CN104914100B - 一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒 - Google Patents
一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种细菌的快速检测方法。该检测方法包括：将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒(AuNPs)混合，孵育，观察溶液颜色的变化，获得细菌浓度。本发明提供的检测方法特异性强、灵敏度高，与细菌培养法和PCR法相比，本发明所建立的细菌检测技术具有快速、操作简单及结果肉眼可见的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒。
背景技术
细菌是一类重要的病原体，它们侵入机体后会分泌产生大量的生物毒素，从而破坏机体的结构和功能，造成宿主感染，引发诸如破伤风、肺结核、脓毒症等多种疾病。细菌种类繁多，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等多个菌属，且分布广泛，与人类生活关系密切。近年来，由于饮用水、食物及生物医疗制剂的污染，由病原细菌引起的感染疾病已成为危害人类身体健康的重要因素，引起了全球性的广泛关注。因此为开展相关疾病的早期诊断，保护人民的身体健康，研究细菌的快速分析检测技术具有非常重要的意义。
目前，细菌的检测技术主要有细菌培养法和聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)法。细菌培养法是目前检测细菌最常用的分析方法，主要依据细菌的形态及生理生化反应特征来完成待检细菌的分析检测。PCR法是通过对待检细菌染色体分子的扩增和DNA分型来实现细菌的分析检测。
然而，细菌培养法和PCR法都存在着各自的缺点。细菌培养法的耗时较长(几天时间)，且操作繁琐，灵敏度低，稳定性差，尤其是较长的培养时间给早期细菌感染疾病的临床诊断和指导用药带来了严重不便。PCR法的成本及技术水平要求高，且操作繁琐，需经过细菌裂解、核酸提取及扩增等多个步骤。另外，虽然相比传统的细菌培养法，PCR法已大大缩短了细菌的检测周期(6-10小时)，但还是难以满足实际临床现场快速检测的需求。
因此，针对上述细菌培养法和PCR法存在的不足之处，建立了一种简便的细菌现场快速可视化检测技术具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒。该检测方法特异性强、灵敏度高，与细菌培养法和PCR法相比，本发明所建立的细菌检测技术具有快速、操作简单及结果肉眼可见的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种细菌的检测方法，包括如下步骤：
将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒(AuNPs)混合，孵育，观察溶液颜色的变化，获得细菌浓度。
细菌代谢的相关研究发现，细菌表面存在着一系列的氧化还原体系，可以快速完成不同价态金属离子(如Cu2+到Cu+)间的转化，从而避免过高浓度的高价态金属离子对其本身产生毒害作用。本发明利用细菌此独特的氧化还原性质，通过细菌还原Cu2+引发点击反应(Cu+催化的叠氮-炔基环加成反应)的策略，促使炔基及叠氮基团修饰的金纳米颗粒间发生交联团聚，进而通过纳米金溶液颜色的变化(由红到蓝)实现对细菌的现场快速可视化检测。
本发明通过实验验证了本发明提供的检测方法可检测出103CFU/mL及以上的细菌浓度。检测细菌浓度的方法为：
溶液颜色由红色变为蓝色，检测样品的细菌浓度≥103CFU/mL；
溶液颜色无肉眼可识别的变化，检测样品的细菌浓度＜103CFU/mL。
作为优选，Cu2+的浓度为1～10μM。
在本发明提供的一些实施例中，Cu2+的浓度为5μM。
作为优选，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为1～20nM。
在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为5.4nM。
作为优选，孵育的时间为10～30min。
在本发明提供的一些实施例中，孵育的时间为20min。
作为优选，孵育的温度为20～40℃。
在本发明提供的一些实施例中，孵育的温度为室温(25℃)。
在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的制备方法为：
采用有机合成方法制得巯基修饰的炔基功能分子；
采用有机合成方法制得巯基修饰的叠氮功能分子；
巯基修饰的炔基功能分子、巯基修饰的叠氮功能分子分别和金纳米颗粒通过巯基置换反应制得炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的一端为巯基，另一端为炔基基团。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的一端为巯基，另一端为叠氮基团。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的制备方法为：
三苯基氯甲烷与巯基烷酸反应，得到中间产物1；
NHS(N-羟基琥珀酸亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)与中间产物1反应，得到中间产物2；
中间产物2与2,2’-(乙烯二氧)双乙胺反应，得到中间产物3；
丙炔酸、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)与中间产物3反应，得到中间产物4；
中间产物4经巯基脱保护后获得巯基修饰的炔基功能分子。
在本发明提供的一些实施例中，巯基烷酸为巯基十一烷酸。但本发明所用巯基烷酸并非限定于此，巯基烷酸可用其他不同C链的巯基烷酸代替，C链长度从6(巯基己烷酸)到11(巯基十一烷酸)均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的制备方法为：
