CN104914088B - 一种基于金棒核‑银卫星组装体对Mucin‑1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于金棒核‑银卫星组装体对Mucin‑1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，属于分析化学技术领域。本发明通过金纳米棒的合成、银纳米粒子的合成、金纳米棒上修饰Mucin‑1 适配体Mucin‑1 aptamer，金纳米棒偶联拉曼信标分子4‑ATP，银纳米粒子上修饰与适配体部分互补序列Mucin‑1 CS，金棒核‑银卫星结构的组装，表面增强拉曼光谱表征，建立拉曼信号与Mucin‑1浓度的标准曲线等步骤实现。本发明制备出组装结构均一、可控并且具有表面增强拉曼光谱活性的金棒核‑银卫星组装体，并将其应用于Mucin‑1的检测，与传统检测方法相比成本低、灵敏度高、特异性好、方便快捷，具有很好的实际应用前景，是一种理想的Mucin‑1超灵敏检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
Mucin-1是一种膜结合型跨膜糖基化蛋白，其分子由肽核心和糖链组成，在上皮细胞更新分化、维持上皮完整性及肿瘤的发生、转移等方面都起到重要作用，广泛存在于正常腺细胞和多种癌细胞表面。在恶性肿瘤细胞中的表达量明显升高，呈非极性，均匀地分布在癌细胞的表面，并出现异常糖基化，其糖链的糖基化不全，糖链变短，分支少，结构简单，导致新的糖链表位形成和肽链表位暴露，使Mucin-1成为可被免疫系统识别的肿瘤抗原。Mucin-1对肿瘤的发生和发展及转移等有重要影响，对肿瘤诊断、预后判断及治疗有重要意义。
所以，本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测Mucin-1方法，其基于纳米材料的自组装技术构建了具有表面增强拉曼光谱的金棒核-银卫星纳米结构，并以此作为检测基底。将拉曼信号与目标物的浓度建立标准曲线，以此来定量检测Mucin-1。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法。
本发明的技术方案：一种基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，将修饰有Mucin-1适配体Mucin-1 aptamer的金纳米棒，和修饰有与适配体部分互补序列Mucin-1 CS的银纳米粒子，组装得到金棒核-银卫星组装体，当存在待测物Mucin-1时，组装体的结构发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；
检测传感器的构建
（1）金纳米棒的合成
晶种合成：室温下，将0.05mL浓度为4g/L的三水合四氯金酸，加入到1mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，溶液颜色由无色变成黄褐色，然后加入0.12mL新配制的0.01M 硼氢化钠溶液，快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
金纳米棒生长：5mL的2g/L 的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入4mL的超纯水，混匀，0.125 mL的0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65µL、0.1M 抗坏血酸溶液加入。
（2）10 nm 粒径的银纳米粒子的合成
锥形瓶中加入超纯水20mL、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 5mL、0.1M 硼氢化钠（新配）0.6mL，冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL1%的PVP，5mL 1M的硝酸银溶液，反应后的溶液80℃水浴老化3h，冷却后放4℃冰箱待用。
（3）金纳米棒上修饰适配体Mucin-1 aptamer：
采用晶种生长法合成金纳米棒，将其离心浓缩10倍后，以0.5 mM pH 7.2 的Tris-HNO3缓冲液进行重悬。加入巯基化的适配体Mucin-1 aptamer，使得适配体与金纳米棒的摩尔比为500︰1。室温孵育3h后，加入NaCl溶液至其浓度为20mM，之后每隔1h加一次NaCl，直至NaCl的终浓度为100mM。老化过夜后，离心3次除去溶液中未反应的适配体，以0.5 mM pH7.2 的Tris-HNO3 重悬，得到修饰适配体Mucin-1 aptamer金纳米棒溶液，待用；
Mucin-1 aptamer：
5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T -3’ ；
（4）金纳米棒偶联拉曼信标分子
在步骤（3）制备的修饰适配体Mucin-1 aptamer金纳米棒溶液中，加入信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）保持其终浓度为10μM，室温孵育8h。
（5）银纳米粒子偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS（complementarysequences）；
