CN109827935A - 一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置及其方法。将制备的延迟荧光样品直接滴加在图像传感器表面的样品微腔中，通过利用延迟荧光自身特性即激发光源熄灭后其荧光强度仍能保持一段时间，设置图像传感器工作模式使其只对激发光源熄灭后的荧光信号进行采集，从而实现荧光信号检测。该荧光显微装置无需传统的成像透镜系统也无需滤光片过滤激发光，这样不仅大幅节约成本、简化系统复杂度，提高系统的便携性而且能够实现大视场、大体积样品的统计观测，对某些特定场景下的生物医学分析、药物筛选和细胞处理等提供一定参考和便利。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像领域，特别涉及一种无透镜的荧光显微成像装置及其方法。
背景技术
荧光显微技术在生物医学分析、药物筛选以及细胞处理与检测等方面有着广泛的应用，已经成为生命科学研究领域的必备工具。然而传统荧光显微装置在一些研究场景下表现出其乏力与不足。稀有细胞(比如，循环肿瘤细胞)表征与检测是生物医学领域的重要课题，因为一些稀有细胞对于疾病诊断有至关重要作用，但这些细胞的浓度往往非常低，有的甚至每毫升溶液中只有几个细胞，因此要想进行准确的监测与分析，必须要观测足够体积的样本来获取足够数量的目标细胞。然而传统基于透镜系统的荧光显微装置，不仅一次性可观测样本的体积很小，而且整个装置体量大、结构精密复杂、价格昂贵且使用前必须经过专业培训等等，这一系列问题将大幅增加实验人员的劳动和时间成本。
因此寻求一种结构简单、成本可控、操作简便，且能够实现高通量和大视场观测的荧光显微方案便显得尤为重要。
发明内容
针对现有荧光显微装置和方法的缺陷与不足，本发明提出了一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置及其方法，不仅大幅节约成本、简化系统复杂度，提高系统的便携性而且能够实现大视场、大体积样品的统计观测。
本发明的装置采用的技术方案如下：
一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，包括显微成像模块、激发光源模块、时序控制模块和图像数据处理与显示模块；所述显微成像模块包括样品微腔、延迟荧光样品、图像传感器芯片和遮光罩，样品微腔用于装载延迟荧光样品，样品微腔底部紧贴图像传感器芯片表面；所述图像传感器芯片用于记录样品被激发出来的延迟荧光信号；所述遮光罩用于隔离装置周围环境光干扰；所述激发光源模块用于产生激发光源，以激发出延迟荧光样品中的延迟荧光信号，置于所述荧光显微成像装置的正上方，且发光面覆盖整个图像传感器芯片；所述时序控制模块用于控制所述显微成像模块和激发光源模块的工作时序，分别与所述图像传感器芯片、激发光源模块和数据处理与显示模块连接；所述数据处理与显示模块用于处理图像传感器芯片记录的延迟荧光信号的图像数据并显示。
进一步地，所述激发光源模块采用特定波长的激光光源并组合透镜系统来扩大光斑，或者采用窄带的LED光源，或者采用宽带的LED光源组合带通滤光片。
进一步地，所述样品微腔的结构包括顶板和腔体，样品微腔的底部直接贴附在图像传感器芯片表面；腔体的高度为50μm～100μm，顶板的厚度≥50μm。
进一步地，所述样品微腔的结构包括顶板、中间的腔体和底板，底板紧贴图像传感器芯片表面；底板厚度为5μm～100μm，腔体高度为50μm～100μm，顶板厚度≥50μm。
进一步地，所述样品微腔的腔体形状为椭圆或者圆角菱形，腔体的两端分别设有一个或者多个进样口和出样口。
进一步地，所述延迟荧光样品是利用具有延迟荧光特性的荧光材料标记后的生物细胞或者微生物，其中荧光信号在激发光熄灭后仍能保持一段时间即延迟时间T1。
进一步地，所述图像传感器芯片采用CMOS图像传感器，或者采用半浮栅晶体管，或者采用复合介质栅光敏探测器阵列。整个图像传感器芯片具有的像素数目≥1000万。
进一步地，所述遮光罩为一个厚度大于2mm且不透光的盖子。
本发明的方法采用的技术方案如下：