3-溴丙酸和叠氮化钠反应，得到中间产物5；
中间产物5与EDC、中间产物3反应，得到中间产物6；
中间产物6经巯基脱保护后获得巯基修饰的叠氮功能分子。
在本发明提供的一些实施例中，细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌中的一种或两者以上的混合物。但本发明能够检测的细菌并非限定于此，由于细菌的表面均存在氧化还原体系，因此本发明同样适用于其它种类的细菌。
作为优选，金纳米颗粒采用化学还原法、微乳液法或晶种生长法合成。
在本发明提供的一些实施例中，金纳米颗粒采用化学还原法合成。
本发明还提供了一种细菌检测试剂盒，包括Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
作为优选，Cu2+的浓度为1～10μM。
在本发明提供的一些实施例中，Cu2+的浓度为5μM。
作为优选，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为1～20nM。
在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为5.4nM。
在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的制备方法为：
采用有机合成方法制得巯基修饰的炔基功能分子；
采用有机合成方法制得巯基修饰的叠氮功能分子；
巯基修饰的炔基功能分子、巯基修饰的叠氮功能分子分别和金纳米颗粒通过巯基置换反应制得炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的制备方法为：
三苯基氯甲烷与巯基烷酸反应，得到中间产物1；
NHS、DCC与中间产物1反应，得到中间产物2；
中间产物2与2,2’-(乙烯二氧)双乙胺反应，得到中间产物3；
丙炔酸、EDC与中间产物3反应，得到中间产物4；
中间产物4经巯基脱保护后获得巯基修饰的炔基功能分子。
在本发明提供的一些实施例中，巯基烷酸为巯基十一烷酸。但本发明所用巯基烷酸并非限定于此，巯基烷酸可用其他不同C链的巯基烷酸代替，C链长度从6(巯基己烷酸)到11(巯基十一烷酸)均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的制备方法为：
3-溴丙酸和叠氮化钠反应，得到中间产物5；
中间产物5与EDC、中间产物3反应，得到中间产物6；
中间产物6经巯基脱保护后获得巯基修饰的叠氮功能分子。
本发明提供了一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒。该检测方法包括：将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒(AuNPs)混合，孵育，观察溶液颜色的变化，获得细菌浓度。本发明至少具有如下优势之一：
由于点击反应及细菌还原Cu2+的过程都具有很强的选择性，因此，通过此点击反应辅助的纳米金比色法可以大大提高细菌的检测特异性，不受样品介质的影响；
由于极其微量的Cu+就可以引发点击反应，因此相比于普通的纳米金比色法，此方法也具有更高的细菌检测灵敏度，检测限可达103CFU/mL；
与细菌培养法和PCR法相比，本发明所建立的细菌检测技术具有快速(20分钟)、操作简单(简单混合，无需复杂仪器辅助)及结果肉眼可见(通过AuNPs溶液颜色的变化)的优点，可实现对细菌的现场快速可视化检测。
附图说明
图1示实施例1制备得到的AuNPs的透射电镜图；
图2示本发明基于点击反应辅助的纳米金比色法的细菌现场快速可视化检测结果；
图3示E.coli样品的现场快速可视化检测；其中，A示孵育前溶液的颜色为红色，B示孵育后溶液的颜色变为蓝色；
图4示E.coli样品的现场快速可视化检测；其中，a示功能化的AuNPs溶液；b示功能化的AuNPs与DMEM的混合溶液；c示功能化的AuNPs、DMEM、Cu2+及106CFU/mL浓度的E.coli的混合溶液；
图5示不同浓度E.coli样品的现场快速可视化检测结果；
图6示103CFU/mL浓度的S.aureus、B.subtilis及P.aeruginosa样品的现场快速可视化检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
点击反应：点击反应(Click reaction)是由Sharpless等提出的新型组合化学合成方法，叠氮化合物与末端炔基在Cu+催化下通过环加成反应形成碳亚二胺，该反应具有条件温和、高效及产物单一的特点，并且具有很好的生物相容性。
纳米金比色法：纳米金比色法是基于金纳米颗粒(AuNPs)在分散及团聚状态下其等离子共振吸收波长的不同所建立的一种比色分析方法，具有快速、操作简单、结果肉眼可见、无需复杂仪器测量等优点。
本发明提供的细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 炔基及叠氮基团修饰的金纳米颗粒的制备
(一)AuNPs的制备
通过柠檬酸三钠还原氯金酸合成得到了13nm的AuNPs，其电镜照片如图1所示。
(二)巯基修饰的炔基功能分子的合成
在50mL的甲苯溶液中加入3.1g的三苯基氯甲烷和2.8g的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡混匀后再向其中加入4g的11-巯基十一烷酸，室温搅拌反应4小时后，经旋转蒸发、水洗及干燥后得到6.2g的中间产物1。
取6g的中间产物1、1.56g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.161g的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到50mL的无水二氯甲烷(DCM)中混匀，然后再向其中加入2.76g的二环己基碳二亚胺(DCC)，5℃反应5小时后室温静置过夜，再经DCM洗脱及旋转蒸发后得到7g的中间产物2。
