパク質を、ｐＨ域が異なる種々のバッファー組成物で希釈し、４℃ Ｏ／Ｎでインキュベートし、遠心分離し、上清画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。パネルＡ：レーン１：分子量マーカー。レーン２：２５ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーｐＨ５．６で希釈。レーン３：２５ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ３．２で希釈。レーン４：２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ４．５で希釈。レーン５：２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ４．５および４００ｍＭ Ｌアルギニンで希釈。レーン６：１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭ ＮａＨ_２Ｐｏ_４ ｐＨ４．３で希釈。レーン７：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＨ_２Ｐｏ_４および４００ｍＭ ＬアルギニンｐＨ４．３で希釈。レーン８：ＰＢＳ、５０ｍＭ Ｌ−アルギニンおよび５０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ｐＨ７．４で希釈。レーン９：水で希釈。レーン１０：１００ｍＭグリシンバッファーｐＨ２で希釈。パネルＢ、ＣおよびＤは、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質純度分析を示す。ＣＭＶポリ−ＰＴＬポリエピトープタンパク質（１３マー、１４マーおよび１５マー）をＭＥＳバッファーｐＨ５．６に対して透析した後、種々の濃度の各タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、最終的な純度および分解産物を観察した。 ＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＰＢＭＣをＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質で刺激した後のＣＭＶ特異的Ｔ細胞の増殖：種々の健康なＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＰＢＭＣをｅｘ ｖｉｖｏにて組換えＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質（１３、１４および１５マー）で刺激し、組換えＩＬ２の存在下で１０日間培養した。増殖した、ＩＦＮ−γを産生するペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳアッセイを用いて求め、ＦＩｏｗＪｏを用いて結果を解析した。パネルＡは、ＰＢＭＣをＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質有またはなしで刺激した後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖したＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の代表的ＦＡＣＳプロットを示す。パネルＢおよびＣは、ＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質（１３、１４および１５マー）で刺激した後に、異なる個体に由来するＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させたものの分析の全体像を示す。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質で刺激した後に増殖したＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の規模および質：ＰＢＭＣをＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質（１３マー）で刺激した後、細胞をマルチパラメータフローサイトメトリーにより分析し、エフェクター機能に関して評価した。細胞溶解機能（ＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカー）および細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦおよびＭＩＰ １β）を示すＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度をＦＩｏｗＪｏで分析し、ＳＰＩＣＥプログラムを用い、多機能サイトカイン産生細胞をプロットした。円グラフのデータは個々のエピトープに関して示され、円グラフの各切片はそれぞれの可能性のある機能の組合せを表す。 リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープタンパク質構築物の基本設計とタンパク質精製：パネルＡは、リンカーを用いないＣＭＶポリエピトープタンパク質の設計を示す（配列番号４６）（ＣＭＶポリと称する）。パネルＢは、プロテアソームリンカーを用いたポリエピトープタンパク質の設計を示す（配列番号４７）（ＣＭＶポリ−ＰＬと称する）。各選択的ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ配列を斜体の太字で示す。ＣＭＶポリ−ＰＬについては、各エピトープ配列は、プロテアソーム分解の標的となるアミノ酸残基（赤で示す）によって分離されている。ＣＭＶポリエピトープタンパク質をコードするＤＮＡ配列をＩＰＴＧ誘導性プラスミドｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４にクローニングし、タンパク質発現用の大腸菌へ形質転換した。ポリエピトープタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。 リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープタンパク質のプロセシングおよび提示のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価：パネルＡは、ヒト細胞によるＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬおよびＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差提示を示す。ＥＢＶで形質転換したＬＣＬをＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質（各２５μｇ）で２時間パルス刺激し、洗浄し、一晩インキュベートした後、ＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ（ｐｐ６５）、ＨＬＡ Ａ１拘束ＶＴＥ（ｐｐ５０）、ＨＬＡ Ｂ８拘束ＥＬＲ（ＩＥ１）、ＨＬＡ Ｂ７拘束ＲＰＨ（ｐｐ６５）およびＨＬＡ Ｂ７拘束ＴＰＲ（ｐｐ６５）エピトープに特異的なＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に曝した。ＦＡＣＳプロットは、ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質でパルス刺激したＬＣＬと共培養した後の、ＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ発現を示す。パネルＢは、ＣＭＶポリ（白いバー）、ＣＭＶポリ−ＰＬ（黒いバー）またはＣＭＶポリ−ＰＴＬ（グレーのバー）でパルス刺激したＬＣＬと共培養した後の、ＩＦＮ−γを産生するＣＭＶエピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の平均±ＳＥＭを示す。誤差は±ＳＥＭを表す。^＊＊または^＊＊＊は、スチューデントの両側ｔ検定によって計算された統計学的有意性を示す（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０００１）。 ヒト細胞によるＣＭＶポリエピトープタンパク質の交差提示の分析：ＣＭＶポリエピトープタンパク質の交差提示におけるペプチド輸送体（ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２）の役割を特定するために、ＴＡＰ１＆２＋細胞（ＣＥＭ．Ｔ１）およびＴＡＰ１＆２−細胞（ＣＥＭ．Ｔ２またはＣＥＭ．Ｔ２ ＨＬＡ Ｂ７）をＣＭＶ−ＰＴＬタンパク質で２時間パルス刺激し、洗浄し、一晩インキュベートし、ＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ（ｐｐ６５）またはＨＬＡ Ｂ７拘束ＴＰＲ（ｐｐ６５）エピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に曝した。パネルＡは、ＣＭＶポリエピトープタンパク質に事前感作させたＣＥＭ．Ｔ１細胞の曝露の後のＮＬＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγの発現を示す。パネルＢおよびＣは、ＣＭＶポリエピトープタンパク質に感作させたＣＥＭ．Ｔ２およびＣＥＭ．Ｔ２ ＨＬＡ Ｂ７細胞それぞれに曝した後、ＩＦＮ−γを発現するＮＬＶおよびＴＰＲ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。パネルＡ、ＢおよびＣに示されるデータは、２回の独立した実験からの１つの代表的実験である。 ポリエピトープタンパク質のプロセシングおよび提示に及ぼす種々の化学的阻害剤の影響：ＣＥＭ．Ｔ１細胞およびＣＥＭ．Ｔ２細胞を、ＣＭＶ−ＰＴＬタンパク質とのインキュベーション前に、非処理とするか、または自己貪食阻害剤（３−ＭＡ）、リソソーム／エンドソーム阻害剤（クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１）、リサイクル経路阻害剤（プリマキン）、システインプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチンまたはＥ６４）または酸性プロテアーゼ阻害剤（ペプスタチンＡ）（パネルＡ）、プロテアソーム阻害剤、ラクタシスチン、エポキソミシンおよびＭＧ１３２（パネルＢ）、および小胞体アミノペプチダーゼ阻害剤（ロイシンチオール＋ＤＴＴ）またはその対照（ＤＤＴ単独）またはゴルジ阻害剤（ブレフェルジンＡまたはモネンシン）（パネルＣ）で前処理した。細胞を洗浄し、各阻害剤の存在下で１２時間培養した後、ＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ（ｐｐ６５）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に曝し、その後、ＩＣＳアッセイによりＩＦＮ−γ発現を評価した。それぞれに示されるデータは、ＣＭＶ−ＰＴＬ感作ＣＥＭ．Ｔ１細胞（白いバー；Ｔ１と示す）およびＣＥＭ．Ｔ２細胞（黒いバー；Ｔ２と示す）に曝した後の抗原特異的Ｔ細胞による相対的ＩＦＮ−γ発現を表す。データは、トリプリケートで行った２回の独立した実験の平均を表す。エラーバーは±ＳＥＭを表す。^＊または^＊＊は、両側スチューデント検定によって計算された統計学的有意性を示す（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。 ポリエピトープタンパク質の交差提示に及ぼすＳｅｃ６１およびＡＴＧ１２ ｓｈＲＮＡの影響：ＣＥＭ Ｔ１細胞およびＣＥＭ Ｔ２細胞に、Ｓｅｃ６１βサブユニットもしくはＡＴＧ１２のｓｈＲＮＡをコードする組換えレンチウイルス、または対照ベクター（ｐＬＫＯ）を用いて形質導入を行い、Ｒ１０培地で２日間培養し、ピューロマイシン中で７日間選択した後、抗原提示細胞として使用した。パネルＡおよびＤは、ｓｈＲＮＡの形質導入後のＣＥＭ．Ｔ１細胞およびＣＥＭ．Ｔ２細胞におけるＳｅｃ６１およびＡＴＧ１２タンパク質発現のウエスタンブロット解析を示す。ＧＡＰＤＨをタンパク質ロードに関する対照として使用した。パネルＢ〜Ｆは、Ｓｅｃ６１およびＡＴＧ１２ ｓｈＲＮＡレンチウイルスまたは対照ベクターを用いて形質導入を行ったＣＥＭ．Ｔ１細胞およびＣＥＭ．Ｔ２細胞をＣＭＶポリ−ＰＴＬに感作させたものに曝した後の、ＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの発現を示す。 ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬおよびＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質の免疫原性のｉｎ ｖｉｖｏ評価：ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質の免疫原性を評価するために、一用量当たり１００μＬ容量中に２０μｇのタンパク質を２５μｇのＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）および５０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６とともに配合した。０日目に、６〜８週齢のＨＬＡ Ａ２トランスジェニックマウスに皮下免疫を行い、２１日目に追加免疫用量を同じ配合で与えた。３５日目にマウスを屠殺し、脾細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩＬ−２の存在下、ＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ（ｐｐ６５）およびＨＬＡ Ａ２拘束ＶＬＥ（ＩＥ−１）ペプチドエピトープで１０日間刺激した後、ＩＣＳアッセイを用いてサイトカイン発現を評価した。パネルＡは、ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬに基づくワクチン製剤で免疫した後のＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。パネルＢは、ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質によるワクチン接種後の、種々の組合せのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦおよび／またはＩＬ−２）を発現するＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対パーセンテージを示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。^＊は統計学的有意性を示す（ｐ＜０．０５）。 プロテアソームリンカーを用いたエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ポリエピトープ構築物の基本設計およびタンパク質精製。パネルＡは、プロテアソームリンカーを用いたＥＢＶポリエピトープタンパク質（ＥＢＶポリと称する）の設計を示す。各選択的ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ配列を斜体と下線で示す。ＥＢＶポリについては、各エピトープ配列は、プロテアソーム分解の標的となるアミノ酸残基（赤で示す）によって分離されている。パネルＢは、ＥＢＶポリタンパク質の精製を示す。ＥＢＶポリタンパク質をコードするＤＮＡ配列をＩＰＴＧ誘導性プラスミドｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４にクローニングし、タンパク質発現用の大腸菌へ形質転換した。ＥＢＶポリタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。ＥＢＶポリの推定サイズは２５Ｋｄであった。 ＥＢＶポリタンパク質を用いた、健康な血清陽性ドナー由来のＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖。健康なドナーのパネル（ｎ＝８）に由来するＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにてＥＢＶポリタンパク質有りまたはなしで刺激し、ＩＬ−２の存在下で１４日間培養した後、細胞を、ＩＣＳアッセイを用いてＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖に関して評価した。棒グラフは、ＥＢＶポリタンパク質で刺激した後の各ドナー由来の増殖したＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の相対的パーセンテージを表す。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４２であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５０である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４３であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５１である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４４であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５２である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４５であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５３である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４６であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５４である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４７であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５５である。 ＣＭＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＣＭＶポリトープは配列番号４８であり、ＣＭＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５６である。 ＥＢＶポリエピトープタンパク質のアミノ酸配列およびコード核酸のヌクレオチド配列。ＥＢＶポリトープは配列番号４９であり、ＥＢＶポリトープをコードするヌクレオチド配列は配列番号５７である。

