CN104865328A - 一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置。它包括匀浆罐体、匀浆罐盖、连接管和二个以上毛细管色谱柱套管;匀浆罐体的内腔形成匀浆液腔体;匀浆罐体的顶部开口处设有匀浆罐盖;连接管固定在匀浆罐盖上并穿过匀浆罐盖与匀浆液腔体相连通;二个以上毛细管色谱柱套管均固定在匀浆罐体的侧壁上并穿过匀浆罐体的侧壁与匀浆液腔体相连通。本发明在使用时,将毛细管色谱柱空管上安装毛细管色谱柱,匀浆液腔体中装入色谱填料和匀浆试剂,连接管外接高压色谱泵,控制即可实现1个或多个色谱柱的装填。本发明可同时实现对多个毛细管色谱柱的装填,具有高的装填效率;可有效解决不同时间装填色谱柱带来的稳定性差的问题;装填方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置,属于分析化学、生物分析和蛋白质组学领域。
背景技术
液质联用技术已经成为复杂生物样本中多肽、蛋白质、蛋白质组的定性鉴定和定量的常用分析方法。由于生物样品中生物大分子组成的极端复杂性,如组成种类繁多、动态范围宽,因此,毛细管高效液相色谱与质谱联用已经成为常用的分离分析技术。通常采用的气压-匀浆装柱技术可以满足长度约为20cm、装填3~5微米颗粒填料的毛细管色谱柱的装柱要求,以用于一般生物样本中蛋白质组的定性和定量分析。但对于目前提出的蛋白质组深度覆盖,特别是实现对低丰度蛋白质的定性鉴定和定量分析,则需要更长的装填3~5微米颗粒填料的毛细管色谱柱,如50cm长的毛细管色谱柱或装填亚2微米填料的长度约为20cm的毛细管色谱柱。对于装填这类毛细管色谱柱,目前常用的气压-匀浆装柱技术(一般采用氮气钢瓶提供压力,压力不超过25MPa)不能满足要求,为此研究人员发展了一种毛细管色谱柱装填装置匀浆罐,采用高压匀浆法实现毛细管色谱柱高效快速地装填。采用中国专利(张祥民和关霞,毛细管液相色谱柱装填装置匀浆罐,2011,CN 201886008 U)这种装置和方法一次仅能装填一根毛细管色谱柱,装柱效率低,不能满足毛细管高效液相色谱与质谱联用技术快速发展和使用的需求;另外,不同时间装填的毛细管色谱柱,其性能稳定性不易保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置,本发明科实现对多个毛细管色谱柱进行同时装填,具有高的装填效率;同时装填的毛细管色谱柱的稳定性好。
本发明提供的多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置,它包括匀浆罐体、匀浆罐盖、连接管和二个以上毛细管色谱柱套管;
所述匀浆罐体的内腔形成匀浆液腔体;
所述匀浆罐体的顶部开口处设有匀浆罐盖;
所述连接管连接在所述匀浆罐盖上并穿过所述匀浆罐盖与所述匀浆液腔体相连通;
所述二个以上毛细管色谱柱套管均设在所述匀浆罐体的侧壁上并穿过所述匀浆罐体的侧壁上的阴性孔与所述匀浆液腔体相连通。
上述的装置,所述匀浆罐体呈正六方体型,采用不锈钢材料制成,具体可设为其高为39mm,平行平面间距为54mm。
上述的装置,所述匀浆罐体的6个侧壁上各设有1个所述毛细管色谱柱套管,所述毛细管色谱柱套管中连接与相配套的毛细管色谱柱,能同时通过6个通路进行6个毛细管色谱柱的装填。
上述的装置,所述匀浆液腔体呈圆柱体形,具体可设为高为18mm,直径为12mm,体积为2mL;
所述匀浆液腔体内设有至少1个磁子。
上述的装置,所述连接管采用不锈钢或工程塑料管制成;
所述连接管的耐受的压力不小于6000Psi,以耐受所述连接管另一端外接的高压色谱泵的不小于6000Psi的压力;
