CN104910404A - 一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵及其制备方法和相关应用，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖、甘油、纳米银混合醋酸溶液；(2)超低温冷冻；(3)真空冷冻干燥成形；(4)加热处理即可。本发明的有益效果是：本发明所提供的壳聚糖-甘油-纳米银海绵制备方法简单，生产周期短，不需要加入醛类或者碱液处理，制作过程不产生废水废气。此外，通过该方法制备得到的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，具有良好生物安全性、透气性、吸水性和抗菌活性，且对正常人体细胞没有毒性，在伤口敷料和其它抗菌材料有广泛的应用前景。

Description

一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵及其制备方法和相关应用。

背景技术

壳聚糖以其独特的生物材料特性，如良好的生物相容性、能促进伤口凝血、缩短伤口愈合时间等，在医用敷料、抗菌材料方面得到人们的广泛关注。目前已经商品化的壳聚糖外用敷料有医用CAD(醋酸纤维素)壳聚糖敷料、壳聚糖抗菌护创膜、邦邦贴等。此外，单纯的壳聚糖敷料对病原菌的抑制效果并不理想。为了提高壳聚糖敷料的抗菌活性，普遍往壳聚糖中加入适量的抗菌剂。纳米银作为无机抗菌剂，具有高效广谱的杀菌效果，与一般的抗生素相比具有更高的稳定性以及不易产生耐药性。因此，添加纳米银的伤口敷料，可以加强抗菌消炎、促进伤口愈合等作用。

关于壳聚糖-纳米银敷料的制备方法有很多，但总体而言，由于制作敷料的壳聚糖分子量较高，不易溶于水，因此作为原料的壳聚糖粉末在溶解过程中需要加入一定量的醋酸以促进溶解，然后通过各种方法如流涎法、烘干法、冷冻干燥法、静电纺丝法等进一步加工定型。然而经醋酸酸化后的壳聚糖在水中会迅速溶解，所以在制成成品之前需要除去醋酸，通常有浸泡碱液、浸泡无水乙醇、加醛类交联剂等方法。这些方法通常会带来大量的废水或废气，为了除去醋酸需要花费较多的成本，且加入有毒性的醛类交联剂还将增加敷料的潜在危害。

甘油是一种安全无毒的添加剂，在已报道的壳聚糖敷料中，甘油仅用作进一步增强壳聚糖敷料的柔软性、吸水性和保湿性等性能。如已公开的发明专利CN103480032A报道了一种由壳聚糖、纳米银、甘油和京尼平为主要成份制备的水凝胶状敷料。其中甘油的含量非常低，仅占壳聚糖质量的0.6％不到，在敷料中作为改善机械强度的添加剂使用。该方法使用京尼平作为交联剂去除醋酸，但京尼平价格昂贵，而且所制备出的敷料为水凝胶状，缺乏透气性能。

已公开的发明专利CN104436278A报道了一种含甘油的壳聚糖海绵状敷料制作方法。该方法加入戊二醛作为交联剂，然后用无水乙醇除去残留的醋酸。而该方法中的甘油仅起到提高敷料的柔软程度的作用。由于该方法加入了戊二醛，所以敷料有一定的潜在毒性，同时需要耗费比较大量的无水乙醇才能彻底清除残留的醋酸，且在除酸的同时也会导致敷料中的甘油流失，因此该方法存在明显的局限性。

已公开的发明专利CN104069537A报道了一种由海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、壳聚糖为主要成份，经过冷冻干燥方法后制备得到的伤口敷料。该方法需要反复冷冻干燥三次，且需要通过浸泡碱溶液除酸，最后浸泡甘油溶液得到成品。该方法中的甘油仅用于提高敷料的吸水性和降低与伤口组织的粘附性。其中甘油的标称投入量虽然远远超过壳聚糖的含量，达到了壳聚糖质量的10倍以上，但由于采取的添加方法是把敷料浸泡在甘油溶液中，因此甘油的利用率较低，也不便控制敷料中的甘油含量。此外该过程复杂繁琐，而且还带来碱性废水问题。