一种利用延迟荧光的荧光显微成像方法，具体步骤如下：第一步，将样品微腔紧贴固定在图像传感器芯片表面，取适量延迟荧光样品注入样品微腔内；第二步，盖上遮光罩，打开开关，时序控制模块开始工作，激发光源发出持续时间为T2的激发脉冲，入射到样品微腔上；在激发光熄灭的时刻，图像传感器芯片开始采集荧光信号并传输给图像数据处理与显示模块，采集时间为T3；第三步，由图像数据处理与显示模块保存并显示样品的荧光信号。
本发明提出了一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置及其方法，将延迟荧光样品滴加在位于传感器芯片表面的样品微腔内，利用延迟荧光样品在激发光源熄灭以后其荧光信号仍能保持一段时间这一特性，并通过时序控制模块控制装置的工作模式，使得在激发光熄灭时刻图像传感器芯片立刻开始工作对延迟荧光信号进行采集来实现荧光信号的检测与成像。因此，该荧光显微装置无需透镜成像系统也无需滤光片过滤激发光，这样不仅大幅节约成本、简化系统复杂度，提高系统的便携性，而且可以实现高通量、大视场、大体积样品的统计观测。本发明所提出的方案能够为某些特定场景下的生物医学研究的开展提供参考和便利。
附图说明
图1为本发明实施例中的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置的整体结构示意图。
图2为本发明实施例中光源结构示意图，(a)LED光源组合窄带滤光片，(b)特定波长激光二极管组合透镜。
图3为本发明实施例中样品微腔结构示意图(a)无底板、椭圆形，(b)无底板、圆角菱形，(c)有底板、方形。
图4为本发明实施例中样品微腔与图像传感器芯片组合结构示意图。
图5为本发明实施例中样品微腔与图像传感器芯片组合结构的(a)侧视图和(b)局部放大示意图。
图6为本发明实施例中对具有延迟荧光特性的材料的微纳颗粒成像结果示意图以及局部放大图。
具体实施方式
本发明实施例提供的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其整体结构如图1所示，包括激发光源模块、显微成像模块、时序控制模块6和图像数据处理与显示模块7。
激发光源模块用于产生特定波长范围的激发光，激发出延迟荧光样品中的延迟荧光信号。该模块置于荧光显微成像装置的正上方，且发光面覆盖整个图像传感器芯片3的感光区。激发光源模块可以有多种选择，可以是LED光源1组合带通滤光片2构成，如图2(a)所示，也可以是特定波长激光二极管1-1组合透镜2-1构成如图2(b)所示，当然为了节约成本，本实施例优选LED光源1组合带通滤光片2这种方式，其中LED光源1位于图像传感器芯片3的正上方，距芯片表面距离Z>5cm，而带通滤色片2直接放置在位于LED光源1下方的支撑架4上，且是可更换的。
显微成像模块包括样品微腔8、图像传感器芯片3和遮光罩5。其中样品微腔8用于装载延迟荧光样品，减缓样品液的挥发。延迟荧光样品是利用具有延迟荧光特性的荧光材料标记后的生物细胞、微生物等，该样品在激发光源关闭后其荧光信号仍能保持一定时间。样品微腔8的中间腔体形状不限，两端分别设有一个或者多个进样口和出样口。
图像传感器芯片3用于记录样品被激发出来的延迟荧光信号，可以选用CMOS图像传感器、半浮栅晶体管以及复合介质栅光敏探测器等，其中复合介质栅光敏探测器可以是美国专利US8,604,409中所述的那种复合介质栅光敏探测器，而半浮栅晶体管可以是文献(Wang P,Lin X,Liu L,et al.A semi-floating gate transistor for low-voltageultrafast memory andsensing operation.[J].Science(New York,N.Y.),2013,341(6146):640-643.)中所述的那种半浮栅晶体管。本实施例中，图像传感器芯片3的感光区12的四周设有高度约为0.5mm-1mm的封装胶凸起11，封装胶可以是紫外胶或者热固胶等，该封装胶不仅能够保护感光区周边的封装金线而且也能起到防水效果。
