CN104884620A

CN104884620A - 一种棉花锌指蛋白(Czf7)及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104884620A
Application number: CN201280078044.5A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 王建胜; 梁远金; 刘捷
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2015-09-02
Also published as: WO2014101121A1

Abstract

一个来源于棉花的锌指蛋白(Czf7)及其编码基因，以及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花锌指蛋白（Czf7) 及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的锌指蛋白（Czf7) 及其编码基因，以及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。背景技术非生物胁迫,如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位,其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、半干旱地区约占国土面积的 52 %,年受旱面积达 200— 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米,因缺水而少收粮食 350— 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北,是我国缺水最严重的地区,春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状,现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大,培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来, 随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平,促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应,来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为 3 类：（1 ) 参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；（2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；（3 ) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来,通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解 (Liu Q. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406； KANG JY. 2002. Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant Cell, 14: 343-357； ABE H. 2003. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as l transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. )。

但就目前的研究状况而言,由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径及信号传递网络系统的研究提供重要的基础。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆出了棉花的一个锌指蛋白（本文命名为 Czf7)的编码基因，并测定了其 DNA 序列。并且发现通过转基因将其导入植株后，可明显改善转基因植株的抗旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个锌指蛋白 Czf7 的编码基因（本文命名为

GhCzf7), 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图 2所示的 rd29A-GhCzf7-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物抗旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID N0: 1所示。附图说明图 1是 GhCzf7的植物表达载体 Crd29A-GhCzf7-2300;)的构建流程。图 2是 GhCzf7的植物表达载体 Crd29A-GhCzf7-2300)的质粒图。

图 3是对照烟草和转基因烟草的抗旱性生长情况（图 3a为干旱前，图 3b为干旱后）； CK (左)：对照烟草；和 T1B3 (右）：转基因烟草株系。

图 4是耐干旱 T1代转基因烟草植株和不耐干旱对照烟草植株在转录水平上的验证结果。 M为 Marker (DL2000), 1-8为耐干旱 T1代转基因烟草植株， 10-13为不耐干旱对照烟草植株， 9为质粒阳性对照。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。实施例 1. 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit 所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片中提取的 mRNA 作为样本（tester) , 以未处理的棉花幼苗的叶片中提取的 mRNA 作为对照 ( driver)。具体步骤简述如下：

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-06838 )播种到灭过菌的蛭石上，在 25 °C、光周期 16h光照 /8h黑暗（光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（含有 9.39 mM KN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM NH4NO3, 0.75 mM MgS0₄， 1.5 mM CaCl₂， 50 μ M KI， 100 μ M H₃B0₃， 100 μ M MnS0₄， 30 μ M ZnS0₄, 1 μ M Na₂Mo0₄, 0.1 μ M CoCl₂， 100 μ M Na₂EDTA, 100 μ M FeS0₄) 一次。当苗株高达 25— 30 cm时用于实验。

( 2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25 °C、光周期

16h光照 /8h黑暗（光强 2000— 3000 Lx) 培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25 °C、光周期 16h光照 /8h黑暗（光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养，停止浇灌，处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3 的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C 冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片 0.5 g，用植物 RNA提取试剂盒（购自 invitrogen) 提取棉花叶片的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD_26Q/OD_28Q比值为 1.8— 2.0，表明总 RNA 纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver 混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交,通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序，将所述第二次正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接，其具体步骤如下：用 200 μ 1 PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， 2 Χ Τ4 连接酶缓冲液 5 μ 1, pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ 1，于 4°C连接过夜。取 10 μ ΐ连接反应产物，加入到 100 μ 1感受态大肠杆菌 JM109C购自 TAKARA) 中,冰浴 30 min、热休克 60秒、冰浴 2 min,另； ¾ 250 μ 1 LB培养液（含有 1% Tryptone (购自 OXOID), 0.5% Yeast Extract (购自 OXOID), 1% NaCl (购自国药））置 37°C 水浴中，以 225 rpm振荡培养 30 min,取 200 μ 1菌液接种于含 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG ( X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上, 37°C培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 540 个白色菌落 (编号： Gh-D2-001至 Gh-D2-540)。将所有白色克隆接种于含有 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 - 80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R( Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增，得到 452个阳性克隆,然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到 405个有效 EST(unigene)。实施例 2 棉花锌指蛋白编码基因 GhCzf7的克隆

克隆子 Gh-D2-324去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID NO: 3，序列分析表明该序列编码的蛋白质属于锌指蛋白，本文将 SEQIDNo: 3序列对应的全长编码基因命名为 GhCzf7，其对应的蛋白命名为 Czf7。