本発明は、少なくとも一部には、外因性タンパク質として個体に投与される、ＣＭＶエピトープおよび／またはＥＢＶエピトープなどの複数のヘルペスウイルスエピトープを含む単離されたタンパク質が防御的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起し得るという予期しない発見に基づく。ひと度投与されると、外因性タンパク質は、外因性タンパク質内にプロテアソーム遊離アミノ酸が含まれることで補助される、新規な、細胞ＴＡＰ非依存的、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路によってプロセシングされると考えられる。この結果、プロセシングを受けたＣＭＶエピトープの、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞へのＨＬＡクラスＩ依存的提示がなされる。この予期されない発見はまた、少なくとも一部には、組換えタンパク質の凝集を回避または軽減する、改良された組換えタンパク質精製法にも関連する可能性がある。このようなタンパク質が一般に直面する問題は、Ｔ細胞エピトープが疎水性であり、かつ／またはいくつかの疎水性アミノ酸を含むということであり、これはこのタンパク質が疎水性凝集を受けやすいことを意味し、このタンパク質のＣＴＬエピトープが上記の様式でプロセシング可能であるような方法においては、組換えタンパク質の送達能が損なわれるおそれがある。これは、一般に疎水性である介在ＴＡＰ認識モチーフを使用することにより悪化する。本明細書に記載の改良された組換えポリエピトープタンパク質精製法は、ポリトープタンパク質の凝集を回避するか、または少なくとも軽減し、それにより、ポリエピトープタンパク質の効率的送達およびプロセシングを可能とする。本発明者らはまた、単離されたポリエピトープタンパク質の生産、精製およびそれによる免疫誘導が、単離されたタンパク質内に２０個未満のＣＴＬエピトープを使用することによって最適化されることも見出した。上記に加え、本発明は、単離されたタンパク質の免疫原性を増強するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの特定の免疫原性成分を利用する。

本明細書を通して、特に断りのない限り、「を含む」は、排他的にではなく包含的に使用され、従って、記載された整数または整数群は、記載されていない他の１つ以上の整数または整数群を含み得る。

また、不定冠詞「１つの」は、単数形の不定冠詞として、またはそうでなければその不定冠詞が指す１つを超えるもしくは単一を超える対象を排除するものとして読まれるべきでないということも認識されるであろう。例えば、「１つの」タンパク質には、１つのタンパク質、１つ以上のタンパク質または複数のタンパク質が含まれる。

第１の態様において、単離されたタンパク質は、２つ以上の異なるヘルペスウイルス抗原に由来する複数のＣＴＬエピトープのそれぞれの対応アミノ酸配列を含み、かつ、前記ＣＴＬエピトープの少なくとも２つの間に、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列および任意選択により抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）認識モチーフを含む介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含み、前記単離されたタンパク質は、外因性タンパク質として動物に投与した際に細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答を惹起することができる。

「単離された」とは、その天然状態から取り出されたか、または他の方法で人の操作を受けた材料を意味する。単離された材料は、その天然状態でそれに通常付随している成分を実質的または本質的に含んでいなくてもよいし、またはその天然状態でそれに通常付随している成分とともに人工的状態となるように操作されていてもよい。

「タンパク質」とは、当技術分野で周知のように、天然および／または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。
「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。

「ポリペプチド」は、５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質である。
本明細書で使用する場合、単離されたタンパク質は、単離されたポリエピトープまたはポリトープタンパク質、例えば、単離された「ＣＭＶポリエピトープ」、「ＥＢＶポリエピトープ」または単離された「ＣＭＶポリエピトープタンパク質」または「ＥＢＶポリエピトープタンパク質」と呼ばれる場合がある。

本発明に関して、「外因性」タンパク質またはポリエピトープタンパク質は、それがその後投与された動物に対して外的に産生されるタンパク質である。効果的には、外因性タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸または遺伝子構築物が動物に送達された後に、動物によってｉｎ ｓｉｔｕで（例えば、動物の細胞または組織によって）産生または発現されるのではなく、動物に投与されるかまたは投与可能である。好ましい外因性タンパク質は、細菌宿主細胞などの単離された宿主細胞においてｅｘ ｖｉｖｏで産生される組換えタンパク質である。

本明細書で使用する場合、「ＣＴＬエピトープ」は、適当なＭＨＣクラスＩ分子を介してエピトープを提示する標的細胞を認識するように細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激または活性化することができるペプチド、またはペプチドのアミノ酸配列である。標的細胞の認識は、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１βおよび／もしくはＴＮＦ）、細胞表面マーカー発現（例えば、ＣＤ１０７ａ）の変化、ならびに／または標的細胞の溶解および／もしくは標的細胞を殺すことを含み得るか、またはそれらをもたらし得る。

排他的ではないが一般に、ＣＴＬエピトープは、対応するヘルペスウイルス抗原の、または前記抗原に由来する、または前記抗原から得られた、または前記抗原に基づく、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続するアミノ酸を含む。

ポリエピトープタンパク質は、好ましくは、複数の異なるＣＭＶタンパク質抗原に由来する複数のＣＭＶおよび／またはＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む。好ましくは、エピトープは、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ１５０およびＩＥ−ｌのうちから選択されるＣＭＶ抗原、ならびに／またはＢＭＬＦ１、ＬＭＰ２ａ、ＢＲＬＦ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＢＺＬＦ１、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１およびＥＢＮＡ３Ｂのうちから選択されるＥＢＶ抗原のものである。

好適には、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶポリエピトープタンパク質は、集団に対して広い被覆率を提供するように選択されたＣＴＬエピトープを含む。ヒトでは、これらには、ＨＬＡクラスＩ特異性ＨＬＡ−Ａｌ、−Ａ２、−Ａ３、−Ａｌｌ、−Ａ２３、−Ａ２４、−Ａ２６、−Ａ２９、−Ａ３０、−Ｂ７、−Ｂ８、−Ｂ２７、−Ｂ３５、−Ｂ３８、−Ｂ４０、−Ｂ４１、−Ｂ４４、−Ｂ５１、−Ｂ５７、−Ｂ５８および−ｃｗ６が含まれる。

特定の実施形態では、ＣＴＬエピトープは、表１または表２に示されるＨＬＡクラスＩ特異性に拘束される。
特定の実施形態では、ＣＭＶポリエピトープタンパク質は、表１（配列番号１〜２１）または表３（配列番号２２〜４１）から選択される複数のＨＬＡクラスＩ拘束ＣＴＬエピトープを含む。

特定の実施形態では、ＥＢＶポリエピトープタンパク質は、表３（配列番号２２〜４１）から選択される複数のＨＬＡクラスＩ拘束ＣＴＬエピトープを含む。
また、本発明が同じまたは異なるヘルペスウイルス（例えば、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ）に由来するＣＴＬエピトープの包含を企図することも認識されるであろう。従って、単離されたタンパク質の一実施形態は、ＣＭＶ抗原およびＥＢＶ抗原の両方に由来するＣＴＬエピトープを含む。

好適には、前記複数のエピトープは、合計２０個未満のエピトープを含む。
特定の実施形態では、前記複数のエピトープは、合計１０〜１５個のエピトープを含む。

１つの特定の実施形態は、表２に示されるものなどの１３個のＣＭＶ ＣＴＬエピトープを含む単離されたタンパク質を提供する。好ましい実施形態では、前記エピトープの少なくとも１つは、ＣＭＶアミノ酸配列ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号１１）を含む。

全長連続ポリエピトープタンパク質は、配列番号４２〜４８で示され、かつ、図１５Ａ〜Ｇに示されるアミノ酸配列を含む。
また、国際公開第０３／０００７２０号に記載されているものなどの他のＣＭＶ ＣＴＬエピトープを使用してもよいことも認識されるであろう。

１つの特定の実施形態は、表３に示されるものなどの１３個のＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む単離されたタンパク質を提供する。全長連続ＥＢＶポリエピトープタンパク質は、図１５Ｈに示されるように、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む。

さらにまた、国際公開第９５／０２４９２５号；第９７／４５４４４号；第９９／０２５５０号および第０４／０４１８４９号に記載されているものなどの他のＥＢＶ ＣＴＬエピトープを使用してもよいことも認識されるであろう。

単離されたポリエピトープタンパク質は、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ拘束ＣＴＬエピトープをさらに含んでよい。
当業者には、選択されたエピトープが任意の集団、人種または他の個体群に適合するように調整可能であることが認識されるであろう。

ヘルペスウイルスポリエピトープの他の包含基準としては、（ｉ）配列変異が最小であるかまたは皆無であるもの；（ｉｉ）サブタイプが最小のＨＬＡから選択されるもの；（ｉｉｉ）健康な血清陽性者においてＣＴＬ応答頻度が高いもの；および（ｉｖ）エピトープ疎水特性に基づくものであって、個々のエピトープの新規な順序が、細胞内移行を補助するようにポリエピトープの長さに沿って疎水性が均一に分布されるように配置されているものが含まれる。

さらに、広いＨＬＡクラスＩ拘束免疫原性を保持しつつ、構成ＣＴＬエピトープの特定の数および順序は容易に変更可能であることも認識されるであろう。
ＣＴＬエピトープに加え、単離されたタンパク質は、介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含み得る。介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、前記ＣＴＬエピトープアミノ酸配列の少なくとも２つの間に、または各隣接ＣＴＬエピトープアミノ酸配列の間に存在し得る。

好適には、介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、ＣＴＬエピトープアミノ酸配列に対して、プロテアソームプロセシングを可能とするために、かつ、プロテアソームにより生成された個々のＣＴＬエピトープペプチドをその後のＨＬＡ−Ｉ分子による提示のために小胞体（ＥＲ）へ輸送するように、配置または局在される。

一実施形態では、介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列である。
プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列の限定されない例は、ＡＤ、ＫまたはＲであるか、またはそれらを含む。

任意選択の実施形態では、介在アミノ酸またはアミノ酸配列は、ＴＡＰ認識モチーフである。一般に、ＴＡＰ認識モチーフは、下式：（Ｒ／Ｎ：Ｉ／Ｑ：Ｗ／Ｙ）_ｎ（式中、ｎは１以上の任意の整数である）に従うものとすることができる。

ＴＡＰ認識モチーフの限定されない例としては、ＲＩＷ、ＲＱＷ、ＮＩＷおよびＮＱＹが挙げられる。
好ましい形態では、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ ＣＴＬエピトープは、各エピトープのカルボキシル末端で、プロテアソーム遊離アミノ酸配列および任意選択によりＴＡＰ認識モチーフにより連結または結合されている。

ＴＡＰ認識モチーフ、プロテアソーム遊離アミノ酸およびＣＴＬエピトープアミノ酸配列に対するそれらの位置の限定されない例は表１および表２に示され、それらはまた図１（配列番号５８）および図１５Ａ〜Ｈ（配列番号４２〜４９）に示されるポリエピトープアミノ酸配列中にも存在する。

驚くことに、ひと度投与されれば、介在アミノ酸またはアミノ酸配列を含む外因性タンパク質は、新規な、細胞ＴＡＰ非依存的、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路によってプロセシングされる。この結果、プロセシングを受けたＣＭＶエピトープの、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞へのＨＬＡクラスＩ依存的提示がなされる。

よって、ＴＡＰアミノ酸配列は、削除可能であるかまたは不在であってもよく、この場合、前記ＴＡＰ非依存的経路は、単離されたタンパク質を、ＨＬＡ−Ｉ分子による提示を可能とするように十分プロセシングすることができるものと提案または予想される。

別の実施形態では、単離されたポリエピトープタンパク質は、１つまたは複数のＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞エピトープをさらに含み得る。
また、本明細書に記載の単離されたタンパク質は、本発明の概念から逸脱することなく、さらなる修飾、変更および／または誘導体化を施すことができることも認識されるであろう。

アミノ酸配列の変更は、ヘルペスウイルスポリエピトープタンパク質における天然に存在する配列変動の結果であり得る。
いくつかのアミノ酸は、単離されたタンパク質の活性の性質を変化させずに、広範囲に類似する特性を有する他のアミノ酸に変更可能であること（保存的置換）は、当技術分野において十分理解されている。

一般に、保存的置換は、電荷、親水性、疎水性および／または側鎖のサイズまたは「嵩高さ」などのアミノ酸特性が保持される、または少なくとも変更が最小限となるように行われる。

アミノ酸置換の導入は、ペプチド合成中に、またはコード核酸の突然変異誘発によって容易に達成され得る。
核酸突然変異誘発法の限定されない例は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹのＣｈａｐｔｅｒ ９，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前掲、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１ １０７４７、Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３ ３０４、Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４ ４２７６−４２８７およびＺａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５ ５８ならびにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＤｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）ランダム突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのキットに提供されている。

一般に、本発明は、構成要素であるＣＴＬエピトープ配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％またはいっそうより好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質変異体を個々にまたは組み合わせて企図する。他の実施形態では、これは、ＣＴＬエピトープの１、２または３個のアミノ酸残基の保存的変更または置換を含み得る。