所述匀浆罐盖顶部开口处与所述匀浆罐盖通过固定螺母Ⅰ相连接。
上述的装置,所述匀浆罐盖采用不锈钢材料制成;
所述匀浆罐盖与所述匀浆罐体之间设有密封垫,以使所述匀浆罐腔体内密封性增强。
上述的装置,所述密封垫采用聚四氟乙烯制成,所述密封垫呈圆形。
上述的装置,所述毛细管色谱柱套管采用工程塑料制成;
所述毛细管色谱柱套管与与之相配套的毛细管色谱柱的毛细管之间采用过盈配合,以方便毛细管色谱柱顺利的装入所述毛细管色谱柱套管中,并使毛细管色谱柱不脱落。
上述的装置,所述二个以上毛细管色谱柱套管均与所述匀浆罐体的侧壁通过固定螺母Ⅱ相连接,所述二个以上毛细管色谱柱套管与所述固定螺母Ⅱ之间均设有锥形垫圈(采用不锈钢或工程塑料制成),使用时将毛细管色谱柱中的毛细管插入到所述毛细管色谱柱套管内,所述毛细管色谱柱的接头与所述锥形垫圈卡紧,再将所述固定螺母Ⅱ固定所述毛细管色谱柱套管;
所述毛细管色谱柱套管穿过的所述阴性孔设有与之相匹配的堵头,当使用时,其中所述毛细管色谱柱套管没有连接毛细管色谱柱,则将所述毛细管色谱柱套管和与之相对应的所述固定螺母Ⅱ拆下,将所述阴性孔用所述堵头封闭,保持匀浆液腔体密闭性以保证毛细管色谱装柱正常进行。
本发明还提供了上述的装置的使用方法,包括如下步骤:1)选取装填的所述二个以上毛细管色谱柱空管,并将其分别固定于所述匀浆罐体侧壁上的所述毛细管色谱柱套管上,将未安装所述毛细管色谱柱空管的所述阴性孔用所述堵头封闭;2)将装填的色谱填料,用匀浆试剂将其配置成匀浆液并转移到所述匀浆液腔体中;3)放入所述磁子,装上所述匀浆罐盖后,将所述匀浆罐体放在磁搅拌器上,调节磁子转速到适当大小对匀浆液进行搅拌;4)通过所述连接管将所述匀浆液腔体与高压色谱泵连接后,打开所述高压色谱泵电源开关,调节流动相的流速,流动相携带所述色谱填料进入所述毛细管色谱柱,将所述毛细管色谱柱装填到需要的长度后,关闭所述高压色谱泵,使装填系统压力与大气压平衡后,卸下所述毛细管色谱柱,即得到装填色谱填料的毛细管色谱柱。
本发明中,所述色谱填料为粒径小于5微米的球形色谱填料,所述匀浆试剂可为水、甲醇、乙醇和乙腈氯仿中的至少1种,所述匀浆试剂与所述色谱填料性质兼容;
毛细管色谱柱装填完成后,需对装填的毛细管色谱柱进行性能评价,达到性能指标即可用于对实际样品的分离和使用。
本发明具有以下优点:
1)可同时实现对多个毛细管色谱柱的装填,具有高的装填效率;
2)可有效解决不同时间装填色谱柱带来的稳定性差的问题;
3)兼具了每次仅装填一个毛细管色谱柱装置的功能,且没有增加额外的费用;
4)与每次仅装填一个毛细管色谱柱装置的装填方法相同,易于掌握和推广使用。
附图说明
图1为本发明多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置的结构示意图。
图2是图1的剖面结构示意图;
图3是使用本发明装填的1个毛细管色谱柱连续上样6次基峰总离子流色谱图。
图4是使用本发明一次装填的6个毛细管色谱柱柱效评价的基峰总离子流色谱图。
图5是使用本发明两次装填的12个毛细管色谱柱柱效评价的基峰总离子流色谱图。
图6是使用本发明一次装填的6个毛细管色谱柱与一次装填1个毛细管色谱柱柱效评价的基峰总离子流色谱图。
图中标记如下:
1匀浆罐体,2匀浆罐盖,3连接管,4固定螺母Ⅰ,5固定螺母Ⅱ,6毛细管空色谱柱套管,7匀浆液腔体,8磁子。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行进一步说明,但本发明并不局限于以下实施例。