SEQ ID O; 3

-、·、一- --^ - -—、：： ■■· - 《-:.'二： ~ -一, ；！、

61 CA ATCAGTA ACCG GAT T CGACCTCAAC ¾TGCCGGCTT T¾CCGGAA T C CGCCA^CT

121 ¾A ^:TTCTSTG TTCTGC GC CGG GATGAT GAASTGCAAA GCCCA.CAC C TGCTAAG¾.AS

1S1 CCA^:TGT AT CGA ACCACC CAAAA CGAA GTC A AC T&AA CAA TTAAAA CCCTTT ST

241 AGT' TAGAT AACAA CC¾ TGAA TTTG T GT'T T TT TT'T TGGTQa SAC A T T

301 TCC'TGT GhCZF7全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQIDNo: 3序列，设计如下三条特异性引物，作为 5' RACE 的 3' 端特异性引物。

GhCEFT GSPlr SEQ ID 4：

GhCZF? GSP2 SEQ 10 NO: δ_; GhCZF? GSF3; SEQ ID NO: 6: 实验步骤按试剂盒说明书操作（ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQIDNO: 5与通用引物 AAP (试剂盒自带），以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQIDNO: 4) 为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 lPCR反应体系： 5 μ 1 lOXEx Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 mRNA 反转录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5和 AAP各 2.0 μ 1, 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30s， 55°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延伸 10 min。所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ 1作为模板，用 SEQ ID NO: 6与通用引物 AUAP (试剂盒自带）进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 μ Ι Εχ Taq 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 6和 AUAP各 2.0 μ 1，以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（ 94°C 变性 30 s, 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 10 min。回收第二次 PCR产物中片段约为 600bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA) , 并将其连接于 pGEM-T Easy Vector，然后转化到 JM109 (具体方法同上），随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL 氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 6与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）, 得到 3 个阳性克隆,送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。

所得的 5 ' RACE产物克隆测序后，与 SEQ ID NO: 3结果拼接。获得 GhCZF7 的 cDNA序列 SEQ ID NO: 7。

SEQ ID NO: 7：

1 CTTCAAAAAC TTCCACTTTT CTCTATTGTT TGATTATGGC TTTAGAAGCT ATTAACTCTC

61 CAACCTCAGC CACCGCTCCT TTCCGCTTCG ATGATACTAA TTTACACTGC CTTGAATCCT

121 TTACTAAGCG TAAGCGTTCA AAACGACCAC GTCATCTCGA CCATGTTACC GCCGAGGAAG

181 AATATTTAGC TCTGTGTCTT ATCATGCTAG CACGCGGCGG TGGCCAACGA TTTCCATCTC

241 CAACCACCAT GCCGGAACCC ACCTCGACGG AGGAGCAGAA ACCGAGTTAC AAGTGCAGTA

3 01 TCTGTAACAA GGCGTTTAAC TCTTACCAGG CTTTGGGTGG ACATAAAGCC AGCCACCGTA

361 AGCTTTCCGG TGGGAACGAC GATCAGACGA CATCGGCGAC CGGGACAGCC GGTGGGGTTG

421 TTACATCATC CGGCGGGAAG TCACATGAGT GTTCCATCTG CCA AAAAGC TTCCCTACGG

481 GTCAGGCCTT GGGAGGCCAT AAAAGATGCC ACTACGAAGG TGGAACGGGT AATAATAACG

541 CCGGCGCCAC TGCCACCGCT AGCAGCGTGA CGGTATCTGA AGGAGTGGGG TCAACCAACA

601 CAAACACCAA TACCCATATC AGTAACCGGG ATTTCGACCT CAACATGCCG GCTTTACCGG

661 AATTCTCGCC AGCTAATTTC TTTGTTTCTG CCGCCGGTGA TGATGAAGTG CAAAGCCCAC

721 ACCCTGCTAA GAAGCCATGT TTATCGATAC CACCCAAAAT CGAAGTCAAC TAAACAATTT

781 AAAACCCTTT TTTTAGTTTT AGATAACAAT TCCATGAATT TTTGTTGTTT TTTTTTTTTG

841 GTGAGACGAT TTTTTCCTGT 根据 SEQ ID NO: 7 序列设计一对引物如下: GhCzfTFt SEQ ID NO: S_::

A GGC T AG¾¾GCTA ^AAC C

GhCzfJRi SEQ ID NO:

通过 SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9来克隆 GhCzf7全长编码序列。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1PCR反应体系： 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9各 2.0 μ 1，以及

30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min 33个循环（94°C 变性 30 s 58 °C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min 72 °C 延伸 10 min

