CN104865261A - 一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及有效快捷检测海洋微藻病原生物的方法，具体地说是一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法。取待检测样品经滤膜过滤处理后，琼脂包埋，包埋的滤膜依次浸于苏木精染液、分化液、返蓝液、伊红染液中进行苏木精-伊红染色，染色后脱水、封片，干燥后，光学显微镜观察，即可分辨出寄生性甲藻。本发明是将苏木精-伊红染色技术改良后应用到海洋微藻的病原生物检测上，在检测海洋微藻病原生物方面有显著的优越性，该方法操作简便、快捷有效、检测成本低、准确性高。

Description

一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法

技术领域

本发明涉及有效快捷检测海洋微藻病原生物的方法，具体地说是一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法。

背景技术

寄生性甲藻阿米巴藻是一类广泛寄生于甲藻类、纤毛虫类、放射虫类等海水浮游生物的原生生物，在北大西洋，北太平洋和地中海等营养盐丰富、宿主密度较高的河口和近海水环境中普遍存在，是海洋浮游食物网的重要组成部分。阿米巴藻能够特异性感染海洋浮游甲藻，在有害藻华(harmful algal bloom,HAB)的发生过程中起下行控制作用，将逃脱了浮游动物摄食的浮游植物补充到微食物环中去。阿米巴藻在近海海洋生态系统中的独特作用日益受到国际上越来越多研究者的关注和重视，并逐渐成为国际上海洋微型生物研究的新热点之一。

阿米巴藻的生活史主要包括腰鞭孢子、蠕虫体和滋养体三个阶段，滋养体在感染末期会在宿主细胞内形成特征性的“蜂巢”状多核体。阿米巴藻的传播、感染是通过腰鞭孢子来完成的。孢子能够吸附在潜在宿主细胞上，侵入细胞内部。随后，孢子在宿主细胞质内，发展成滋养体，并进行一系列细胞核分裂、不完整胞质分裂和鞭毛复制；最终在宿主细胞内发展成为蜂巢状的多核体。多核体成熟后，延伸成蠕虫体；蠕虫体破碎宿主细胞，进入水体迅速发展成很多具有感染性的腰鞭孢子，而后开始新一轮感染。

目前，检测阿米巴藻的方法主要有荧光原位杂交技术(FISH)、定量蛋白银染色法(QPS)。FISH技术主要是选择一个已知序列中特异的DNA片段，用荧光标记后作为FISH的探针与中期细胞的染色体或细胞核的DNA杂交，在染色体上显示与荧光探针同源的DNA片段的位置，从而将这个已知序列的DNA片段定位在细胞中。FISH技术准确、灵敏但是对探针的灵敏度要求极高(80％-93％)，不能达到100％杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。QPS技术依据银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上而显色，该方法步骤繁琐，操作要求高，成本高且耗时较长(15-30h)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，取待检测样品经滤膜过滤处理后，琼脂包埋，包埋的滤膜依次浸于苏木精染液、分化液、返蓝液、伊红染液中进行苏木精-伊红染色，染色后脱水、封片，干燥后，光学显微镜观察，即可分辨出寄生性甲藻。

所述从光学显微镜观察，经染色后能清晰地分辨出细胞结构，细胞质呈现不同程度的红色，细胞核呈现蓝紫色，即为样品为未被寄生的甲藻细胞；经染色后细胞内形成特征性的“蜂巢”状多核体，即为样品为寄生性甲藻细胞。

所述苏木精-伊红染色是将滤膜放于苏木精染缸中5-10min，水洗2-3min，甩干；浸入盐酸酒精分化液中30s-1min，水洗2-3min，甩干，达到分色效果；浸入返蓝液中15s-30s，水洗2-3min，甩干；浸入伊红染液5-7min，水洗1-3min，甩干。

所述染色后经30-100(v)％梯度的异丙醇依次洗脱，体积比为1:1异丙醇与二甲苯的混合液进行脱水至透明，再经浓度为100％二甲苯脱水至中性，而后将中性树胶封片在常温干燥通风处自然晾干24h，然后置于50-60℃的烘箱中烘干3-5d。