用語「配列同一性」は、本明細書において、標準的なアルゴリズムを用いて適当なアラインメントを考慮し、ある比較ウインドウにわたって配列が同一である程度を考慮して、正確なアミノ酸一致の数を含むように最も広義に使用される。配列同一性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５ ３３８９により開示されるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ系列のプログラムなどのコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。配列解析の詳細な考察は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹのＵｎｉｔ １９．３ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ，１９９５−１９９９）に見出すことができる。

本明細書で使用する場合、本発明の「誘導体」タンパク質は、例えば、付加的タンパク質配列とのコンジュゲーション、融合によるか、他の化学部分との複合体形成によるか、または当技術分野で理解できるであろう翻訳後修飾技術によって変更されている。

アミノ酸の「付加」は、組換えタンパク質の精製および／または同定を補助する「融合相手」または「エピトープタグ」などの他のタンパク質のアミノ酸配列との融合を含み得る。

融合相手の周知の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ_６）が挙げられ、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離に特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を目的としたアフィニティークロマトグラフィー用の適切なマトリックスは、それぞれグルタチオン、アミロース、およびニッケルまたはコバルトと結合させた樹脂である。このようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ_６）融合相手を用いる場合に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「キット」の形態で入手可能である。

当技術分野で周知の別の融合相手は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合相手は、本発明の融合タンパク質を蛍光顕微鏡によりまたはフローサイトメトリーにより識別可能とする蛍光「タグ」として機能する。ＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞内局在を評価する場合、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を単離するために有用である。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）などのフローサイトメトリー法は、この後者の適用において特に有用である。

好ましくは、融合相手はまた、適切なプロテアーゼに本発明の融合タンパク質を部分的に消化させ、それにより、それから本発明の組換えタンパク質を遊離させる、因子Ｘ_ａまたはトロンビンに関するものなどのプロテアーゼ切断部位も有する。次に、遊離したタンパク質は、続いてクロマトグラフィー分離によって融合相手から単離することができる。

本発明による融合相手はまた、それらの範囲内に通常は短い配列である「エピトープタグ」を含み、このエピトープタグに対する特異的抗体が入手可能である。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能なエピトープタグの周知の例としては、ｃ−ｍｙｃ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンおよびＦＬＡＧタグが挙げられる。

本発明により企図される他の誘導体としては、限定されるものではないが、側鎖の修飾、ビオチン化、蛍光色素による修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、架橋剤の使用および本発明の単離されたタンパク質に立体的制約を課す他の方法の使用が挙げられる。本発明により企図される側鎖修飾の例としては、限定されるものではないが、アシル化によるなどのアミノ基の修飾；Ｏ−アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミドの活性化とその後の誘導体化によるカルボキシル基の修飾；システイン酸への過ギ酸酸化などの方法によるスルフヒドリル基の修飾；水銀誘導体の形成；混合二硫化物の形成；トリプトファン残基のアルキル化；チロシン残基のニトロ化；およびヒスチジン残基のイミダゾール環のアルキル化による修飾が挙げられる。

非天然アミノ酸の例としては、限定されるものではないが、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられる。

別の態様において、本発明は、本発明の上述の単離されたタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の単離された核酸は、動物においてｉｎ ｖｉｖｏでの、またはその後の組換えタンパク質精製のために宿主細胞での、組換えタンパク質発現に有用であり得る。

当業者には、アミノ酸配列のコードヌクレオチド配列を変更するには遺伝コードの縮重を利用できることが認識されるであろう。
特定の例では、ヌクレオチド配列は、生物または細胞種のコドン選好または利用頻度に従って操作し、それにより、その生物または細胞種においてコードされるタンパク質の翻訳および発現を最適化し得る。

用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡ（前記ＤＮＡはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）を表す。
核酸は、限定されるものではないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの遺伝的にコードされている塩基、またはイノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン、チオウリジンおよびメチルシトシンなどの修飾塩基を含み得る。

用語「組換え」は、本明細書で使用する場合、例えば当技術分野で十分に理解されているような「組換えＤＮＡ技術」の範囲に一般に入る技術を含む、ヒトによる遺伝物質の操作を介して人為的に生産されることを意味する。

「ポリヌクレオチド」は、８０個以上の連続するヌクレオチドを有する核酸であり、一方、「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続するヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えば、ノーザンまたはサザンブロット法において相補配列を検出する目的で適宜標識された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。

「プライマー」は、通常、好ましくは１５〜５０個の連続するヌクレオチドを有し、相補的核酸「鋳型」にアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用によって鋳型依存的様式で延長され得る一本鎖オリゴヌクレオチドである。

「増幅産物」は、核酸増幅技術によって生成された核酸産物を指す。
単離された核酸の一実施形態は、配列番号５０〜５７のいずれか１つで示され、かつ、図１５に示されるようなヌクレオチド配列を含む。

また、上記のような単離されたタンパク質の変異体および／または誘導体をコードする単離された核酸も本発明により企図される。
いくつかの実施形態では、核酸変異体は、上記のような単離されたタンパク質の変異体をコードする。

他の実施形態では、核酸変異体は、本明細書に開示される単離されたタンパク質、またはその変異体をコードし、前記核酸変異体は遺伝コードの冗長性のためにヌクレオチド配列変化を採っている。１つの特定の形態では、このような変異体は、特定の生物または細胞種における発現のために「コドンの最適化」がなされる。

単離された核酸変異体は、単離されたポリエピトープタンパク質をコードする単離された核酸と、高ストリンジェンシー洗浄条件下でハイブリダイズし得る。
高ストリンジェンシー条件は、
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションのためには、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、４２℃での洗浄のためには、少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションのためには、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、６５℃を超える温度で約１時間の洗浄のためには、（ａ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ；および
（ｉｉｉ）６８℃以上で約２０分間の洗浄のためには、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
を含み、包含する。

別の実施形態では、単離された核酸変異体は、参照核酸と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。参照核酸の限定されない例としては、配列番号５０〜５７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む。

本発明の別の態様は、本発明の単離された核酸またはその変異体を含む遺伝子構築物を提供する。
遺伝子構築物は、単離された核酸の増幅、クローニングおよび／または発現を容易にすることができる。

好ましい形態では、遺伝子構築物は、発現ベクター中に存在する１つ以上の調節配列に作動可能に連結された本発明の単離された核酸を含む発現構築物である。
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクターか、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。好適には、発現ベクターは、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列を提供する。「作動可能に連結される」とは、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列が本発明の組換え核酸に対して、転写を開始する、調節する、またはその他の方法で制御するように配置されることを意味する。

調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適当なものである。多くのタイプの適当な発現ベクターおよび好適な調節配列が、多様な宿主細胞に関して当技術分野で公知である。

一般に、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにサイレンサー、エンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得る。

プロモーターに関しては、構成プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ワクシニア、ＨＴＬＶ１およびヒト延長因子プロモーター）および誘導／抑制性プロモーター（例えば、ｔｅｔ抑制性およびＩＰＴＧ誘導性、メタロチオネイン誘導性またはエクジソン誘導性プロモーター）が当技術分野で周知であり、本発明により企図される。また、プロモーターは、限定されるものではないが、ＨＴＬＶ１プロモーター要素とＳＶ４０プロモーター要素の間のハイブリッドであるＳＲαプロモーターなど、２種類以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターであってよいことも認識されるであろう。

好ましくは、前記発現構築物はまた、形質転換細菌の選択のために好適な１つ以上の選択マーカー（例えば、ｂｌａ、ｋａｎＲおよびｔｅｔＲ）または形質転換哺乳類細胞の選択のために好適な１つ以上の選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン、Ｇ４１８およびピューロマイシン）も含む。

発現構築物は、限定されるものではないが、熱ショックによる形質転換、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラスト融合、微粒子銃、ウイルス形質転換などを含む、多くの周知の技術のいずれかによって、宿主細胞にトランスフェクト、形質転換またはその他の方法で導入することができる。

タンパク質発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なる。これは、当業者により、通常の実験によって容易に確認される。
発現に好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、ＤＨ５α）を含む細菌細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞、バキュロウイルス発現系とともに使用されるＳｆ９細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、ＪｕｒｋａｔおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞株であり得るが、これらに限定されない。

本発明の別の態様は、本明細書で開示される単離されたタンパク質を組換え形態で生産する方法を提供し、前記方法は、単離されたタンパク質を上記のような宿主細胞内で発現させる工程、および前記単離されたタンパク質を実質的に非凝集形態で維持する条件下で、前記単離されたタンパク質を少なくとも部分的に精製する工程を含む。

この文脈で「非凝集」とは、単離されたタンパク質の実質的部分が、水溶液中、一般に、尿素、ＳＤＳまたは塩化グアニジニウムなどの変性剤の不在下で可溶性形態にあることを意味する。

ＣＴＬエピトープ配列およびＴＡＰ配列の疎水性のため、細菌における単離されたタンパク質の発現は、封入体（ＩＢｓ：ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）の形態で凝集したタンパク質を生じる傾向にある。ＩＢｓは可溶化が可能であり、また、組換えタンパク質はアフィニティーマトリックス（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス）を用いて精製可能であるが、単離されたタンパク質は、２０個のＣＭＶ ＣＴＬエピトープを含む場合、この処理に抵抗を示した。従って、本発明の好ましい形態は、２０個未満のＣＭＶおよび／またはＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む単離されたタンパク質を提供する。表１および２の各ＣＭＶ ＣＴＬエピトープが８〜１３個のアミノ酸を含んでいるので、２０個未満のＣＭＶ ＣＴＬエピトープは１６０〜２４０個未満の構成エピトープアミノ酸に相当する。

さらに、精製された組換えタンパク質を可溶性形態で維持することは難しく、これがＣＤ８^＋ＣＴＬ応答を惹起する外因性タンパク質としてポリエピトープタンパク質を上手く投与することができないことへの寄与因子となっていた。実施例にさらに詳細に記載されるように、維持のための適合バッファー系は、単離されたポリエピトープタンパク質が可溶性を維持するために酸性ｐＨのＭＥＳバッファーまたはグリシンバッファーを必要とすることを示した。

従って、本発明の一実施形態は、本明細書で開示される単離されたタンパク質を組換え形態で生産する方法を提供し、前記単離されたタンパク質は２０個よりも少ないＣＭＶＣＴＬエピトープまたは１６０〜２４０個の構成エピトープアミノ酸を有し、前記方法は、単離されたタンパク質を上記のような細菌宿主細胞内で発現させる工程、および前記単離されたタンパク質を実質的に非凝集形態で維持する条件下で、前記単離されたタンパク質を少なくとも部分的に精製する工程を含み、前記条件は、酸性条件下のＭＥＳバッファーまたはグリシンバッファー中で前記単離された組換えタンパク質を維持することを含む。

酸性条件は、７未満のいずれのｐＨであってもよく、好ましくは、ｐＨ２〜６の範囲またはより好ましくは約ｐＨ２．５〜約ｐＨ５．６の範囲である。
組換えタンパク質生産の一般的指針は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、特に第１６節および第１７節；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５−２００１）、特に第１０章および第１６章；およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．編， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５−２００１、特に第１章、第５章および第６に記載されているような標準的プロトコールに見出すことができる。

ヒトに投与するための発現構築物に関する実施形態では、本発明の発現構築物は、ＤＮＡワクチンとしての使用に好適である。
特定の形態において、本発明の発現構築物は、ポックスウイルスおよびアデノウイルスまたはＤＮＡプラスミドベクターなどのウイルス起源の発現および送達ベクターを使用する構築物であり得る。

ワクチン送達系として使用する場合、ウイルス起源の発現構築物はＶＬＰの形態でまたは「裸の」核酸構築物として動物に投与され得る。
１つの特定の実施形態では、この実施形態による発現構築物は、プラスミドベクター中に存在するｐ７．５プロモーターなどのワクシニアウイルスプロモーターを含む。例えば、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６ １６９で提供されるようなマーカーレスキュー組換えを用いたＴＫ組換えワクシニアウイルスの生産がある。

より好ましい実施形態では、本発明は、ワクチン送達系における使用のためのアデノウイルスに基づく発現構築物を提供する。アデノウイルスに基づく構築物は、静止細胞種および増殖細胞種の両方を含む広域の哺乳類およびヒト細胞に感染することができる。

このようなアデノウイルスに基づく発現構築物は、構成または誘導性／抑制性プロモーターを含んでよく、例えばテトラサイクリン誘導／抑制系の方式による。
アデノウイルスに基づく発現構築物の一形態は、少なくともＥ１遺伝子を欠く複製不能Ａ５アデノウイルスに由来する。