如图1和图2所示,为本发明提供的多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置的结构示意图,它包括匀浆罐体1、匀浆罐盖2和连接管3和6个毛细管色谱柱套管。匀浆罐体1的内腔形成匀浆液腔体7,匀浆液腔体7呈圆柱体形,高为18mm,直径为12mm,体积为2mL,其内设有磁子8(即工程塑料包埋的铁棒),于匀浆罐体1的顶部开口处设有匀浆罐盖2(采用不锈钢材料制成)。匀浆罐盖2与匀浆罐体1之间设有聚四氟乙烯的圆形密封垫(图中未标),以增强匀浆罐腔体7内的密封性;匀浆罐盖2顶部设有通过固定螺母Ⅰ4连接的连接管3,且连接管3与匀浆液腔体7相连通,连接管3采用不锈钢或工程塑料管制成,耐受的压力不小于6000Psi,以耐受连接管3另一端外接的高压色谱泵的不小于6000Psi的压力。匀浆罐体1采用不锈钢材料制成、呈正六方体型,高为39mm,平行平面间距为54mm,为了能同时装填多个毛细管色谱柱,在6个侧壁上各设有1个通过固定螺母Ⅱ5连接的工程塑料制成的毛细管色谱柱套管6,且毛细管色谱柱套管6穿过匀浆罐体1的侧壁上的阴性孔与匀浆液腔体7相连通,能同时通过6个通路进行6个毛细管色谱柱的装填。毛细管色谱柱套管6上连接待装的毛细管色谱柱,毛细管色谱柱套管6与与之相配套的毛细管色谱柱的毛细管之间采用过盈配合,毛细管色谱柱的内径小于0.3mm,以方便毛细管色谱柱顺利的装入毛细管色谱柱套管中,并为了使毛细管色谱柱不脱落,毛细管色谱柱套管6与固定螺母Ⅱ5之间设有不锈钢或工程塑料的锥形垫圈(图中未示),使用时将毛细管色谱柱中的毛细管插入到毛细管色谱柱套管6内,毛细管色谱柱的接头与锥形垫圈卡紧,再将固定螺母Ⅱ5固定毛细管色谱柱套管6。毛细管色谱柱套管6穿过的阴性孔设有与之相匹配的堵头(图中未示),当使用时,其中毛细管色谱柱套管6没有连接毛细管色谱柱,则将毛细管色谱柱套管6和对应的固定螺母Ⅱ5拆下堵头,将阴性孔用堵头封闭,保持匀浆液腔体7密闭性以保证装毛细管色谱装柱正常进行。
使用本发明的装置进行毛细管色谱柱装填时,具体步骤为:1)选取需要装填的毛细管色谱柱空管和个数,并将其分别固定于匀浆罐体1的任何一个毛细管色谱柱套管6的阴性孔上。如果装填的毛细管色谱柱少于6个,剩余的阴性孔用堵头封闭;2)选择需要装填的高效色谱填料,用匀浆试剂将其配置成匀浆液并转移到匀浆液腔体7中;3)放入磁子8,装上匀浆罐盖2后,将匀浆罐体1放在磁搅拌器上,调节磁子转速到适当大小对匀浆液进行搅拌;4)通过连接管3将匀浆液腔体7与高压色谱泵连接后,打开色谱泵电源开关,调节流动相的流速,流动相携带色谱填料进入毛细管色谱柱,等待色谱柱装填到需要的长度后,关闭高压色谱泵,使装填系统压力与大气压平衡后,卸下毛细管色谱柱,并对装填的毛细管色谱柱进行性能评价,达到性能指标即可用于对实际样品的分离和使用。
应用一:在液质联用系统上对一次装填的一个毛细管色谱柱进行稳定性评价
在液质联用系统上,对本发明一次装填的一个毛细管色谱柱重复上样六次色谱分离的柱效和保留时间的稳定性进行考察,为比较同一批次装填的6个色谱柱柱效和保留时间的稳定性提供依据。
所用带喷头的毛细管色谱柱的规格为15cm×75μm,装填的全多孔型反相色谱填料的粒径为3μm,孔径为10nm。在NanoLC-2D(Eksigent)毛细管液相色谱仪与LTQ(Thermo Finnigan)质谱仪联用系统上对纳升级毛细管反相色谱柱的性能进行评价。色谱条件:流动相A为2%乙腈和0.1%甲酸的水溶液,流动相B为98%乙腈和0.1%甲酸的水溶液;梯度洗脱时间为:52min,洗脱梯度为:0-5min,5%-8%B;5-30min,8%-40%B;30-35min,40%-95%B;35-40min,95%B;40-42min,95%-5%B;42-52min,5%B。流动相流速为300nL/min。