采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为10nm的银纳米粒子。银纳米粒子离心浓缩2倍后，用1mM pH7.2的Tris-HNO3 重悬，加入巯基化部分互补序列Mucin-1 CS，使得Mucin-1 CS与银纳米粒子的摩尔比为5︰1。室温孵育过夜后，离心去除未反应的Mucin-1CS，用1mM pH7.2的Tris-HNO3重悬待用；
Mucin-1 CS：5’-SH- AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG -3’；
（6）金棒核-银卫星结构的组装
取50μL修饰了Mucin-1 aptamer的金纳米棒，与80μL修饰Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS的银纳米粒子混匀杂交，并加入Mg（NO3）2至其浓度为20 mM进行老化，室温下孵育12 h，得到金棒核-银卫星组装体。
（二）表面增强拉曼光谱检测，建立金棒核-银卫星组装体表面增强拉曼信号与Mucin-1浓度的标准曲线，根据Mucin-1浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号对Mucin-1进行检测。
取相同体积的金棒核-银卫星组装体混合液，分别加入不同浓度的目标物Mucin-1，室温孵育8h，由于Mucin-1会竞争的与Mucin-1 aptamer反应，随着Mucin-1浓度的增加，金棒核-银卫星组装体会有不同程度的解散，因此得到不同的拉曼信号强度。在532nm的激发波长下，根据Mucin-1浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号对Mucin-1进行检测。
本发明的有益效果：本发明提供了一种基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，具有灵敏度高、检测限低、方便、快捷的优点，有着非常好的实际应用前景。
附图说明
图 1 本发明金棒、银纳米粒子和金棒核-银卫星手性组装体的透射电镜照片。
图2本发明中向金棒核-银卫星手性组装体中加入不同浓度的Mucin-1，导致的拉曼光谱的变化图。
图 3 本发明中的拉曼光谱检测Mucin-1的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
（1）检测传感器的构建
a、金纳米棒的合成
晶种合成：室温下，将0.05mL浓度为4g/L的三水合四氯金酸，加入到1mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，溶液颜色由无色变成黄褐色，然后加入0.12mL新配制的0.01M 硼氢化钠溶液，快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
金纳米棒生长：5mL的2g/L 的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入4mL的超纯水，混匀，0.125 mL的0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65µL、0.1M 抗坏血酸溶液加入。
b、10nm 粒径的银纳米粒子的合成
锥形瓶中加入超纯水20mL、1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP 5mL、0.1M 硼氢化钠（新配）0.6mL，冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1%的PVP，5mL 1M的硝酸银溶液，反应后的溶液80℃水浴老化3h，冷却后放4℃冰箱待用。
c、金纳米棒上修饰适配体Mucin-1 aptamer
采用晶种生长法合成金纳米棒，将其离心浓缩10倍后，以0.5 mM pH 7.2 的Tris-HNO3缓冲液进行重悬。加入巯基化的适配体Mucin-1 aptamer，使得适配体与金纳米棒的摩尔比为500︰1。室温孵育3h后，加入NaCl溶液至其浓度为20mM，之后每隔1h加一次NaCl，直至NaCl的终浓度为100mM。老化过夜后，离心3次除去溶液中未反应的适配体，以0.5 mM pH7.2 的Tris-HNO3 重悬，得到修饰适配体Mucin-1 aptamer金纳米棒溶液，待用；
Mucin-1 aptamer：
5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T -3’ ；
d、金纳米棒偶联拉曼信标分子
在步骤c制备的修饰适配体Mucin-1 aptame金纳米棒溶液中，加入信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）保持其终浓度为10μM，室温孵育8h。
e、银纳米粒子偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS（complementarysequences）；
采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为10nm的银纳米粒子。银纳米粒子离心浓缩2倍后，用1mM pH7.2的Tris-HNO3 重悬，加入巯基化部分互补序列Mucin-1 CS，使得Mucin-1 CS与银纳米粒子的摩尔比为5︰1。室温孵育过夜后，离心去除未反应的Mucin-1CS，用1mM Tris-HNO3重悬待用；