特定の形態はＡｄ５／Ｆ３５アデノウイルスに基づく発現構築物であり、ワクチン送達系は以下に詳細に示す。また、アデノウイルス発現ベクターのＡｄ５／Ｆ３５の具体例に関しては、Ｙｏｔｄｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８ ９３０も参照されたい。

本発明の単離されたタンパク質、単離された核酸およびそれをコードする発現構築物は、動物、好ましくはヒトにおけるヘルペスウイルス関連疾患または病態、例えば、サイトメガロウイルス関連またはエプスタイン・バー関連疾患および／または病態の治療的処置および／または予防的処置において有用であり得ることが認識されるであろう。

ヒトにおいて、ＣＭＶ感染は、長期発熱および／または軽度の肝炎を伴う単核球症様症候群を引き起こし得る。ある特定の高リスク群、例えば、妊娠段階の胎児、小児とともに活動する人々、ならびに高齢者、臓器移植レシピエントおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者などの免疫不全者の感染中では、疾患はより重篤となり得る。ＣＭＶはまた、神経膠腫などの一部の癌に関連する可能性がある。従って、本発明は、好ましくはヒトにおける、ＣＭＶ感染の医薬組成物および／または予防的処置または治療的処置方法を提供する。

ＥＢＶ感染は、重篤な単核球症を引き起こすことがあり、多様な癌およびおそらくは脂肪性肝炎障害にも関連がある。従って、本発明は、好ましくはヒトにおける、ＣＭＶ感染の医薬組成物および／または予防的処置または治療的処置方法を提供する。

このような医薬組成物および方法は、組換え形態での、またはウイルス送達ベクターの場合などの発現構築物によりコードされている、単離されたタンパク質の送達に好適である。これに関して、本医薬組成物は、それぞれＣＭＶおよびＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む別個の単離されたタンパク質を含んでもよく、またはＥＢＶおよびＣＭＶエピトープの両方を含む単一の単離されたタンパク質を含んでもよいことが認識されるであろう。

好適には、医薬組成物は、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。
「薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与に安全に使用され得る固体もしくは液体の増量剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の多様な担体が使用可能である。これらの担体は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、および塩（例えば、塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸）および発熱性物質除去水を含む群から選択され得る。

薬学上許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載している有用な参照文献は、本明細書の一部として援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）である。

本発明の組成物を患者に提供するためには、安全ないずれの経路を使用してもよい。例えば、経口投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、頬側投与、静脈内投与、関節内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、吸入投与、眼内投与、腹腔内投与、脳室内投与および経皮投与が使用可能である。

投与形としては、錠剤、分散剤、懸濁液、注射剤、溶液、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアゾール、経皮パッチなどが含まれる。これらの投与形は、この目的で特に設計された徐放性デバイス、またはさらにこの様式でも機能するように改良された他の形態のインプラントを注射または移植することも含み得る。治療薬の放出制御は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびある種のセルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む疎水性ポリマーでそれをコーティングすることによって達成され得る。加えて、放出制御は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用することによっても達成され得る。

好ましい医薬組成物は、それに対するＣＴ：応答を惹起することによって、必ずしも防御免疫応答を惹起することなく、そのような免疫療法に応答性のあるヘルペスウイルス（例えば、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ）の予防的処置および／または治療的処置を提供する「免疫原性組成物」である。

好ましい形態では、免疫原性組成物は、ヒト対象において、ＣＭＶ感染から防御する、または既存のヘルペスウイル（例えば、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ）感染を治療する、防御的なＣＤ８^＋ＣＴＬに基づく免疫応答を惹起するためのワクチンであり得る。

１つの特定の実施形態では、免疫原性組成物およびワクチンを含めた医薬組成物は、本明細書で開示される単離されたタンパク質と前記の薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む。

実施例にさらに詳細に記載されるように、複数のＣＭＶおよび／またはＥＢＶ ＣＴＬエピトープを含む単離されたタンパク質は、健康なウイルス保有者においてＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を生じさせる効率が高い。さらに、増殖したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、そのタンパク質で刺激した後にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＭＩＰ−１βおよびＣＤ１０７ａの強い発現を示した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞のこれらの機能的特徴はＣＴＬ媒介性の免疫応答およびウイルスクリアランスの有効性を予測するために重要であることが提案される。

別の実施形態は、本明細書で開示される単離されたタンパク質をコードする核酸発現構築物（ＤＮＡワクチンを含む）と前記の薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、免疫原性組成物およびワクチンを含めた医薬組成物を提供する。この別の実施形態によれば、免疫原性組成物およびワクチンを含めた医薬組成物は、上記のようなアデノウイルスベクターまたはポックスウイルス由来ベクターなどのウイルスベクターを使用する発現構築物を含み得る。

このようなワクチンを生産するために任意の好適な手順が企図される。例示的手順としては、例えば、本明細書の一部として援用されるＮｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）に記載されているものが含まれる。

医薬組成物、免疫原性組成物、ワクチンおよび／または予防的処置または治療的処置の方法は、動物に投与するための１つ以上の免疫刺激性分子またはアジュバントを含み得る。

好適な免疫刺激性分子およびアジュバントとしては、限定されるものではないが、ＴＬＲアゴニスト、リポ多糖類およびＭＰＬなどのそれらの誘導体、フロイントの完全または不完全アジュバント、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール；ピラン、デキストラン硫酸、ポリＩＣカーボポールなどのポリアミン；ムラミルジペプチドおよび誘導体、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチド；オイルエマルション；およびリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンなどの無機ゲル；リンホカイン、イミキモド、ガーディキモド（Ｇｕａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ＱｕｉｌＡおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ：ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）が含まれる。

医薬組成物、免疫原性組成物、ワクチンおよび／または予防的処置または治療的処置の方法は、動物に投与するための１つ以上の他のＴＬＲアゴニストを含み得る。好ましくは、１つ以上のＴＬＲアゴニストとしては、ＴＬＲ４アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストが含まれる。

好ましいＴＬＲ４アゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＬＰＳの誘導体もしくは成分である。これらには、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）由来のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））およびリン酸アミノアルキルグルコサミニド（ＡＧＰ）などの合成ＴＬＲ４アゴニストが含まれる。好ましいＴＬＲ４アゴニストはＭＰＬである。

ＴＬＲ９は、哺乳類ＤＮＡから細菌ＤＮＡを識別する特定の非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を認識する。ＣｐＧ ＯＤＮオリゴヌクレオチドは、特定の配列コンテキスト（ＣｐＧモチーフ）中に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。これらのＣｐＧモチーフは、細菌ＤＮＡには哺乳類ＤＮＡの２０倍の頻度で存在する。刺激性ＯＤＮのタイプはすでに記載されている：タイプＡ、ＢおよびＣ。

ＴＬＲ９アゴニストの限定されない例としては、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６、ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６およびＣｐＧ ＯＤＮ２３３６が挙げられるがこれらに限定されない。

一般に、医薬組成物、免疫原性組成物、ワクチンおよび／または予防的処置または治療的処置の方法は、本発明の組成物を患者に与えるために使用可能ないずれの安全な投与経路を使用してもよい。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などが使用可能である。例えば、免疫原性組成物、タンパク質性ワクチンおよびＤＮＡワクチンの投与には筋肉内注射および皮下注射が適当である。

ＣＭＶもしくはＥＢＶ感染などのヘルペスウイルス感染および／またはＣＭＶもしくはＥＢＶ感染に関連する、もしくはこれらから生じる疾患もしくは病態の処置の方法に関して、本発明は養子免疫療法を企図する。

排他的ではないが好ましくは、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された自己ＣＴＬを用いた養子免疫療法を企図する。
ヘルペスウイルス（例えば、ＣＭＶまたはＥＢＶ）ＣＴＬを増殖させるための現行法は非常に難しく、ＣＭＶ溶解液かまたは個々のペプチドエピトープのいずれかの使用に基づく場合が多い。

本発明の単離されたタンパク質は、広い標的のＴ細胞応答の増大を補助することにより、これらの従来技術のアプローチのいずれよりも有利であると思われる。
よって、養子免疫療法用のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる方法は、
（ａ）動物から単離された１つ以上の細胞を本明細書で開示される単離されたタンパク質と接触させる工程、および
（ｂ）前記１つ以上の細胞を培養し、それにより、前記１つ以上の細胞由来のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる工程
を含む。

さらに、養子免疫療法は、工程（ｂ）で生産された前記ヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを動物に投与し、それにより、前記動物のヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する工程を含む。

好ましくは、動物は、ヒトなどの哺乳類である。
一実施形態では、本発明は、
（Ａ）ヒトから単離された１つ以上の細胞を本明細書で開示される単離されたタンパク質と接触させる工程、
（Ｂ）前記１つ以上の細胞を培養し、それにより、前記１つ以上の細胞由来のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる工程、および
（Ｃ）前記ヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを前記ヒトに投与し、それにより、前記動物のヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する工程
を含む、ヒトにおける自己養子免疫療法を提供する。

特定の実施形態では、ヘルペスウイルスはＣＭＶまたはＥＢＶである。
本発明がより容易に理解できるよう、また、実効下に置けるように、以下、特定の実施形態を下記の限定されない実施例により説明する。

実施例
実施例１
ＣＭＶポリエピトープタンパク質の精製および免疫原性
材料および方法
ＣＭＶポリエピトープベクターの構築
一連のＣＭＶポリエピトープインサートを、５つの異なる抗原（ｐｐ６５、ＩＥ−１、ｐｐ５０、ｐｐ１５０およびｇＢ）由来の複数のＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするように設計した。これらのポリエピトープ配列は、１３、１４、１５または２０個の異なるＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８^＋エピトープをコードしていた（表１参照）。

ポリエピトープ配列を、各エピトープ配列の前にプロテアソーム遊離アミノ酸配列（ＡＤまたはＫまたはＲ）およびＴＡＰ認識モチーフ（ＲＩＷ、ＲＱＷ、ＮＩＷまたはＮＱＹ）がくるように設計した。さらに、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラムを用いた精製が可能となるように、各ポリエピトープタンパク質のＣ末端にヘキサヒスチジンタグを挿入した。各構築物のアミノ酸配列を大腸菌コドン使用頻度に基づきＤＮＡ配列に翻訳し、インサートを合成構築し（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州、ＵＳＡ）、発現プラスミド（ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４）のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラニシド（ＩＰＴＧ：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｉｓｉｄｅ）誘導性プロモーター下にクローニングした。これらの合成設計したポリエピトープ構築物を化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に形質転換し、プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。

タンパク質発現
化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）をＣＭＶポリエピトープ発現ベクターで形質転換した。形質転換細胞を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＬＢ−Ａｍｐ）を添加したルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天上に播種し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。単離されたコロニーを採取し、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐブロスに植え込み、３７℃、２００ｒｐｍのシェーカーで一晩増殖させた。少量の一晩培養物を５０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐブロスに植え込み、１２時間増殖させた後、培養物の１％を２ＬのＬＢ−Ａｍｐブロスに移植し、その後、６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．６となるまで増殖させた。ＣＭＶポリエピトープタンパク質誘導は、１ｍＭ／ｍＬのＩＰＴＧを加えることにより行った。これらの細胞をさらに４時間増殖させ、１２〜１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で非誘導サンプルと誘導サンプルを分析することにより、タンパク質発現レベルを決定した。

ＣＭＶポリエピトープタンパク質精製
誘導期の終了時に、大腸菌培養物を１０，０００ｒｐｍで１５分の遠心分離により採取し、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を添加した８０ｍＬの溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解は、氷上で４×５分サイクルの音波処理により行い、各サイクル間に１０分の中断を設けた。この溶解液を１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清およびペレット画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。タンパク質の大部分はペレット画分中に封入体（ＩＢ）の形態で見られたので、ＩＢを、撹拌下、室温で２時間、溶解バッファー（リゾチーム不含）で１回洗浄し、１５０ｍＬの可溶化バッファー（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素 ｐＨ８．０）中、４℃で一晩、可溶化した。可溶性タンパク質を１３，０００ｒｐｍで３０分の遠心分離により清澄化し、上清をポリエピトープタンパク質の精製に用いた。