已公开的发明专利CN103705968A报道了一种由壳聚糖、硼酸盐生物活性玻璃、聚乙烯醇和甘油组成，经冷冻干燥制备得到的伤口敷料。该方法引入碱性的硼酸盐去除壳聚糖中的醋酸。由于甘油冻结点较低，使用过多会影响敷料的冷冻效果，因此该方法限定甘油的量不超过壳聚糖质量的0.3％。甘油在当中仅能起到增塑和低温保护的作用，而不能发挥甘油的亲水、润滑、增加敷料柔软度等作用。此外，敷料中加入碱性的硼酸盐虽然有促进伤口愈合的作用，但与成份中的醋酸中和反应后会生成硼酸，与伤口长期接触不仅不能促进愈合，反而会造成一定的伤口刺激性甚至中毒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提出一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵，其不需要加入醛类或者碱液处理。

为此，本发明提供以下的技术方案：一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖、甘油、纳米银混合醋酸溶液；(2)超低温冷冻；(3)真空冷冻干燥成形；(4)加热处理即可。

按上述方案，所述的壳聚糖、甘油、纳米银混合醋酸溶液配比为：每100mL浓度为0.5～2wt％的醋酸溶液中，溶解有1～3g壳聚糖、1～3mL甘油、0.5～6mg纳米银。

按上述方案，所述壳聚糖脱乙酰度为70-100％，粘度为100-200cPa·s。

按上述方案，所述的超低温冷冻是将壳聚糖、甘油、纳米银混合溶液置于-50～-80℃的超低温冰箱环境中，冷冻1～2h，使溶液完全凝固。

按上述方案，所述真空冷冻干燥成形的条件为：冷冻干燥机冷阱温度在-40℃以下，真空度≤10Pa，冷冻干燥时间为12h以上。

按上述方案，所述的加热处理是将冻干成形的海绵置于65～85℃的烘箱中加热1～3h。

上述任意一项制备方法所得壳聚糖-甘油-纳米银海绵。

所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵作为伤口敷料或抗菌材料的应用。

本发明的基本原理是加入适量的甘油，通过酯化反应去除醋酸。首先，在超低温的环境下使壳聚糖、甘油、纳米银、醋酸的混合溶液在短时间内凝固成块状，再通过冷冻干燥法使之制成疏松多孔的海绵状初品。这时壳聚糖海绵中含有甘油、纳米银以及与壳聚糖分子结合的醋酸。为了除去残留的醋酸，把壳聚糖海绵初品放入一定温度的烘箱中。壳聚糖海绵中的醋酸在加热环境下将通过与甘油的酯化反应，转变成无毒无刺激性的单醋酸甘油酯，从而使壳聚糖海绵中残留的醋酸完全去除。在这个制备过程中不产生任何废水废气，且仍能很好地保持了壳聚糖海绵的多孔性和伤口修复能力；通过加入甘油，不仅能有效去除醋酸，而且增强了海绵的柔韧性和吸水性。通过甘油与醋酸在加热条件下反应从而除去醋酸的方法目前还未见报道。

本发明的有益效果是：本发明所提供的壳聚糖-甘油-纳米银海绵制备方法简单，生产周期短，不需要加入醛类或者碱液处理，制作过程不产生废水废气。此外，通过该方法制备得到的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，具有良好生物安全性、透气性、吸水性和抗菌活性，且对正常人体细胞没有毒性，在伤口敷料和其它抗菌材料有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵表面的SEM照片；

图2为对比例1所制备的壳聚糖海绵和实施例2所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵在水中浸泡后的照片；

图3为实施例3所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵和对比例1所制备的所制备的壳聚糖海绵的抑菌圈测试照片；

图4为小鼠伤口愈合测试照片，其中从左到右依次为空白对照组、爱可欣^TM敷料组和实施例5组小鼠伤口的愈合情况；

图5为对实施例1至4做细胞毒性测试的结果，其中横坐标代表培养1-4天后的结果；纵坐标为细胞的存活率(与第1天空白对照组作比较)。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

对比例1

本对比例制备不含甘油和纳米银的壳聚糖海绵，在后述的部分实施例中作为对照样品。

称取2.0g壳聚糖，溶于100mL浓度为1.5wt％的醋酸溶液中。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-80℃预冷冻1h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为：冷阱温度为-50℃，真空度为10Pa，冷冻时间为16h。经冷冻干燥后得到成品。