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μ 1双蒸水溶解。加入 2.5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 0.5 μ 15 mM的 dATP 1.0 μ 1 Ex Taq。反应条件：70°C反应 30分钟。将得到约 720 bp的 DNA片段回收（Omega 回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上（得到 GhCzf7-pGEM质粒），转化 JM109方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 8与 SEQ ID NO: 9进行菌液 PCR 扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆,送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，得到 GhCzf7的全长编码序列为 SEQ ID NO: 2 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1

Czf7蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MALEAINSPT SATAPFRFDD

21 TNLHCLESFT KRKRSKRPRH

41 LDHVTAEEEY LALCLIMLAR

61 GGGQRFPSPT TMPEPTSTEE

81 QKPSYKCSIC NKAFNSYQAL

101 GGHKASHRKL SGGNDDQTTS

121 ATGTAGGVVT SSGGKSHECS

141 ICHKSFPTGQ ALGGHKRCHY

161 EGGTGNNNAG ATATASSVTV

181 SEGVGSTNTN TNTHISNRDF

201 DLNMPALPEF SPA FFVSAA 22 1 GDDEVQSPHP AKKPCLS I PP

241 KIEVN*

GhCzf7编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGCTTTAG AAGC A AA CTCTCCAACC TCAGCCACCG CTCCTTTCCG CTTCGATGAT

61 ACTAATTTAC ACTGCCTTGA ATCCTTTACT AAGCGTAAGC GTTCAAAACG ACCACGTCAT

121 CTCGACCATG TTACCGCCGA GGAAGAATAT TTAGCTCTGT GTCTTATCAT GCTAGCACGC

181 GGCGGTGGCC AACGATTTCC ATCTCCAACC ACCATGCCGG AACCCACCTC GACGGAGGAG

241 CAGAAACCGA GTTACAAGTG CAGTATCTGT AACAAGGCGT TTAACTCTTA CCAGGCTTTG

3 01 GGTGGACATA AAGCCAGCCA CCGTAAGCTT TCCGGTGGGA ACGACGATCA GACGACATCG

361 GCGACCGGGA CAGCCGGTGG GGTTGTTACA TCATCCGGCG GGAAGTCACA TGAGTGTTCC

421 ATCTGCCATA AAAGCTTCCC TACGGGTCAG GCCTTGGGAG GCCA AAAAG ATGCCACTAC

481 GAAGGTGGAA CGGGTAATAA TAACGCCGGC GCCACTGCCA CCGCTAGCAG CGTGACGGTA

541 TCTGAAGGAG TGGGGTCAAC CAACACAAAC ACCAA ACCC A A CAGTAA CCGGGATTTC

601 GACCTCAACA TGCCGGCTTT ACCGGAATTC TCGCCAGCTA ATTTCTTTGT TTCTGCCGCC

661 GGTGATGATG AAGTGCAAAG CCCACACCCT GCTAAGAAGC CATGTTTATC GATACCACCC

721 AAAATCGAAG TCAACTAA 实施例 3 GhCzf7基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子 rd29A及终止子 Tnos分别作为 GhCzf7基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。

50 y l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 pBI121 , 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1，以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94°C 变性 30 s， 56 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。 SEQ 10 NO: 10

GCACGAATTC GGCGGGAAAC: GACAATCTGA

SEQ 10 NO: l

ATCCAGAICTAGATCCGG1GCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13以 pBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP， 1.0 μ 1 ρΒΙ121 , 1.0 μ 1 Prime STAR 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12禾口 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33 个循环 (94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 Kpnl、 EcoRI酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300-lCpromega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 12:

AA€GGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 13；

TCAGAATICCCAeTGAATTCCCGATCTAGTA SEQ ID NO: 14 禾 P SEQ ID NO: 15 以拟南芥（哥伦比亚型，购自 TARI, www.arabidopsis.org) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子（参考 Zeng J., et L. 2002, Preparation of total DNA from " recalcit rant plant taxa" , Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 y l 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 拟南芥 DNA， 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s), 72 °C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Sail酶切后将所得 PCR产物连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ 10 ND: 14；

ACTAAGCTTCCTTCITGACATCATTCAATTTTA SEQ 10 NO: 15；

TGAGTCGACTC¾AAGAITTTTTTC:TTTCCAATAG SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17扩增 GhCzf7 (模板是实施例 2所获得的阳性

GhCzf7-pGEM质粒），采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 GhCzf7-pGEM质粒， 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 lmin；)， 72 °C 延伸 10 min。通过 Kpnl、 Sail酶切后将所得 PCR产物连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 rd29A- GhCzf7-2300。