ＣＭＶポリエピトープタンパク質を精製するために、本発明者らは、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）金属アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを用いた。このマトリックスを５カラム容量の蒸留水で洗浄した後、３カラム容量の可溶化バッファーで平衡化した。可溶性タンパク質をこのカラムにロードし、流速を１ｍＬ／分に調整した。非結合タンパク質および不純物を１０カラム容量の洗浄バッファー１（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ６．３）および２０カラム容量の洗浄バッファー２（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ５．９）で洗い流した。結合タンパク質は溶出バッファー（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ４．３）で溶出させ、溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。陽性画分をプールし、ＣＭＶポリエピトープタンパク質評価は、ブラッドフォードアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）を製造者の指示に従って用いて行った。精製タンパク質に対して溶解度試験を行い（タンパク質を可溶性形態で保存するために適切なバッファー組成物を特定するため）、ここでは、８０μＬの精製タンパク質をｐＨ範囲の異なる種々のバッファー組成物８００μＬで希釈した。これらは、（ａ）２５ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ５．６；（ｂ）２５ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ３．２；（ｃ）２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ４．５；（ｄ）２５ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ４．５および４００ｍＭ Ｌ−アルギニン；（ｅ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ４．３；（６）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および４００ｍＭ Ｌ−アルギニンｐＨ４．３；（ｆ）ＰＢＳ、５０ｍＭ Ｌ−アルギニンおよび５０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ｐＨ７．４；（ｇ）水で希釈；（ｈ）１００ｍＭグリシンバッファーｐＨ２を含む。これらのサンプルを４℃で一晩インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、上清画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。ＣＭＶポリエピトープタンパク質を２５ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ５．６に対して透析した。ＣＭＶポリエピトープタンパク質を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）−１０Ｋスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、コーク州、アイルランド）を用いて濃縮した後、０．２２μメンブランフィルターを用いて濾過除菌し、総タンパク質を、ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイキットを用いて評価し、種々の濃度のＣＭＶポリエピトープタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、ポリエピトープタンパク質の最終純度を決定した。精製タンパク質は１ｍｌアリコートとして−７０℃で保存した。

ポリエピトープタンパク質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激および健康ドナー由来ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の増殖
健康なウイルス保有者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２５μｇの精製ポリエピトープタンパク質とともに、３７℃、６．５％ＣＯ_２にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのＰＢＭＣを非パルス刺激ＰＢＭＣと混合し、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（増殖培地と称する）に再懸濁させた。これらの細胞を２４ウェルプレートで１０日間、３７℃、６．５％ＣＯ_２で培養した。３日目と６日目に、培養物に１００Ｕの組換えＩＬ−２を含有する１ｍＬの増殖培地を添加した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖細胞のＴ細胞特異性を、標準的なＩＣＳアッセイを用いて評価した。さらに、マルチパラメータフローサイトメトリーを用い、これらの培養物中のＴ細胞の多機能的能力も評価した。

ヒト細胞によるＣＭＶポリエピトープタンパク質由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび提示の分析
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したＬＣＬおよびＨＥＫ ２９３細胞を、これらのアッセイにおける抗原提示細胞として使用した。これらの細胞を３７℃、６．５％ＣＯ_２にて２時間、２５〜１００μｇのＣＭＶポリエピトープタンパク質でパルス刺激した後、ＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄し、増殖培地に再懸濁させ、３７℃、６．５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、抗原提示細胞を、３７℃、６．５％ＣＯ_２で４時間、応答細胞と刺激細胞の比を４：１としてＣＭＶ特異的Ｔ細胞に曝し、ＩＣＳアッセイを用いてＴ細胞のサイトカイン発現を評価した。

酵素阻害アッセイ
ＣＭＶポリエピトープタンパク質のプロセシングに関与する種々のプロテアーゼの役割を評価するために、ＬＣＬを様々な阻害剤で前処理した後に抗原提示細胞として使用した。これらの阻害剤は、リソソーム／エンドソーム酸性化の阻害（８０μＭクロロキンおよび１０ｍＭバフィロマイシンＡ１）、リサイクル経路の阻害（２００μＭプリマキン）、システインプロテアーゼの阻害（１００μＭロイペプチンおよび１００μＭ Ｅ６４）、酸性プロテアーゼの阻害（ペプスタチンＡ）、自己貪食メディエーターの阻害（１０ｍＭ ３−メチルアデニン（３−ＭＡ））、プロテアソーム複合体の阻害（１０μＭラクタシスチン、１μＭエポキソミシンおよびＭＧ１３２）、ゴルジ輸送の阻害（１μｇ／ｍＬブレフェルジンＡおよび０．７μｇ／ｍＬモネンシン）またはアミノペプチダーゼ酵素の阻害（０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む３０μＭロイシンチオール）を特異的に標的とするものであった。これらの阻害剤で前処理した後、細胞を２５μｇのＣＭＶポリエピトープタンパク質とともに、３７℃、６．５％ＣＯ_２で２時間インキュベートし、ＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄し、増殖培地に再懸濁させ、３７℃、６．５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞を３７℃、６．５％ＣＯ_２で４時間、応答細胞と刺激細胞の比を４：１としてＣＭＶ特異的Ｔ細胞に曝し、ＩＣＳアッセイを用いてＴ細胞のサイトカイン発現を評価した。

短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いたＡｔｇ１２またはＳｅｃ６１のサイレンシング
ＡＴＧ１２ ｓｈＲＮＡ（クローンＩＤ ＮＭ＿００４７０７．２−４８５ｓ１ｃ１、ＣＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴ；配列番号５９）またはＳｅｃ６１ ｓｈＲＮＡ（クローンＩＤ ＮＭ＿００６８０８．２−４１０ｓ１ｃ１、ＣＣＧＧＣＣＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号６０）をコードするレンチウイルスに基づくベクターを大腸菌宿主においてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを、ラージスケールプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。ｓｈＲＮＡベクターまたは対照ベクター（ｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏ）をパッケージングベクターｐＨＲ８．２ΔＲおよびエンベロープベクターｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ）とともにコトランスフェクションすることにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でレンチウイルスを産生させた。トランスフェクション４８時間後および７２時間後に、レンチウイルス含有上清を採取し、０．４５μｍで濾過し、−８０℃で保存した。形質導入は、３×１０^５個のＣＥＭ．Ｔ１、ＣＥＭ．Ｔ２細胞またはＬＣＬを１ｍＬのレンチウイルス含有上清に再懸濁させ、３２℃にて８００ｇで３０分間遠心分離することによって行った。形質導入の４８時間後にピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を加えた。完全なノックダウンを生じさせるために、１０日目に細胞に同じレンチウイルスベクターを再感染させ、形質導入の５〜７日後に細胞を以降のアッセイに用いた。

ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット解析は従前に記載されている通りに行った（Ａｕｓｕｂｅｌ １９９５）。簡単に述べれば、レンチウイルスｓｈＲＮＡ感染細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上にて製造者の指示に従い、ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）で溶解させた。ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質を定量した。溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと混合し、１２〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、予め冷却した転写バッファー（２０％メタノールを含有する１×Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー）中、１００Ｖで１時間、ニトロセルロース膜に転写した。転写後、ニトロセルロース膜を洗浄バッファー（０．０５％Ｖ／Ｖ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで、シェーカー上で、ブロッキングバッファー（５％スキムミルクを含有するＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートした。この膜をシェーカー上、４℃で一晩、ウサギ抗Ｓｅｃ６１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストラリア）またはウサギ抗ＡＴＧ１２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース、ＭＡ）一次抗体溶液（ブロッキングバッファーで希釈）中でインキュベートした。膜を洗浄バッファーで各回１０分間６回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたヒツジ抗ウサギ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、オーストラリア）二次抗体（ブロッキングバッファーで希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。このニトロセルロース膜を洗浄バッファーで洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）とともにインキュベートし、タンパク質をＸ線フィルム上に可視化した。

統計分析
統計分析は、グラフパッドソフトウエアまたはマイクロソフト（登録商標）・オフィス・エクセル２００７を用いて行った。ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答について、平均±ＳＤを算出し、スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を決定した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。^＊、^＊＊および^＊＊＊で示される場合は、対照と比較した際のそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での統計学的有意性を表す。

結果
ＣＭＶポリエピトープタンパク質の精製および特性評価
１３、１４、１５または２０個の最小ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープをコードするＣＭＶポリエピトープインサートを、図１に概略を示すように設計した。これらの各ポリエピトープ配列に含まれるＣＭＶエピトープの総覧を表１に示す。これらのＣＭＶポリエピトープ構築物を大腸菌に形質転換し、タンパク質発現条件を最適化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。これらの実験から得られた結果は、ＣＭＶポリエピトープタンパク質（１３、１４、１５および２０マー）が３７℃、ＩＰＴＧ誘導プロモーター下で細菌発現系を用いて上手く発現できることを示した（図２ＡおよびＢ）。直鎖ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの疎水性のため、ＣＭＶポリエピトープタンパク質は封入体（ＩＢ、データは示されていない）の形態で凝集されていた。これらのＩＢを可溶化し、１３、１４または１５個のエピトープをコードする構築物由来のＣＭＶポリエピトープタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスを用いて精製した。この一段階精製プロセスは、本発明者らにこれらのＣＭＶポリエピトープタンパク質を均質となるまで精製することを可能とした（図３Ａ〜Ｃ）。しかしながら、ＣＭＶポリエピトープ２０マーの精製は、８Ｍ尿素および６Ｍ塩酸グアニジンの２種類の異なる変性剤を使用したにもかかわらず、ＩＢを上手く可溶化できなかった。ＣＭＶポリエピトープの可溶化の後、この２０マータンパク質はペレット画分に残り、溶出画分にはタンパク質は検出されなかった（図３Ｄ）。維持に適合するバッファー系を特定するための溶解度試験から得られたデータは、ＣＭＶポリエピトープタンパク質が可溶性を維持するために酸性ｐＨのＭＥＳバッファーまたはグリシンバッファーを必要とすることを示した（図４Ａ）。ＣＭＶポリエピトープ精製の後、種々の濃度のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して完全性を確認した。図４Ｂ〜Ｄに示されるデータは、最少の不純物を示し、組換えポリエピトープタンパク質の分子量はおよそ１９、２１および２５ｋＤａであり、これらはそれぞれ１３、１４および１５マーポリエピトープの理論的に計算された分子量と一致していた。この一段階精製工程は、本発明者らに２Ｌの培養物から８０ｍｇの１３マー、４ｍｇの１４マーおよび１５ｍｇの１５マータンパク質を得ることを可能とした。

ポリエピトープタンパク質で刺激した後のＰＢＭＣからのＣＭＶエピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖
ＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性を評価するために、本発明者らは、種々のＨＬＡ型のＣＭＶ血清陽性ドナーのＰＢＭＣを用いてＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させるいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。健康なドナー由来のＰＢＭＣをｅｘ ｖｉｖｏにて精製ＣＭＶポリエピトープタンパク質で刺激した後、ＩＣＳアッセイにより抗原特異性を評価し、ｅｘ ｖｉｖｏ応答と比較した。これらの実験から得られたデータは、１３、１４および１５マーのＣＭＶポリエピトープタンパク質は、そのポリエピトープ中に含まれるエピトープに特異的なＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の迅速な増殖を誘導したことを示した（図５Ａ）。ほとんどの場合で、優勢なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、ＣＭＶポリエピトープ中に含まれる複数のエピトープに対するものであった。例えば、図５Ａに示されるデータは、個々のドナーＰＢＭＣ由来の複数のエピトープに対するＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージに著しい増加を示す。さらに、本発明者らはまた、ＣＭＶポリエピトープ内の全てのエピトープがＰＢＭＣからＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させる能力があり、これらの応答は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞の２〜４０％の範囲であったことも示した（図５Ｂおよび５Ｃ）。特に注目されるものはＱＩＫエピトープであり、これは本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖試験が、ポリエピトープタンパク質で刺激した後にこのエピトープに特異的なＴ細胞が増殖され得ることを示したからである（図５Ｂ）。これに対して、ＱＥＦ特異的Ｔ細胞では最少の増殖が見られ、このエピトープはヒト細胞により効率的にプロセシングされない可能性があることが示唆される。これらの結果は、ポリエピトープタンパク質中に含まれるＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープがヒト細胞により効率的にプロセシングおよび提示され得ること、およびヒトＰＢＭＣのポリエピトープタンパク質による感作がＣＭＶ特異的Ｔ細胞の迅速な増殖を誘導することを明らかに示す。