Mucin-1 CS：5’-SH- AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG -3’；
f、金棒核-银卫星结构的组装
取50μL修饰了Mucin-1 aptamer的金纳米棒，与80μL修饰Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS的银纳米粒子混匀杂交，并加入Mg（NO3）2至其浓度为20mM进行老化，室温下孵育12h，得到金棒核-银卫星组装体。金棒、银纳米粒子、金棒核-银卫星手性组装体的透射电镜照片如图1所示。
（2）表面增强拉曼光谱检测，建立金棒核-银卫星组装体表面增强拉曼信号与Mucin-1浓度的标准曲线。
取相同体积的金棒核-银卫星组装体混合液，分别加入不同浓度的目标物Mucin-1，室温孵育8h，由于Mucin-1会竞争的与Mucin-1 aptamer反应，随着Mucin-1浓度的增加，金棒核-银卫星组装体会有不同程度的解散，因此得到不同的拉曼信号强度。向金棒核-银卫星手性组装体中加入不同浓度的Mucin-1，导致的拉曼光谱的变化图如图2所示。
在532nm的激发波长下，根据Mucin-1浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号对Mucin-1进行检测。拉曼光谱检测Mucin-1的标准曲线图如图3所示。
Claims (2)
1.一种基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，其特征在于：将修饰有Mucin-1适配体Mucin-1 aptamer的金纳米棒，和修饰有与适配体部分互补序列Mucin-1 CS的银纳米粒子，组装得到金棒核-银卫星组装体，当存在待测物Mucin-1时，组装体的结构发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；具体步骤如下：
（1）检测传感器的构建
a、金纳米棒上修饰适配体Mucin-1 aptamer：采用晶种生长法合成金纳米棒，将其离心浓缩10倍后，以0.5mM pH7.2的Tris-HNO3缓冲液进行重悬；加入巯基化的适配体Mucin-1aptamer，使得适配体与金纳米棒的摩尔比为500︰1；室温孵育3h后，加入NaCl溶液至其浓度为20mM，之后每隔1h加一次NaCl，直至NaCl的终浓度为100mM；老化过夜后，离心3次除去溶液中未反应的适配体，以0.5 mM pH7.2 的Tris-HNO3 重悬，得到修饰适配体Mucin-1aptamer金纳米棒溶液，待用；
Mucin-1 aptamer：5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T -3’ ；
b、金纳米棒偶联拉曼信标分子：在步骤a制备的修饰适配体Mucin-1 aptamer金纳米棒溶液中，加入信标分子4-氨基苯硫酚4-ATP保持其终浓度为10μM，室温孵育8h；
c、银纳米粒子偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS；
采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为10nm的银纳米粒子，银纳米粒子离心浓缩2倍后，用1mM pH7.2的Tris-HNO3 重悬，加入巯基化部分互补序列Mucin-1 CS，使得Mucin-1 CS与银纳米粒子的摩尔比为5︰1；室温孵育过夜后，离心去除未反应的Mucin-1 CS，用1mMpH7.2的Tris-HNO3重悬待用；
Mucin-1 CS：5’-SH-AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG -3’；
d、金棒核-银卫星结构的组装：取50μL修饰了Mucin-1 aptamer的金纳米棒，与80μL修饰Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS的银纳米粒子混匀杂交，并加入Mg（NO3）2至其浓度为20 mM进行老化，室温下孵育12 h，得到金棒核-银卫星组装体；
（2）表面增强拉曼光谱检测：建立金棒核-银卫星组装体表面增强拉曼信号与Mucin-1浓度的标准曲线，根据Mucin-1浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号对Mucin-1进行检测。
2.根据权利要求1所述基于金棒核-银卫星组装体对Mucin-1表面增强拉曼信号超灵敏检测的方法，其特征在于步骤（2）具体如下：
取相同体积的金棒核-银卫星组装体混合液，分别加入不同浓度的目标物Mucin-1，室温孵育8h，由于Mucin-1会竞争的与Mucin-1 aptamer反应，随着Mucin-1浓度的增加，金棒核-银卫星组装体会有不同程度的解散，因此得到不同的拉曼信号强度；在532nm的激发波长下，根据Mucin-1浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号对Mucin-1进行检测。
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