实施例1 壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，包括以下步骤：

称取1.0g壳聚糖，溶于100mL浓度为0.5wt％的醋酸溶液中，完全溶解后加入1mL甘油和0.5mg纳米银。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-50℃预冷冻2h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，然后放置在烘箱中85℃烘干1h得到成品。

通过SEM测试本实施例所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵产品，其表面微观结构如图1所示。由图可见，通过本发明方法制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，表面为致密的多孔结构，孔径在100-200μm之间，这种多孔结构使敷料具有良好的吸水性与透气性。

实施例2 壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，包括以下步骤：

称取1.5g壳聚糖，溶于100mL浓度为2wt％的醋酸溶液中，完全溶解后加入3mL甘油和2mg纳米银。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-60℃预冷冻1.5h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，然后放置在烘箱中65℃烘干3h得到成品。

将本实施例制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵与对比例1所制备的壳聚糖海绵同时浸泡在去离子水中。观察发现如图2所示，对比例1的不含甘油和纳米银的壳聚糖海绵与水接触的边缘开始模糊和溶解，而本实施例所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵则能将水分吸收进去而没有溶解。测试表明，通过本发明方法所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，无需加入碱性溶液或者醛类交联剂等方法即可达到除酸目的，以防止壳聚糖海绵在水中溶解。

实施例3 壳聚糖-甘油-纳米银海绵的抑菌圈试验，包括以下步骤：

产品的制备：称取2.0g壳聚糖，溶于100mL浓度为1.5wt％的醋酸溶液中，完全溶解后加入2mL甘油和4mg纳米银。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-80℃预冷冻1h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，然后放置在烘箱中70℃烘干2h得到成品。

产品的灭菌包装：得到的壳聚糖-甘油-纳米银海绵剪裁成直径1cm(厚度为0.2cm)的圆形小片，浸泡在去离子水中，并经过121℃高压蒸汽灭菌20min后，在无菌洁净空间封装，得到无菌的壳聚糖-甘油-纳米银海绵产品。另外作为本实施例实验的对照组，把对比例1的样品经过同样的方法作剪裁和灭菌处理。

将本实施例所制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵作抑菌圈测试，其中以对比例1制备的壳聚糖敷料样品作为对照组，分别测试对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多重耐药大肠杆菌的抗菌活性。实验结果如图3所示，不含纳米银的对比例1均对以上四种病原菌无抗菌活性，含纳米银的实施例3则可见敷料周边有明显的抑菌圈。测试表明，通过本发明方法制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，对于伤口感染常见的病原菌(包括耐药菌株)均有强效的抑菌作用。

实施例4 壳聚糖-甘油-纳米银海绵银释放试验，包括以下步骤：

产品的制备：称取3.0g壳聚糖，溶于100mL浓度为2wt％的醋酸溶液中，完全溶解后加入2mL甘油和6mg纳米银。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-60℃预冷冻2h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，然后放置在烘箱中80℃烘干1h得到成品。

对本实施例制作的产品作银释放测试，来说明本发明所述壳聚糖-甘油-纳米银海绵中纳米银颗粒的结合稳定性。作为对照样品，在此还选用了爱可欣纳米银纱布这一商品敷料作测试。测试方法如下：把本实施例制作的产品和爱可欣纳米银纱布，均裁剪成质量为20mg的测试样品，充分浸泡在5mL生理盐水中并放置在37℃的恒温环境中，每隔24h测量浸液在450nm波长下的吸光值，通过吸光值的变化可以判断敷料中纳米银的溶出情况。测试结果如表1所示。

测试结果表明，通过本发明方法制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵，其中的纳米银具有很高的稳定性，与商品敷料爱可欣纳米银纱布相比，具有更高的结合能力，因此也具有更高的生物安全性。

表1：产品的纳米银溶出试验

实施例5 壳聚糖-甘油-纳米银海绵治疗小鼠背部切割伤的试验，包括以下步骤：

产品的制备：称取2.0g壳聚糖，溶于100mL浓度为1wt％的醋酸溶液中，完全溶解后加入2mL甘油和2mg纳米银。将得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低温冰箱中-70℃预冷冻1h。待完全凝固后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，然后放置在烘箱中70℃烘干2h得到成品。