ポリエピトープタンパク質で刺激した後に増殖したＣＤ８^＋Ｔ細胞は多機能的プロファイルを示す
報告されている多くの証拠が、多機能的ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答がある範囲のウイルスおよび微生物病原体に対する防御を提供する上で重要であることを示唆している（Ｂｅｔｔｓ，Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｄａｒｒａｈ，Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２００７）。さらに、ＣＭＶに関して、多機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は肝臓移植後の高レベルのウイルス複製に対して防御する（Ｎｅｂｂｉａ，Ｍａｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．２００８）。これらの所見は、多機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が有力なＣＭＶワクチンの開発の必要条件であることを明らかに強調する。本発明者らの続いての実験で、本発明者らは、ポリエピトープタンパク質により増殖したＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のエフェクター機能を分析した。これらの分析は、これらのエフェクター細胞が細胞溶解機能を遂行し（ＣＤ１０７ａ動員）、複数のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦおよびＭＩＰ−１β）を発現する能力を評価するように設計された。これらの分析の１つからの代表的データを図６に示す。ポリエピトープによって増殖したＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の大部分は強い細胞溶解機能（ＣＤ１０７ａ動員により示される）を示し、複数のサイトカイン（ＩＦＮγ^＋、ＴＮＦ^＋およびＭＩＰ１β^＋）を発現した。

リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープ構築物の合理的設計、タンパク質発現および精製
ポリエピトープタンパク質のプロセシングおよび提示におけるスペーサー配列の厳密な役割を示すために、本発明者らは、プロテアソームリンカーを用いずに（ＣＭＶポリ）、また用いて（ＣＭＶポリ−ＰＬ）、１３個の最小のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープをコードするように設計した（図７Ａおよび７Ｂ）。ＣＭＶポリエピトープ構築物を大腸菌に形質転換し、タンパク質発現条件を最適化し、ポリエピトープタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて精製した。これらの実験から得られた結果は、ＣＭＶポリおよびＣＭＶポリ−ＰＬの両方が細菌発現系を用いて上手く発現され、均質となるまで精製できたことを示した。

リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬおよびＣＭＶポリ−ＰＴＬタンパク質のプロセシングおよび提示を検討するために、本発明者らは、ヒトリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬｓ：ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）を一晩ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬおよびＣＭＶポリ−ＰＴＬとともにインキュベートした後、細胞内ＩＦＮ−γ分析を用い、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞パネルの活性化を評価した。図８Ａに示される代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＰＴＬ由来のＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ（ｐｐ６５）、ＨＬＡ Ａ１拘束ＶＴＥ（ｐｐ５０）、ＨＬＡ Ｂ７拘束ＲＰＨおよびＴＰＲ（ｐｐ６５）エピトープは、ＣＭＶポリでパルス刺激されたＬＣＬに比べ、効率的にプロセシングされ、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞に提示されたことを示す。より重要なことに、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、ＣＭＶポリに比べてＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬでパルス刺激したＬＣＬで刺激した後に有意に高かった（図８Ｂ）。これらのデータを考え合わせると、外因的に送達されたポリエピトープタンパク質のプロセシングおよび抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞への提示を増強させるためには、エピトープ間にプロテアソームリンカーおよび／またはＴＡＰリンカーを必要とすることが示される。

ポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープはＴＡＰ非依存的経路を介して交差提示されるが、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路も関わる
次の一連の実験で、外因的に付加されたポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび提示の厳密な経路を示すために、本発明者らはポリエピトープタンパク質をＴＡＰ^＋（ＣＥＭ．Ｔ１）およびＴＡＰ⁻（ＣＥＭ．Ｔ２およびＣＥＭ．Ｔ２−ＨＬＡ Ｂ７）ＬＣＬ中でパルス刺激した後、これらの細胞をＣＭＶ特異的Ｔ細胞に曝した。図９に示されるデータは、ＴＡＰ^＋Ｂ細胞およびＴＡＰ⁻Ｂ細胞の両方がポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを効率的に提示することができることを示す。ポリエピトープ提示の機序を示すために、本発明者らは、抗原提示細胞としてＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞を用いてＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激した。これらの抗原提示細胞をまずリソソーム／エンドソーム酸性化の阻害剤（クロロキンおよびバフィロマイシンＡ１）、リサイクル経路の阻害剤（プリマキン）、システインプロテアーゼの阻害剤（ロイペプチンおよびＥ６４）、および酸性プロテアーゼの阻害剤（ペプスタチンＡ）で前処理し、次に、ポリエピトープタンパク質でパルス刺激した。図１０Ａに示されるデータは、ポリエピトープタンパク質の提示を遮断するというよりもむしろ、リソソーム、リサイクル経路およびシステインプロテアーゼ阻害剤が、ポリエピトープタンパク質でパルス刺激されたＣＥＭ．Ｔ１細胞および／またはＣＥＭ．Ｔ２細胞のＴ細胞認識を有意に高めたことを示す。これらの所見は、ロイペプチン、Ｅ６４またはペプスタチンＡによる前処理が、ポリエピトープタンパク質内のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープをシステインプロテアーゼおよび酸性プロテアーゼによる分解から保護し得ることを示唆する。予期しないことに、クロロキンとバフィロマイシンＡ１は、ポリエピトープタンパク質の交差提示に対して反対の作用を示した。クロロキンはＣＥＭ．Ｔ２細胞における抗原提示を高めたが、バフィロマイシンＡ１による前処理は、ポリエピトープでパルス刺激した抗原提示細胞のＴ細胞認識を有意に低下させた（図１０Ａ）。従前の研究では、バフィロマイシンＡ１は空胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼの強力かつ特異的な阻害剤でもあり、オートファゴソームとリソソームの間の融合を阻害することによって自己貪食空胞の成熟を妨げることが示されている。ポリエピトープタンパク質プロセシングが自己貪食経路を含み得るかどうかを調べるために、本発明者らは、抗原提示細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤である３−メチルアデニン（３−ＭＡ）で前処理した後、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞に曝した。図１０Ａに示されるデータは、３−ＭＡ処理がポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示も果たしたことを示す。これらの所見は、ポリエピトープタンパク質の交差提示が自己貪食依存的経路を介する可能性があることを示唆する。

次の一連の実験で、本発明者らは、ポリエピトープタンパク質の交差提示におけるプロテアソーム複合体の潜在的役割を検討した。ＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞をプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン、エポキソミシンおよびＭＧ１３２で前処理した後、ポリエピトープタンパク質でパルス刺激した。次に、これらの細胞のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示を評価した。図１０Ｂに示されるデータは、３種類のプロテアソーム阻害剤の全てが、ポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示を完全に遮断したことを示す。ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示は免疫プロテアソームの発現に依存せず、これはタンパク質分解複合体のこれらの成分を発現しないＣＥＭ．Ｔ２細胞がポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋エピトープを効率的に処理できるためであることに留意することが重要である。本発明者らは次に、ポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示における分泌経路および小胞体アミノペプチダーゼの潜在的役割に着目した。図１０Ｃに示されるデータは、ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンでの前処理はＣＤ８^＋Ｔ細胞への提示を有意に遮断したが、ロイシンチオール処理はＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞のＴ細胞認識に対して最小の効果しか示さなかったことを示す。これらの結果は、ポリエピトープタンパク質は、不適切に折り畳まれたＥＲタンパク質を分解する逆輸送経路を含み得るプロテアソーム依存性のＥＲ非依存的経路を介してプロセシングされることを示唆する。

ポリエピトープの交差提示における逆輸送および自己貪食を介する経路の影響をさらに解明するために、ＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞に、Ｓｅｃ６１βサブユニット遺伝子とＡＴＧ１２（自己貪食レギュレーター１２）遺伝子のサイレンシングのためのｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた。図１１Ａ〜Ｃに示されるデータは、ｓｈＲＮＡの発現はＳｅｃ６１βサブユニットの発現を劇的に減少させたが、この発現の欠如はポリエピトープタンパク質由来のＴ細胞エピトープの提示に最小の効果しか示さなかったことを示す。これに対して、ＣＥＭ．Ｔ１細胞およびＣＥＭ．Ｔ２細胞の両方でＡＴＧ１２発現のダウンレギュレーションは、ＣＭＶポリエピトープタンパク質に感作した細胞の認識を有意に低下させた。これらの所見を考え合わせると、ポリエピトープタンパク質の交差提示はプロテアソーム経路と自己貪食経路の両方を含む新規な経路を介して起こることが示される。

実施例２
アジュバントと組み合わせたＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性
材料および方法
ＭＰＬおよびＣｐＧ ＯＤＮ１８２６を含むＣＭＶポリエピトープワクチン製剤
ＣＭＶポリエピトープワクチンを、１００μＬ容量中、一用量当たり２０μｇのＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬと２５μｇのＭＰＬ（ＴＬＲ４アゴニスト）および５０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９アゴニスト）を混合することにより調剤した。ＴＬＲアゴニストはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。

マウスの免疫
マウスＭＨＣクラスＩが破壊されたヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１を含有するＨＨＤ Ｉマウスを育成し、ＱＩＭＲにて特定病原体不在条件下で維持した。全てのプロトコールはＱＩＭＲ動物倫理委員会に準拠した。各群、少なくとも５個体（Ｍ１〜５）の６〜８週齢マウスに、上記に明示したアジュバントの組合せで調剤したＣＭＶポリエピトープワクチンで、尾の基部から皮下（ｓ．ｃ．）免疫を施した。２１日目に同じワクチン製剤でマウスに追加免疫を施し、３５日目にマウスを屠殺し、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）アッセイを用いてポリエピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を測定した。

脾細胞の調製
マウスをＣＯ_２窒息により屠殺し、３ｍＬのマウスＴ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ）中に脾臓を採取した。シリンジのプランジャーで脾臓を穏やかにすりつぶすことによって単細胞懸濁液を調製した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３ｍＬの塩化アンモニウムおよびＴｒｉｓバッファー（０．８９％塩化アンモニウム中０．０１７ＭのＴｒｉｓ塩基、ｐＨ７．４）に再懸濁させた後、室温で５分間インキュベートして赤血球を除去した。細胞を遠心分離し、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、５ｍＬのマウスＴ細胞培養培地に再懸濁させた。余分な組織および細胞残渣を除去するために、最終細胞懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンディエゴ、ＵＳＡ）で濾過した。その後、トリパンブルー排除法を用いて細胞生存率を求めた。

免疫マウス由来のＣＭＶ特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激および増殖
ワクチン接種マウス由来のおよそ５×１０^６個の脾細胞を、１００μｌのマウスＴ細胞培養培地中、３７℃、６．５％ＣＯ_２で２時間、１μｇのＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶおよびＶＬＥペプチドで刺激した。インキュベーション後、１ｍＬのマウスＴ細胞培養培地を加え、細胞を２４ウェルプレートに移し、３７℃、６．５％ＣＯ_２で１０日間培養した。３日目と６日目に、培養物に、１００Ｕの組換えＩＬ−２を含有する１ｍＬのＴ細胞培養培地を補給した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖細胞のＴ細胞特異性を、標準的なＩＦＮ−γ ＩＣＳアッセイを用いて評価した。さらに、これらの培養物中のＴ細胞の多機能的能力も、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いて評価した。

細胞内サイトカイン染色によるマウスＴ細胞におけるＩＦＮ−γ応答の評価
ＮＬＶおよびＶＬＥによるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激の後、５０μＬのマウスＴ細胞培養培地中のおよそ２×１０^５個のマウス脾細胞を、必要なウェルに加えた。これらの細胞を刺激するために、各ウェルに０．２μｇのＮＬＶおよびＶＬＥペプチドを加え、次いで、０．３μＬのブレフェルジンＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）を含有する１５０μＬのＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ（洗浄バッファー）で細胞を２回洗浄し、洗浄バッファーに再懸濁させたＡＰＣ結合抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ８モノクローナル抗体で表面染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄バッファーで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで固定し、Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーで２回洗浄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、ＰＥ結合抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体で細胞内染色し、細胞をＰｅｒｍ／洗浄バッファーで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩに採取した。

マルチパラメトリックフローサイトメトリーによるワクチン接種マウスの免疫応答の評価
ワクチン接種後、前述のようにｅｘ ｖｉｖｏにて脾細胞を刺激した。細胞を４℃で３０分間、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ８で表面染色した。洗浄、固定および透過処理の後、細胞をＰＥ結合抗ＩＦＮ−γ、ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＴＮＦおよびＡＰＣ結合抗ＩＬ２抗体で細胞内染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩに採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアおよびＢｏｏｌｅａｎゲート分析を用いてデータを解析した。