所述待检测样品经滤膜过滤处理是在调查海域按标准层采集海水样品，经200μm标准浮游生物网初滤后，甲醛固定；固定的样品在流动状态下通过滤膜，使样品随机分散在滤膜上，且滤膜尚呈湿润状态。

所述琼脂包埋时将滤膜置于经预热的载玻片中心，再将滴加有液体琼脂的预热载玻片覆盖在滤膜上从而使整片滤膜覆盖琼脂，在两片载玻片之间应形成一层“三明治”薄层，而后放置在60-70℃加热板上1-3min，随后放置于自来水中冷却固化15-20min，固定后取出包埋好的滤膜置于滤膜筐中，待用。

所述滤膜筐由多个U型板并排组成，各所述U型板一侧边的外表面设有作为提手的T型板另一侧边的外表面及所述U型板的底面均固定有“一”字型板相邻U型板之间间隔3-5mm。所述滤膜筐所采用的板材均为环氧树脂板。

本发明所具有的优点：

本发明是将苏木精-伊红染色技术应用到海洋微藻检测上，苏木精-伊红染色技术在检测海洋微藻方面显示了无可比拟的优越性；本发明快速、简单的优点，整个检测过程所需时间小于3小时，而且操作简单；更重要的是该法能批次处理样品，这是目前其他检测寄生性甲藻的方法所不能达到的。同时细胞固定后不易变形，这对于检测自然水体样品打下了良好的基础。

附图说明

图1为本发明实施例提供的滤膜筐结构示意图(mm)。

图2为本发明实施例提供的采样站位图。

图3为本发明实施例提供的经染色后的海洋微藻图片，图中：A环沟藻；B被阿米巴藻寄生感染的环沟藻；C叉状角藻；D被阿米巴藻寄生感染的叉状角藻(40×10)。

具体实施方式

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

搭载中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室组织的“国家基金委创新研究群体”组织的长江口及东海航次(采样站位如图2所示)，采集浮游甲藻样品。根据《海洋调查规范》，在调查站位按标准层采集海水，经200μm标准浮游生物网初滤后，甲醛固定(终浓度为2％)。选取5、6、7、11、13、14、26、27、33号站位0m、5m层甲醛固定水样，各量取100ml，分别进行富集抽滤，即将3μm混合纤维素膜放置到过滤器中，下面另放一张筛绢作为副膜衬垫。打开真空泵调节滤器中的真空度(≤0.02Mpa)，以免压力过大致使细胞破碎，使水样均匀缓慢地通过滤膜。抽滤过程中，用蒸馏水不断冲洗，以置换出固定液，增强染色效果。待过滤的样品随机分散在滤膜上，停止抽滤，时机以水分恰好去除而滤膜尚呈湿润状态为最佳，进而实现样品的富集抽滤。

在样品过滤前，将数片清洁的载玻片放置在60℃的加热板上预热。用镊子将上述滤膜从过滤装置中取出，置于一片60℃的热载玻片中央。取一大滴液体琼脂(质量分数为2.5％-3％)滴放于第二片60℃的热载玻片中心；小心翻转此载玻片，压在第一片载玻片的滤膜上。使整片滤膜覆盖琼脂，由此在两片载玻片之间形成一个“三明治”薄层。

将“三明治”放置在60℃的加热板上1min；转入盛有自来水的大培养皿中冷却固化15min；移去载玻片，用刀片小心除去多余的琼脂并剥落包埋好的滤膜。修整滤膜的边缘使其能够正好适合24×32mm的盖玻片。将修整好的滤膜集中放在滤膜筐中，注意滤膜朝向，使有生物体的一面总是面向操作者，以免后续工作丢失生物体。

所述滤膜筐由多个U型板并排组成，各所述U型板一侧边的外表面设有作为提手的T型板另一侧边的外表面及所述U型板的底面均固定有“一”字型板相邻U型板之间间隔3-5mm。所述滤膜筐所采用的板材均为环氧树脂板，u型板总共九块。