SEQ ID MO : 16；

T&AGGTACCATGGA&AAGAMGGGACAGTAT

SEQ ID NO : 17 :

AAGGTCGACTCAAACCAGGCTCTG&GTATAA 实施例 4 rd29A-GhCzf7-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc) 感受态制备：提前 1-2天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28 °C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD₆。。值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB 液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 h至 OD_6QQ=0.8。冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min，弃上清液；加入一定量冰预冷的 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min，收集沉淀；用冰预冷的 10%甘油重复洗 3-4次；加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀，以 40 μ 1/ 管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往 40 μ ΐ的感受态细胞中加入 1 μ ΐ的质粒，混匀后冰浴约 10 min。将感受态细胞和 rd29A-GhCzf7-2300质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 bio-md)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1cm规格的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 28 °C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28 °C， 225 rpm培养 1 h。取 100— 200 μ 1 的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28 °C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号 I5A00660) 30 s, 然后用灭菌双蒸水洗两次。再用 0.1%升汞浸泡 8 min，然后用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于 MS( 18.78 mMKN0₃， 1.25 mMKH₂P0₄， 20.6 mM NH₄N0₃, 1.5 mMMgS0₄， 3.0 mM CaCl₂, 50 μ MKI, 100 μ MH3BO3, 100 μ MMnS0₄, 30 μ MZnS0₄, 1 μ MNa₂Mo0₄, 0.1 μ M CoCl₂， 100 μ M Na₂EDTA, 100 MFeS0₄, 7.4g/L琼脂，蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成 5 mmX5 mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体 rd29A-GhCzf7-2300的农杆菌浸染叶盘 10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养 2天（MS培养基）。将叶片转到分化培养基（MS+1 mg/L细胞分裂素（BA)+0.1 mg/L 萘乙酸（NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）上，光照条件下培养 45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基 (MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）中培养 30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3 中拟南芥 DNA提取方法），用 SEQIDNO: 8禾 P SEQ ID NO: 9(50 lPCR反应体系：5 μ 110 X Ex Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P SEQ ID NO: 9各 2.0 μ 1, 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 10 min)， PCR鉴定，对 PCR阳性植株进行编号（T0B1-T0B20) 并保存。实施例 6 过表达 GhCzf7转基因烟草 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T0B1-T0B20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种 15颗种子， 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环，每周浇一次 1/2MS,培养 25天之后， SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9做 PCR检测，去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及对照烟草做耐旱实验，每盆保留大小较一致的 4-5棵苗。转基因烟草、对照烟草干旱 14天 (不浇水)， 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环。

T1代转基因植株（T0代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T1B3、 T1B7、 T1B10三个株系烟草表现出明显的抗旱性（参见图 3a和 3b，以 T1B3为例， T1B7、 T1B10的结果与 T1B3类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 Czf7蛋白表达

实施 6中抗旱性好的转基因植株随机选取 8棵（分别属于上述 3个抗旱株系），实施 6中对照植株随机选取 4棵，干旱 14天叶片 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒 ( invitrogen) 提取的总 RNA。紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA 浓度。依照 invitrogen 反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（ 1 μ g总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO： 9 )。通过 SEQ ID NO:8和 SEQ ID NO: 18检测 GhCzf7，检测 Czf7蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ l PrimeSTAR、10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P SEQ ID NO: 18各 2.0 μ 1，以及 30 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 28个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72°C延伸 lmin)， 72°C延伸 10 min。产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-8为耐干旱 T1代转基因烟草植株， 9为质粒阳性对照（rd29A- GhCzf7-2300质粒）， 10-13为不耐干旱对照烟草植株。图中所示条带大小与正对照的大小一致（约为 730bp)。结果表明，耐干旱 T1 代转基因烟草植株中 GhCzf7转录较强，不耐干旱对照烟草植株没有 GhCzf7转录。

SEQ ID NO： 18： GGGTGGTATC GATAAAC ATG G

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个锌指蛋白的编码基因，被命名为 GhCzf7，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。
2. 一种重组表达载体，其含有权利要求 1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
3. 权利要求 2所述的载体，其为附图 2所示的 rd29A-GhCzf7-2300载体。
4. 一种重组细胞，其含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5. 一种改善植物抗旱性的方法，包括：将权利要求 1所述的基因或者权利要求 2 或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。
6. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物组织。
7. 权利要求 6所述的方法，其中所述植物是烟草。
8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利要求 4 所述的重组细胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育种的用途。
9. 权利要求 8所述的用途，其中所述植物是烟草。
10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。