結果
最初の研究で、ＣＭＶによりコードされている糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）とポリエピトープタンパク質に基づくサブユニットワクチン製剤を、ヒト適合性ＴＬＲアゴニストと組み合わせて試験した。ポリエピトープタンパク質は、ＣＭＶの異なる抗原に由来する複数の最小ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含んでいた。このサブユニットワクチンは、持続的抗ウイルス抗体、Ｔｈ１ ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を生じさせた。このワクチンにより誘導された体液性免疫応答は強い中和能を示し、抗原特異的Ｔ細胞は、長期記憶維持を伴う複数のサイトカインを発現した。さらに、このサブユニットＣＭＶワクチンは、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９の活性化を介して、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に重要な役割を果たすＩＬ１２ｐ７０、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを発現する異なる樹状細胞（ＤＣ）サブセットを活性化した。

リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬおよびＣＭＶポリ−ＰＴＬの免疫原性を決定するために、本発明者らは、次に、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９アゴニストと組み合わせた場合のポリエピトープタンパク質の免疫原性を評価した。ヒトＨＬＡ Ａ２ ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現するＨＨＤ−ＩトランスジェニックマウスをＣＭＶポリ、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬで免疫した。ワクチン接種後、脾細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにてＨＬＡ Ａ２拘束ＮＬＶおよびＶＬＥペプチドで刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した脾細胞におけるＣＭＶポリエピトープ特異的応答の確立を分析するため、細胞内ＩＦＮ−γアッセイを用い、ＣＭＶポリ特異的（ＨＬＡ Ａ２拘束エピトープＮＬＶおよびＶＬＥ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在を評価した。興味深いことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致して、ＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬワクチン製剤で免疫したマウスは、ＣＭＶポリワクチン製剤で免疫したマウスに比べて、有意に高い頻度のＣＭＶポリエピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導した（図１２Ａ）。さらに、Ｔ細胞に基づくワクチンの防御有効性は多機能エフェクターの頻度に相関するという実質的な証拠がある。従って、続いての実験で、本発明者らは、ＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の機能の質を評価した。免疫マウス由来の脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖後、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γ産生のパターンを決定した。図１２Ｂに示されるデータは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞がより高度な多機能性を示し、最も重要なこととしては、より高い頻度のＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＭＶポリワクチンよりもＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬで免疫されたマウスのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ産生細胞であったことを明らかに示す。これらの所見を考え合わせると、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストの両方をアジュバントとしたＣＭＶポリ−ＰＬまたはＣＭＶポリ−ＰＴＬに基づくＣＭＶワクチン製剤が、多機能的能力を有するＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導する上で最も効果的であったことが明らかに示される。

考察
新たに出現した証拠は、健康なＣＭＶ血清陽性個体におけるＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の応答が、複数のＣＭＶ抗原、主としてｐｐ６５およびＩＥ１に向けられるだけでなく、他の構造的初期／後期抗原および免疫調節剤（ｐｐ２８、ｐｐ５０、ｐｐ１５０、ＩＥ２ ｇＨ、ｇＢ、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６およびＵＬ１８）にも向けられるということを示唆している（Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，Ｓｈｏｕｋｒｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｍａｎｌｅｙ，Ｌｕｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｋｈａｎ，Ｂｒｕｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００５）。これらのＣＤ８^＋Ｔ細胞の応答は、動物モデルならびにヒトの両方において、ＣＭＶの免疫性、ウイルス複製の制御および進行性感染の臨床症状の予防に重要な役割を果たす（Ｑｕｉｎｎａｎ，Ｋｉｒｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９８２；Ｒｏｏｋ，Ｑｕｉｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ，Ｗｅｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９８５）。これらの所見は、複数の抗原に対してＴ細胞応答を誘導し得るＣＭＶに対するワクチンがＣＭＶ関連疾患に対する防御を強化する可能性があることを示す。従って、複数の抗原を標的とするために、特に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘導するために、この研究で本発明者らは、新規な組換えに基づくポリエピトープワクチン技術を提案した。ポリエピトープに基づくワクチンは、未知の特性または病原性を含む可能性のある全長抗原を使用せずに、いくつかの抗原に由来する保存されている多様なエピトープに対して免疫応答を誘導するための有力なアプローチを提供する。

異なる人種集団内のいくつかの抗原に対するＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を増強するために、複数のＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを共有結合的に連結することにより、一連のＣＭＶポリエピトープタンパク質（１３マー、１４マー、１５マーおよび２０マー）を設計した。ＣＭＶポリエピトープ構築物内の選択されたエピトープは、ｐｐ６５、ｐｐ５０、ｐｐ１５０、ＤＮアーゼ、およびＩＥ−１を含め、保存性の高いＣＭＶの複数の抗原に由来した（Ｂｒｙｔｔｉｎｇ，Ｗａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｒｅｔｉｅｒｅ，Ｉｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓｏｌａｃｈｅ，Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ＣＭＶポリエピトープの免疫原性を増強するために、選択されたＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを、各エピトープのカルボキシル末端においてプロテアソーム遊離アミノ酸配列（ＡＤまたはＫまたはＲ）およびＴＡＰ（抗原プロセシング関連輸送体）認識モチーフ（ＲＩＷ、ＲＱＷ、ＮＩＷまたはＮＱＹ）からなるリンカー配列を用いて相互に連結した。これに関して、公開されているデータは、ポリエピトープタンパク質のプロテアソームプロセシングを提供するためのアミノ酸残基（Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｆｉｋｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｋｕｔｔｌｅｒ，Ｎｕｓｓｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００１）およびＴＡＰ認識のためのモチーフの使用が、プロテアソームにより生成されたペプチドを小胞体（ＥＲ）に輸送するために必要であることを示す（Ｕｅｂｅｌ，Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｂａｚｈａｎ，Ｋａｒｐｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１０）。３マー、１４マーおよび１５マーのＣＭＶポリエピトープタンパク質は、大腸菌において組換えタンパク質として上手く発現され、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて精製された。しかしながら、ＣＭＶポリエピトープを２０マーとする本発明者らの試みは、その高い疎水性のために上手くいかなかった。最適化されたタンパク質発現条件および精製プロトコールは一貫していた。およそ２Ｌの振盪フラスコ培養により、実質的量のポリエピトープタンパク質が得られた。

次に、本発明者らは、健康なドナーＰＢＭＣを刺激してＣＭＶエピトープ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を高めることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性を試験した。これらの研究からのデータは、これらのＣＭＶポリエピトープタンパク質が、健康なウイルス保有者においてＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を生じさせる上で極めて有効であることを明らかに示した。興味深いことに、本発明者らの結果は、複数のＣＭＶペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を同時に増幅することの実現可能性を示し、これらの増殖したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ポリエピトープタンパク質による刺激の後に、ＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＭＩＰ−１βおよびＣＤ１０７ａの強い発現を示した。これらのＴ細胞の機能的特性は、Ｔ細胞媒介性免疫応答およびウイルスクリアランスの有効性を予測するために極めて重要である［（Ｓｅｄｅｒ，Ｄａｒｒａｈ ｅｔ ａｌ．２００８）に総説］。健康なドナーからのウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖に加え、本発明者らはまた、ヒトＢ細胞（ＬＣＬ）および上皮細胞（ＨＥＫ２９３）を用いてポリエピトープタンパク質の免疫原性も試験した。これに関しては、ＣＭＶポリエピトープによりコードされているＨＬＡ拘束エピトープの大部分はプロセシングされ、抗原特異的Ｔ細胞に効率的に提示され、ポリエピトープタンパク質の、ＭＨＣクラスＩ経路を介した提示のためにエピトープを送達する傾向が確認された。

多くの研究が、外因性タンパク質がどのようにインターナリゼーションを受け、プロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子によって抗原提示細胞上で提示されるかを示しているが、外因的に付加されたポリエピトープタンパク質のプロセシングおよび抗原提示細胞による提示はまだ報告されていない。一般に、樹状細胞による外因性抗原の交差提示は、３つの異なる経路を用いて機能することが示されている。提案される第一のモデルは、プロテアソーム依存性プロセシングのために外因性抗原をファゴ−エンドソームからサイトゾルへ輸送する間接的経路を使用する。プロセシングされたペプチドは次に古典的ＭＨＣクラスＩ機構により小胞体に積載される（Ｈｕａｎｇ，Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９６）。第二のモデルは、直接的プロテアソーム依存的経路であり、これにより、抗原はプロセシングされ、エンドソームコンパートメント内のＭＨＣクラスＩに完全に積載される（Ｓｈｅｎ，Ｓｉｇａｌ ｅｔ ａｌ．２００４）。

提案される第３のモデルは、エンドサイトーシスオルガネラへの小胞体成分の送達または入ってくる抗原の小胞体への輸送を利用する（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ，Ｓａｖｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｈｏｕｄｅ，Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００３）。実際に、有効なワクチンの開発、癌に対する免疫療法、ならびに自己免疫を回避するための自己抗原に対する免疫寛容において、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞への外因性抗原の交差提示は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の誘導の必要条件である（Ｒｏｃｋ ａｎｄ Ｓｈｅｎ ２００５）。従って、本発明者らは、どのＣＭＶポリエピトープによる経路が、抗原提示の異なる段階に関与する様々な化学阻害剤の存在下でＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞によりプロセシングされ、交差提示されたかを解明した。

本発明者らの結果は、ポリエピトープが、ＴＡＰ非依存的、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路でペプチドに分解されることを明らかに示す。プロテアソーム阻害剤および自己貪食阻害剤で処理したＣＥＭ．Ｔ１細胞およびＣＥＭ．Ｔ２細胞は両方ともＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの効果的な提示を妨げたが、リソソーム阻害剤、リサイクル経路阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、酸性プロテアーゼ阻害剤および小胞体アミノペプチダーゼ阻害剤を用いた場合には提示が増強された。さらに、本発明者らは、ブレフェルジンＡおよびモネンシンで処理した後に、ＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２によるＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示が低下することも見出した。これらの阻害剤は新たに合成されたＭＨＣ Ｉ分子の細胞表面への輸送を遮断することが知られているので、この効果はＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示に対する間接的効果である可能性がある。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび提示はプロテアソーム阻害剤によって遮断されたがＥＲ阻害剤によっては遮断されなかったことから、本発明者らは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ提示が、外因性抗原がファゴソームにインターナライズされ、次に、Ｓｅｃ６１チャネルを介してサイトゾルへ送達され、プロテアソームによりオリゴペプチドに分解され、その後、ＥＲ内のＭＨＣクラスＩ分子へと輸送されるという、逆輸送経路を介したものであったとの仮説を立てた（Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｇｉｏｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｒｏｃｋ ２００６）。しかしながら、ＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２におけるＳｅｃ６１βサブユニットタンパク質のノックダウンはＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの提示に効果が無く、このことは、逆輸送経路がポリエピトープによりコードされているＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび提示には関与しない可能性があることを示す。

本発明者らはポリエピトープタンパク質のプロセシングにおける逆輸送経路の証拠を見出すことはできなかったが、本発明者らは、ＡＴＧ１２のノックダウン後の自己貪食経路の役割に証拠を見出した。ＡＴＧ１２はユビキチン様修飾因子であり、別の自己貪食レギュレーターＡＴＧ５とのその共有結合は、自己貪食の形成および伸長に不可欠な役割を果たす（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓｕｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。従って、本発明者らは、ポリエピトープタンパク質由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープは、新規なＴＡＰ非依存的、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路を介してＣＥＭ．Ｔ１およびＣＥＭ．Ｔ２細胞によりプロセシングされ、提示されると結論づける。

この経路をこれまでに提案されている交差提示モデルと一致させるのは難しいが、報告されている証拠は、プロテアソーム経路と自己貪食経路の間の協調が細胞内のタンパク質の質的制御に不可欠であることを示唆している（Ｄｉｎｇ，Ｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７）。さらに、プロテアソームおよび自己貪食依存的経路が交差提示に関して報告されたことはないが、内因的に過剰発現されるタンパク質の分解に関与することが示されている（Ｗｅｂｂ，Ｒａｖｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２００３）。

よって、これらの所見に基づき、本発明者らは、ポリエピトープタンパク質が新規なプロテアソームおよび自己貪食依存的経路を介してプロセシングされ、提示されると推測する。要約すると、ポリエピトープタンパク質は、原核生物発現系を用いて組換えタンパク質として安定な形態で発現させることができる。これらのポリエピトープタンパク質は免疫原性が高く、抗原提示細胞による交差提示の際に、プロテアソームおよびオートファゴソーム依存的経路に優先的に接近する可能性がある。