质谱条件为:选用正离子模式采集数据,质谱扫描范围设为m/z 400.0-1600.0,采集时间设为52min。在采用数据依赖模式(DDA)进行串联质谱分析时,选取一级质谱中10个信号最强的离子进行二级质谱分析,其碰撞能量设为35eV,采用动态排除功能(dynamic exclusion),排除时间为30秒。评价毛细管色谱柱性能采用的样本为牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶切所得的肽段混合物。
如图3所示,从上到下依次是采用同一个色谱柱连续上样六次的基峰总离子流色谱图。峰容量依次为27、28、29、23、26、29;以PD软件搜库其覆盖率依次为45.11%、49.57%、48.89%、43.22%、46.31%、49.91%;从总离子流色谱图中在出峰时间靠前、居中、靠后三个位置提取m/z722.95、m/z653.90、m/z582.71等三个信号强度较强的离子色谱峰分别比较重复六次色谱分离的保留时间,其中m/z722.95保留时间依次为:8.64min、8.79min、8.64min、8.55min、8.59min、8.64min,m/z653.90保留时间依次为:16.44min、16.37min、16.43min、16.31min、16.36min、16.41min,m/z582.71保留时间依次为:20.29min、20.40min、20.49min、20.51min、20.60min、20.55min。以相对标准偏差(RSD)表示其离散程度,峰容量的RSD=8%;覆盖率的RSD=6%;m/z722.95保留时间的RSD=1%,m/z653.90保留时间的RSD=1%,m/z582.71保留时间的RSD=1%。
应用二:对一次装填的6个毛细管色谱柱的柱效评价
主要考察本发明一次装填的6个毛细管色谱柱的柱效的一致性。装柱时将6个空毛细管色谱柱安装在匀浆罐体侧面的六个阴性孔上,溶剂通过液相泵从匀浆罐盖上的孔进入匀浆罐。将装满的毛细管色谱柱依次编号为0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5和0407-6的一批0407系列色谱柱。按应用一中的色谱、质谱条件以及评价指标来评价这6个毛细管色谱柱的柱效。如图4所示,从上到下依次是0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5、0407-6色谱柱进样后的基峰总离子流色谱图。峰容量依次为:26、31、29、28、28、25;覆盖率依次为:50.43%、53.17%、48.71%、51.46%、51.11%、47.34%。从总离子流色谱图中提取m/z722.95、m/z653.90、m/z582.71的三个峰分别比较六次上样时的保留时间,其中m/z722.95保留时间依次为:11.03min、12.06min、11.56min、11.10min、12.47min、12.97min,m/z653.90保留时间依次为:17.40min、18.53min、17.73min、16.98min、17.72min、17.70min,m/z582.71保留时间依次为:22.58min、23.52min、21.41min、20.81min、21.37min、21.46min。峰容量的RSD=8%;覆盖率的RSD=5%;m/z722.95保留时间的RSD=7%,m/z653.90保留时间的RSD=3%,m/z582.71保留时间的RSD=5%。