将上述放有滤膜的滤膜筐放于苏木精染缸中5min，水洗2-3min，甩干；再浸入盐酸酒精分化液中30s，水洗2-3min，甩干，达到分色效果；而后浸入返蓝液中30s，水洗2-3min，甩干；最后浸入伊红染液中5min，水洗1～3min，甩干，实现染色。其中，苏木精-伊红染液购于青岛鑫锐源通信息技术有限公司；苏木精染液为深紫红色澄明液体，主要成分为苏木精色素经氧化生成的三氧化苏木红；伊红染液为橘黄色澄明液体，主要成分为伊红Y。相对于传统石蜡组织切片的苏木精-伊红染色，该方法首次用苏木精-伊红染色检测海洋浮游植物，而且将各染色步骤所需时间精确到秒，大大缩短了染色时间且提高了染色质量。

实现染色后的滤膜，进行脱水处理，即将滤膜依次经体积浓度为30％异丙醇脱水6min、50％异丙醇脱水6min、70％异丙醇脱水6min、100％异丙醇脱水6min、100％异丙醇脱水6min、体积比为1:1的异丙醇和二甲苯混合液脱水6min、100％二甲苯脱水10min、100％二甲苯脱水10min。本方法不能使用常规脱水所普遍使用的酒精，因其可导致滤膜卷曲而难以封片。

准备干净载玻片，取一小滴中性树胶滴于载玻片中心；将滤膜从滤膜筐中取出，将有生物的面朝上，粘在中性树胶上，另外滴加一滴中性树胶，干净盖玻片封片。

封片后，在常温干燥通风处自然晾干24h，然后置于50-60℃的烘箱中烘干至少3d。

光学显微镜观察，未被寄生的甲藻细胞，经染色后细胞质呈现不同程度的红色，细胞核呈现蓝紫色；被寄生性甲藻寄生的甲藻细胞经染色后可在光学显微镜下观察到寄生性甲藻在宿主细胞内形成特征性的“蜂巢”状多核体。结果如图3所示，检测到阿米巴藻在环沟藻和叉状角藻中的寄生感染。其中，A：环沟藻；B：被阿米巴藻寄生感染的环沟藻；C：叉状角藻；D：被阿米巴藻寄生感染的叉状角藻。

Claims (6)

1.一种有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：取待检测样品经滤膜过滤处理后，琼脂包埋，包埋的滤膜依次浸于苏木精染液、分化液、返蓝液、伊红染液中进行苏木精-伊红染色，染色后脱水、封片，干燥后，光学显微镜观察，即可分辨出寄生性甲藻。

2.按照权利要求1所述的有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：所述苏木精-伊红染色是将滤膜放于苏木精染缸中5-10min，水洗2-3min，甩干；浸入盐酸酒精分化液中30s-1min，水洗2-3min，甩干，达到分色效果；浸入返蓝液中15s-30s，水洗2-3min，甩干；浸入伊红染液5-7min，水洗1-3min，甩干。

3.按照权利要求1所述的有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：所述染色后经30-100(v)％梯度的异丙醇依次洗脱，体积比为1:1异丙醇与二甲苯的混合液进行脱水至透明，再经浓度为100％二甲苯脱水至中性，而后将中性树胶封片在常温干燥通风处自然晾干24h，然后置于50-60℃的烘箱中烘干3-5d。

4.按照权利要求1所述的有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：在调查海域按标准层采集海水样品，经200μm标准浮游生物网初滤后，甲醛固定；固定的样品在流动状态下通过滤膜，使样品随机分散在滤膜上，且滤膜尚呈湿润状态。

5.按照权利要求1所述的有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：所述琼脂包埋时将滤膜置于经预热的载玻片中心，再将滴加有液体琼脂的预热载玻片覆盖在滤膜上从而使整片滤膜覆盖琼脂，在两片载玻片之间应形成一层“三明治”薄层，而后放置在60-70℃加热板上1-3min，随后放置于自来水中冷却固化15-20min，固定后取出包埋好的滤膜置于滤膜筐中，待用。

6.按照权利要求6所述的有效快捷检测寄生性甲藻的生物学方法，其特征在于：所述滤膜筐由多个U型板并排组成，各所述U型板一侧边的外表面设有作为提手的T型板另一侧边的外表面及所述U型板的底面均固定有“一”字型板相邻U型板之间间隔3-5mm。