向50mL的DCM中加入7g的中间产物2及32g的2,2’-(乙烯二氧)双乙胺，室温磁力搅拌反应12小时后，经过滤、水洗及干燥后得到7.5g的中间产物3。
向50mL的DCM中加入3.7g的中间产物3、1.6g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.57g的丙炔酸，混匀后室温反应12小时，然后经水洗及干燥后得到0.8g的中间产物4。
向50mL的DCM中加入2.5mL的三氟乙酸、0.7g的中间产物4及0.65g的三乙基硅烷，室温搅拌反应5小时后，经碱洗、干燥后最终得到0.85g的巯基修饰的炔基功能分子。
巯基修饰的炔基功能分子的合成步骤如下：
(三)巯基修饰的叠氮功能分子的合成
在10mL的DMF中加入2.7g的3-溴丙酸和3.48g的叠氮化钠，60OC搅拌反应48小时后，经水洗、干燥后得到2.1g的中间产物5。
在50mL的DCM中加入1.6g的EDC、0.92g的中间产物5及3.7g的中间产物3，室温反应12小时后，经水洗及干燥后得到2.46g的中间产物6。
向50mL的DCM中加入2.5mL的三氟乙酸、0.6g的中间产物6及0.47g的三乙基硅烷，室温搅拌反应5小时后，经碱洗、干燥后最终得到0.2g的巯基修饰的叠氮功能分子。
巯基修饰的叠氮功能分子的合成步骤如下：
(四)AuNPs的炔基及叠氮基团功能化
分别向1mL的AuNPs(5.4nM)中加入第(一)部分制得的5.4μL的巯基修饰的炔基和第(三)部分制得的叠氮功能分子(100μM)，室温搅拌过夜，然后通过离心沉淀，最终得到炔基和叠氮功能化的AuNPs。
实施例2 点击反应辅助的大肠杆菌纳米金比色检测
将106colony-forming units(CFU)/mL浓度的大肠杆菌(E.coli)样品加入到含有Cu2+(5μM)、同浓度的实施例1制得的炔基和叠氮基团功能化的AuNPs(5.4nM)溶液中，经过20分钟的孵育后，AuNPs溶液颜色的变化(由红到蓝，图2，3)，从而证明了本发明提供的方法对细菌进行现场快速可视化检测的可行性。
实施例3 检测特异性考察
DMEM是一种常用的细胞培养基，里面含有众多的物质成分(如蛋白、糖、电解质等)，对常规的纳米金比色反应有严重干扰。因此，选用DMEM作为细菌的样品介质，并基于本发明所述的细菌检测法对DMEM中存在的细菌进行了检测。如图4所示，在Cu2+及E.coli存在的情况下，功能化AuNPs与DMEM培养基的混合溶液有显色反应的发生；而在Cu2+及E.coli不存在的情况下，功能化AuNPs与DMEM培养基的混合溶液则无显色反应。上述结果表明，本发明所述的点击反应辅助的纳米金比色法不受细菌样品介质的干扰，具有较强的细菌检测特异性。
实施例4 检测灵敏度考察
采用实施例2的检测方法对不同浓度的E.coli样品进行检测，结果显示本发明可以快速实现103CFU/mL浓度E.coli样品的现场可视化检测(图5)，此检测限可以满足大部分细菌实际检测的需求。
实施例5 其他种类细菌检测
采用实施例2的检测方法对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)样品进行检测。经过验证，此点击反应辅助的纳米金比色法同样适用于其他种类细菌的快速可视化检测，如图6所示，本发明同样实现了对103CFU/mL浓度金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)样品的现场快速可视化检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种细菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒混合，孵育，观察溶液颜色的变化，获得细菌浓度；
溶液颜色由红色变为蓝色，检测样品的细菌浓度≥103CFU/mL；
溶液颜色无肉眼可识别的变化，检测样品的细菌浓度＜103CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Cu2+的浓度为1～10μM。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为1～20nM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为20～40℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的制备方法为：
采用有机合成方法制得巯基修饰的炔基功能分子；
采用有机合成方法制得巯基修饰的叠氮功能分子；
所述巯基修饰的炔基功能分子、所述巯基修饰的叠氮功能分子分别和金纳米颗粒通过巯基置换反应制得炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述巯基修饰的炔基功能分子的制备方法为：
三苯基氯甲烷与巯基烷酸反应，得到中间产物1；
NHS、DCC与所述中间产物1反应，得到中间产物2；
所述中间产物2与2,2’-(乙烯二氧)双乙胺反应，得到中间产物3；
丙炔酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与所述中间产物3反应，得到中间产物4；
所述中间产物4经巯基脱保护后获得巯基修饰的炔基功能分子。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述巯基烷酸为巯基十一烷酸。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述巯基修饰的叠氮功能分子的制备方法为：
3-溴丙酸和叠氮化钠反应，得到中间产物5；
所述中间产物5与EDC、所述中间产物3反应，得到中间产物6；
所述中间产物6经巯基脱保护后获得巯基修饰的叠氮功能分子。
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