0407系列色谱柱相对于实施例1中同一个色谱柱来看,保留时间波动较大;而峰容量以及覆盖率的离散程度不大于同一个色谱柱峰容量和覆盖率的离散程度。由此得出同一批次装填的6个色谱柱虽然保留时间有所波动但柱效基本一致。
应用三:对两次装填的12个毛细管色谱柱的柱效评价
主要考察本发明两次装填的12个毛细管色谱柱的柱效的一致性,即不同批次装填的毛细管色谱柱的柱效的一致性。
采用同应用二中相同的方法装填得到编号为0403-1、0403-2、0403-3、0403-4、0403-5和0403-6的6个0403系列的色谱柱,与实施例2中的0407系列的6个色谱柱的柱效性能进行比较。
如图5(a)是0407系列毛细管色谱柱进样后的基峰图,图5(b)是0403系列毛细管色谱柱进样后的基峰总离子流色谱图。0407系列色谱柱的峰容量和覆盖率见应用二,其峰容量平均值为28;覆盖率平均值为50.37%;m/z722.95保留时间平均值11.87min,m/z653.90保留时间平均值17.68min,m/z582.71保留时间平均值21.86min。0403系列色谱柱的覆盖率依次为53.34%、54.55%、51.80%、44.94%、55.57%、56.26%,以Grubbs法判断,44.94%这个数值应舍去(置信度95%),其他数据平均值54.30%;峰容量依次为:33、33、34、29(舍去)、35、34,平均值为33.8;m/z722.95保留时间依次为:16.91min、16.58min、15.91min、14.63min、13.11min、12.84min,平均值15.00min;m/z653.90保留时间依次为:21.51min、22.57min、23.63min、19.67min、18.79min、20.24min,平均值21.07min;m/z582.71保留时间依次为:25.72min、26.67min、28.22min、23.60min、23.10min、25.55min,平均值25.48min。比较0403系列和0407系列色谱柱的柱效,峰容量平均值之间的RSD=14%;覆盖率平均值之间的RSD=5%;m/z722.95保留时间的RSD=17%,m/z653.90保留时间的RSD=13%,m/z582.71保留时间的RSD=11%。
0403系列色谱柱和0407系列色谱柱之间的比较结果表明,从保留时间来看,本发明装填的两批色谱柱的三个色谱峰保留时间都存在较大差异,且它们之间的差别要远大于同一批次装填的6个色谱柱之间的差别;这两批色谱柱峰容量之间的差别要比实施例1中同一个色谱柱的差别大;而从覆盖率来看,两者之间没有明显差异。所以我们认为两次装填的毛细管色谱柱柱效是有差别的,即不同批次装填的毛细管色谱柱的柱效的一致性要差于同一批次色谱柱柱效的一致性。
应用四:比较一次装填的6个毛细管色谱柱与一次装填1个毛细管色谱柱的柱性能。
主要考察本发明一次装填的6个毛细管色谱柱与一次装填1个毛细管色谱柱的柱效和保留时间的一致性。
一次装填1个毛细管色谱柱时,将毛细管安装在装柱罐盖上的阴性孔,溶剂从装柱罐面的一个孔进入,其他孔则以堵头封闭,得到色谱柱编号0410。如图6(a)为0407系列毛细管色谱柱进样后的基峰总离子流色谱图,图6(b)为0410色谱柱进样后的基峰总离子流色谱图。0410色谱柱基峰图峰容量为30;覆盖率为53.08%;m/z722.95保留时间为12.88min,m/z653.90保留时间为18.08min,m/z582.71保留时间为21.72min。