実施例３
アジュバントと組み合わせたＥＢＶポリエピトープタンパク質の免疫原性
材料および方法
ＥＢＶポリエピトープ構築物の構築
ＥＢＶポリエピトープを、９種の異なる抗原（ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＺＬＦ１、ＬＭＰ２、ＬＭＰ２ａ、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３ＢおよびＥＢＮＡ３Ｃ）由来の複数のＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするように設計した。エピトープＨＬＡ拘束、アミノ酸配列およびこれらのエピトープのアミノ酸位置を表３に示し、および図１３Ａに模式的に示す。

ポリエピトープ配列は、各エピトープ配列の前にプロテアソーム遊離アミノ酸配列（ＡＤまたはＫまたはＲ）があり、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラムを用いた精製を可能とするために各ポリエピトープタンパク質のＣ末端にヘキサヒスチジンタグが挿入されるように設計した。各構築物のアミノ酸配列を大腸菌コドン使用頻度に基づきＤＮＡ配列に翻訳し、インサートを合成構築し（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州、ＵＳＡ）、発現プラスミド（ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４０４）のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトプラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターにクローニングした。合成設計したＥＢＶポリエピトープを化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に形質転換し、プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。

タンパク質発現
化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）をＥＢＶポリエピトープ発現ベクターで形質転換した。形質転換細胞を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＬＢ−Ａｍｐ）を添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上に播種し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。単離されたコロニーを採取し、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐブロスに植え込み、３７℃、２００ｒｐｍのシェーカーで一晩増殖させた。少量の一晩培養物を５０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐブロスに植え込み、１２時間増殖させた後、培養物の１％を２ＬのＬＢ−Ａｍｐブロスに移植し、その後、６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．６となるまで増殖させた。ＥＢＶポリエピトープタンパク質誘導は、１ｍＭ／ｍＬのＩＰＴＧを加えることにより行った。これらの細胞をさらに４時間増殖させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非誘導サンプルと誘導サンプルを分析することにより、タンパク質発現レベルを決定した。

ＥＢＶポリエピトープタンパク質精製
誘導期の終了時に、大腸菌培養物を１０，０００ｒｐｍで１５分の遠心分離により採取し、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を添加した８０ｍＬの溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解は、氷上で４×５分サイクルの音波処理により行い、各サイクル間に１０分の中断を設けた。この溶解液を１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清およびペレット画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。タンパク質の大部分はペレット画分中に封入体（ＩＢ）の形態で見られたので、ＩＢを、撹拌下、室温で２時間、溶解バッファー（リゾチーム不含）で１回洗浄し、１５０ｍＬの可溶化バッファー（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ｐＨ８．０）中、４℃で一晩、可溶化した。可溶性タンパク質を１３，０００ｒｐｍで３０分の遠心分離により清澄化し、上清をポリエピトープタンパク質の精製に用いた。

ＥＢＶポリエピトープタンパク質を精製するために、本発明者らは、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）金属アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを用いた。このマトリックスを５カラム容量の蒸留水で洗浄した後、３カラム容量の可溶化バッファーで平衡化した。可溶性タンパク質をこのカラムにロードし、流速を１ｍＬ／分に調整した。非結合タンパク質および不純物を１０カラム容量の洗浄バッファー１（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ６．３）および２０カラム容量の洗浄バッファー２（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ５．９）で洗い流した。結合タンパク質は溶出バッファー（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素ｐＨ４．３）で溶出させ、溶出画分を、図１３Ｂに示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。陽性画分をプールし、精製されたＥＢＶポリエピトープタンパク質を２５ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ３．５に対して透析した。透析後、ＥＢＶポリエピトープタンパク質を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、コーク州、アイルランド）を用いて濃縮した後、０．２２μメンブランフィルターを用いて濾過除菌した。最終的なＥＢＶポリエピトープタンパク質評価は、ブラッドフォードアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）を用いて行った。

ポリエピトープタンパク質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激および健康ドナー由来ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖
健康なウイルス保有者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２５μｇの精製ＥＢＶポリエピトープタンパク質とともに、３７℃、６．５％ＣＯ_２にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのＰＢＭＣを非パルス刺激ＰＢＭＣと混合し、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（増殖培地と称する）に再懸濁させた。これらの細胞を２４ウェルプレートで１４日間、３７℃、６．５％ＣＯ_２で培養した。３日目、６日目および９日目に、培養物に１００Ｕの組換えＩＬ−２を含有する１ｍＬの増殖培地を添加した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖細胞のＴ細胞特異性を、標準的なＩＣＳアッセイを用いて評価した。

結果
プロテアソームリンカーを有するＥＢＶポリエピトープタンパク質の設計および精製
ＣＭＶに対する免疫療法のための組換えポリエピトープタンパク質の設計、発現および精製に十分確立されたプロトコールが開発されたので、続いての研究で、本発明者らは、このようなアプローチを、ＥＢＶ関連悪性腫瘍に対抗するための免疫療法用の別の組換えポリエピトープタンパク質の設計に拡張した。特に、ＥＢＶ関連再発性ホジキン病および鼻咽頭癌の治療のために、ＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞はより有効であると考えられる。しかしながら、ＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成は、複合体作製法などのいくつかの限定要因により制限され、ほとんどの場合、このようなプロセスは抗原を抗原提示細胞に送達するために、例えば組換えアデノウイルスベクターなどの感染力のある臨床級のウイルス材料を必要とする。従って、このような問題を克服するために、本発明者らは、細菌発現系を用いて発現させることができる新規なＥＢＶポリエピトープを設計した。９種の異なる抗原（ＢＭＬＦ１、ＬＭＰ２ａ、ＢＲＬＦ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＢＺＬＦ１、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１およびＥＢＮＡ３Ｂ）に由来する２０個の最小ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープをコードするＥＢＶポリエピトープを、図１３Ａに概略を示すように設計し、ポリエピトープ配列内の各エピトープをプロテアソームリンカーによって分離した。これらの各ポリエピトープ配列に含まれるＥＢＶエピトープの総覧を表３に示す。このＥＢＶポリエピトープ構築物を大腸菌に形質転換した。タンパク質発現条件を最適化し、発現したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡマトリックスを用いて精製した。ＣＭＶポリエピトープタンパク質の結果に一致して、これらの実験から得られた結果は、ＥＢＶポリエピトープが細菌発現系を用いて上手く発現でき、タンパク質が均質となるまで精製可能であることを示した（図１３Ｂ）。

リンカーを用いた場合および用いない場合のＣＭＶポリエピトープタンパク質の免疫原性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させるためのＥＢＶポリエピトープの潜在的有効性を決定するため、複数の異なるドナー由来のＰＢＭＣを精製された組換えＥＢＶポリエピトープタンパク質で刺激した。刺激後に増殖したＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、細胞内サイトカインアッセイを用いて評価した。図１４に示されるデータは、かなりの割合のドナーが、刺激されなかったＰＢＭＣに比べ、ＥＢＶポリエピトープで刺激された後にＥＢＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示したことを示す。興味深いことに、各ドナー由来の細胞は、いくつかのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子により拘束される複数のエピトープを認識し、ドナーの大多数で、少なくとも３つの異なるエピトープに対して増殖したＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度が高くなった。

参考文献

本明細書を通じ、目的は、本発明をいずれか１つの実施形態または特徴の特定の集合体に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することであった。よって、当業者には、本開示に鑑みて、本発明の範囲から逸脱することなく例示される特定の実施形態において様々な改変および変更を行うことができることが認識されるであろう。

本明細書に引用された全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許文献および科学文献は、その全内容が本明細書の一部として援用される。

Claims (31)

1. ２つ以上の異なるヘルペスウイルス抗原に由来する複数のＣＴＬエピトープのそれぞれの対応アミノ酸配列を含み、かつ、前記複数のＣＴＬエピトープのうちの少なくとも２つの間に、プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列および任意選択により抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）認識モチーフを含む介在アミノ酸またはアミノ酸配列をさらに含み、外因性タンパク質として動物に投与されると細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答を惹起可能である、単離されたタンパク質。
2. 前記エピトープが、ＨＬＡクラスＩ特異性ＨＬＡ−Ａｌ、−Ａ２、−Ａ３、−Ａｌｌ、−Ａ２３、−Ａ２４、−Ａ２６、−Ａ２９、−Ａ３０、−Ｂ７、−Ｂ８、−Ｂ２７、−Ｂ３５、−Ｂ３８、−Ｂ４０、−Ｂ４１、−Ｂ４４、−Ｂ５１、−Ｂ５７および−Ｂ５８のうちの少なくともいずれかに拘束される、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
3. 前記ヘルペスウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
4. 前記ＣＭＶ ＣＴＬエピトープがｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ１５０およびＩＥ−ｌのうちの少なくともいずれかに由来する、請求項３に記載の単離されたタンパク質。
5. 前記ＣＴＬエピトープが配列番号１〜２１で示されるアミノ酸配列のうちから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
6. 配列番号１〜１３で示されるＣＴＬエピトープアミノ酸配列のそれぞれを含む、請求項５に記載の単離されたタンパク質。
7. 配列番号１１で示されるＣＴＬエピトープアミノ酸配列を含む、請求項５または請求項６に記載の単離されたタンパク質。
8. 配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８のうちから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
9. 前記ＥＢＶ ＣＴＬエピトープが、ＢＭＬＦ１、ＬＭＰ２ａ、ＢＲＬＦ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＢＺＬＦ１、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１およびＥＢＮＡ３Ｂのうちから選択される１つ以上の抗原に由来する、請求項３に記載の単離されたタンパク質。
10. 前記ＣＴＬエピトープが、配列番号２２〜４１で示されるアミノ酸配列のうちから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離されたタンパク質。
11. 配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、請求項９および請求項１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
12. ２０個未満のＣＴＬエピトープを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
13. １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のＣＴＬエピトープを含む、請求項１０に記載の単離されたタンパク質。
14. 同じまたは異なるヘルペスウイルスに由来するエピトープを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
15. 前記プロテアソーム遊離アミノ酸またはアミノ酸配列がＡＤ、ＫおよびＲのうちの少なくともいずれかを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質をコードする単離された核酸。
17. 配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のうちから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離された核酸。
18. 発現ベクターにおいて１つ以上の調節配列に作動可能に連結された請求項１６または請求項１７に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物。
19. 請求項１８に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
20. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質を生産する方法であって、前記単離されたタンパク質を実質的に非凝集形態で維持する条件下で、前記単離されたタンパク質を少なくとも部分的に精製する工程を含む、方法。
21. （ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１つ以上の単離されたタンパク質、（ｉｉ）請求項２０に記載の方法によって生産された１つ以上の単離されたタンパク質、および（ｉｉｉ）請求項１８に記載の遺伝子構築物のうちの少なくともいずれかと、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
22. 免疫刺激性分子またはアジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記免疫刺激性分子またはアジュバントが、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストのうちの少なくとも一方を含むＴＬＲアゴニストである、請求項２１に記載の医薬組成物。
24. ヒトにおいてヘルペスウイルスに対する防御免疫応答を惹起するためのワクチンである、請求項２１、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
25. ヒトにおいてＣＭＶおよびＥＢＶのうちの少なくとも一方に対する防御免疫応答を惹起するためのワクチンである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
26. 動物においてヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する方法であって、前記動物に、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することにより、前記動物におけるヘルペスウイルス感染を予防的にまたは治療的に処置する工程を含む、方法。
27. 動物において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘導または惹起する方法であって、前記動物に、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することにより、前記動物において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘導または惹起する工程を含む、方法。
28. 養子免疫療法用のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる方法であって、
    （ａ）動物から単離された１つ以上の細胞を請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質と接触させる工程、および
    （ｂ）前記１つ以上の細胞を培養することにより、前記１つ以上の細胞由来のヘルペスウイルス特異的ＣＴＬを増殖させる工程
    を含む、方法。
29. 請求項２８の工程（ｂ）で産生された前記ＣＭＶ特異的ＣＴＬを動物に投与することにより、前記動物のＣＭＶ感染を予防的にまたは治療的に処置する工程を含む、養子免疫療法。
30. 前記ヘルペスウイルスがＣＭＶまたはＥＢＶである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記動物がヒトである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。