产品的灭菌包装：得到的壳聚糖-甘油-纳米银海绵剪裁成直径1cm(厚度为0.2cm)的小片，浸泡在去离子水中，并经过121℃高压蒸汽灭菌30min后，在无菌洁净空间封装，得到无菌的壳聚糖-甘油-纳米银海绵产品。

使用本实施例制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵产品进行治疗小鼠背部切割伤的试验，来说明本发明产品的伤口愈合效果。测试方法如下：以健康的BALB/c小鼠为实验对象，全雄性，6-8周大，体重在20g左右，以5只小鼠为一组，随机分为3组，分别为“空白对照”组、“爱可欣^TM敷料”(一种已经商品化的含纳米银纱布敷料)组以及“实施例5”组。对小鼠麻醉后，用手术刀在背部划出长约10mm的伤口，使皮下组织充分暴露。“空白对照”组不作任何处理，另外两组分别在伤口表面覆盖相应的敷料并包扎固定。处理伤口后将小鼠根据分组放进小鼠笼里继续饲养，并在术后若干天观察小鼠伤口的愈合情况，实验照片如图4所示。从小鼠伤口愈合情况可见，在术后第8天，使用实施例5制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的小鼠伤口已基本愈合，而另外两组仍可见明显的伤口。由此可见，通过本发明方法所得到的产品，具有良好的促进伤口愈合能力。

实施例6 壳聚糖-甘油-纳米银海绵的细胞毒性试验，包括以下步骤：

将实施例1-4制备得到的壳聚糖-甘油-纳米银海绵产品裁剪成尺寸均一的圆形小片，直径为1cm，对HEK293(人胚肾细胞)作细胞毒性测试，具体步骤如下：取处于对数生长期且完全贴壁的HEK293细胞配成细胞悬液，调节浓度至每1mL含10⁵数量级的细胞。在24孔板中每孔放入一片测试的圆形小片，并加入1mL的细胞悬液继续培养；另外配制一组不加任何样品只添加1mL细胞悬液的空白对照组。用MTT法依次对培养了1-4天后的细胞作存活率测试，具体测试方法：往培养了相应天数的24孔板中加入100μL浓度为5mg/mL的MTT(噻唑蓝)溶液，在37℃下放置6h后吸去多孔板中的液体并加入750μL DMSO(二甲基亚砜)，在摇床中以150rpm/min的速度振荡20min使生成的蓝紫色结晶充分溶解，然后采用酶联免疫检测仪测定其在490nm波长下的光吸收值。通过与第1天空白对照组的吸收值相比较算出各组细胞在培养1-4天后的存活率，由此反映出细胞活性。结果如图5所示，随着培养时间的增加，相对于空白对照组，实施例1-4组的细胞均有明显生长。测试结果表明，通过本发明方法制备的壳聚糖-甘油-纳米银海绵对人体正常细胞没有毒性，而且对细胞的生长有促进作用。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖、甘油、纳米银混合醋酸溶液；(2)超低温冷冻；(3)真空冷冻干燥成形；(4)加热处理即可。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖、甘油、纳米银混合醋酸溶液配比为：每100mL浓度为0.5～2wt％的醋酸溶液中，溶解有1～3g壳聚糖、1～3mL甘油、0.5～6mg纳米银。

3.根据权利要求2所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖脱乙酰度为70-100％，粘度为100-200cPa·s。

4.根据权利要求1所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，所述的超低温冷冻是将壳聚糖、甘油、纳米银混合溶液置于-50～-80℃的超低温冰箱环境中，冷冻1～2h，使溶液完全凝固。

5.根据权利要求1所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥成形的条件为：冷冻干燥机冷阱温度在-40℃以下，真空度≤10Pa，冷冻干燥时间为12h以上。

6.根据权利要求1所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵的制备方法，其特征在于，所述的加热处理是将冻干成形的海绵置于65～85℃的烘箱中加热1～3h。

7.权利要求1-6任意一项制备方法所得壳聚糖-甘油-纳米银海绵。

8.根据权利要求7所述的壳聚糖-甘油-纳米银海绵作为伤口敷料或抗菌材料的应用。