色谱柱0410与应用二中0407系列色谱柱比较,从保留时间看,m/z722.95保留时间的RSD=6%,m/z653.90保留时间的RSD=2%,m/z582.71保留时间的RSD=1%,色谱峰保留时间相比于同一批次装填的色谱柱之间有较大差别,但差别并不大于两次同时装填6个色谱柱时的差别;峰容量的RSD=6%;覆盖率的RSD=4%,没有显著差别。所以以我们的多通道匀浆装填毛细管色谱柱的新装置一次装填的6个毛细管色谱柱与一次装填1个毛细管色谱柱的柱效相差较小。即本发明一次装1个与一次装6个色谱柱的色谱柱没有明显区别。
Claims (10)
1.一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装置,其特征在于:它包括匀浆罐体、匀浆罐盖、连接管和二个以上毛细管色谱柱套管;
所述匀浆罐体的内腔形成匀浆液腔体;
所述匀浆罐体的顶部开口处设有匀浆罐盖;
所述连接管连接在所述匀浆罐盖上并穿过所述匀浆罐盖与所述匀浆液腔体相连通;
所述二个以上毛细管色谱柱套管均设在所述匀浆罐体的侧壁上并穿过所述匀浆罐体的侧壁上的阴性孔与所述匀浆液腔体相连通。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于:所述匀浆罐体呈正六方体型,采用不锈钢材料制成。
3.根据权利要求2所述的装置,其特征在于:所述匀浆罐体的6个侧壁上各设有1个所述毛细管色谱柱套管。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的装置,其特征在于:所述匀浆液腔体呈圆柱体形;
所述匀浆液腔体内设有至少1个磁子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的装置,其特征在于:所述连接管采用不锈钢或工程塑料管制成;
所述连接管的耐受的压力不小于6000Psi;
所述匀浆罐盖顶部开口处与所述匀浆罐盖通过固定螺母Ⅰ相连接。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的装置,其特征在于:所述匀浆罐盖采用不锈钢材料制成;
所述匀浆罐盖与所述匀浆罐体之间设有密封垫。
7.根据权利要求6所述的装置,其特征在于:所述密封垫采用聚四氟乙烯制成,所述密封垫呈圆形。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的装置,其特征在于:所述毛细管色谱柱套管采用工程塑料制成;
所述毛细管色谱柱套管与与之配套的毛细管色谱柱的毛细管之间采用过盈配合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的装置,其特征在于:所述二个以上毛细管色谱柱套管均与所述匀浆罐体的侧壁通过固定螺母Ⅱ相连接,所述二个以上毛细管色谱柱套管与所述固定螺母Ⅱ之间均设有锥形垫圈;
所述毛细管色谱柱套管穿过的所述阴性孔设有与之相匹配的堵头。
10.权利要求1-9中任一项所述的装置的使用方法,包括如下步骤:1)选取装填的所述二个以上毛细管色谱柱空管,并将其分别固定于所述匀浆罐体侧壁上的所述毛细管色谱柱套管上,将未安装所述毛细管色谱柱空管的所述阴性孔用所述堵头封闭;2)将装填的色谱填料,用匀浆试剂将其配置成匀浆液并转移到所述匀浆液腔体中;3)放入所述磁子,装上所述匀浆罐盖后,将所述匀浆罐体放在磁搅拌器上,调节磁子转速到适当大小对匀浆液进行搅拌;4)通过所述连接管将所述匀浆液腔体与高压色谱泵连接后,打开所述高压色谱泵电源开关,调节流动相的流速,流动相携带所述色谱填料进入所述毛细管色谱柱,将所述毛细管色谱柱装填到需要的长度后,关闭所述高压色谱泵,使装填系统压力与大气压平衡后,卸下所述毛细管色谱柱,即得到装填色谱填料的毛细管色谱柱。
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