样品微腔8可以选用两种结构，其中一种如图3(a)、(b)所示，设有入液口9和腔体10，腔体10的高度范围约为50μm～100μm，其顶层厚度大于50μm，腔体形状可以是椭圆形、圆角菱形等，材料为玻璃、PDMS或者其他高分子透明材料。样品微腔8没有底板，其尺寸与芯片感光区12面积相当，使用时直接将样品微腔8置于芯片感光区12表面上(如图4所示)，直接以感光区表面作为腔体底板，再将制备的延迟荧光样品从入液口9注入到腔体10中。如图5所示为样品微腔8与图像传感器芯片3组合结构的局部放大图示，样品微腔8与芯片感光区12组合所形成的腔室不仅能够尽可能保证样品的单层分布而且也可以有效减缓样品溶液的快速挥发。另一种结构如图3(c)所示是有底板，底板13厚度为5μm～100μm，腔体10高度约为50μm～100μm，顶板14厚度大于50μm，腔体形状可以为方形，材料可以为玻璃等，使用时先用移液枪直接从腔体边缘一侧注液然后将注完样品液的样品微腔8直接放置在芯片感光区12表面即可。
遮光罩5包括一个厚度大于2mm且不透光的顶盖，待样品滴加完毕后将该顶盖盖上以确保提供暗室环境，消除外界环境光的影响。
时序控制模块6用于控制激发光源和图像传感器芯片3按照所设定的工作时序工作，保证在激发光源熄灭瞬间图像传感器芯片3立刻开始工作，对延迟信号进行采集，时序控制模块6可以选用FPGA加外围PCB电路板的方式实现。图像数据处理与显示模块7用于存储和处理图像传感器芯片记录的延迟荧光信号的图像数据信息并通过网口和网线传输到显示器显示。
下面对上述装置的实际使用操作步骤做详细描述：
第一步：清洗芯片感光区12表面，在使用前需用棉签蘸取无水乙醇对芯片感光区12表面进行擦拭，也可用乙醇直接冲洗，最终确保芯片感光区12表面无明显杂质颗粒。
第二步：将样品微腔8置于芯片感光区12表面上，使用移液枪或者是注射器吸取少量已制备好的荧光样品液，经入液口9进入腔体10中，注入过程要尽可能缓慢。
第三步：样品注入完成后，将装置的遮光罩5盖上，确保提供暗室环境，避免外界环境光干扰。
第四步：打开电源，设置参数，点击开始按钮系统开始工作，时序控制模块6按照设定时序来驱动LED光源1和图像传感器芯片3工作，使得在激发光源熄灭时刻图像传感器芯片立刻开始对延迟荧光信号进行采集，将采集到的信号传输给图像数据处理与显示模块7，图像数据处理与显示模块7对采集到的数据进行分析处理并将结果输出显示，显示结果如图6所示。
Claims (10)
1.一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，包括显微成像模块、激发光源模块、时序控制模块和图像数据处理与显示模块；
所述显微成像模块包括样品微腔、延迟荧光样品、图像传感器芯片和遮光罩，样品微腔用于装载延迟荧光样品，样品微腔底部紧贴图像传感器芯片表面；所述图像传感器芯片用于记录样品被激发出来的延迟荧光信号；所述遮光罩用于隔离装置周围环境光干扰；
所述激发光源模块用于产生激发光源，以激发出延迟荧光样品中的延迟荧光信号，置于所述荧光显微成像装置的正上方，且发光面覆盖整个图像传感器芯片；
所述时序控制模块用于控制所述显微成像模块和激发光源模块的工作时序，分别与所述图像传感器芯片、激发光源模块和数据处理与显示模块连接；
所述数据处理与显示模块用于处理图像传感器芯片记录的延迟荧光信号的图像数据并显示。
2.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述激发光源模块采用特定波长的激光光源并组合透镜系统来扩大光斑，或者采用窄带的LED光源，或者采用宽带的LED光源组合带通滤光片。
3.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述样品微腔的结构包括顶板和腔体，样品微腔的底部直接贴附在图像传感器芯片表面；腔体的高度为50μm～100μm，顶板的厚度≥50μm。
4.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述样品微腔的结构包括顶板、中间的腔体和底板，底板紧贴图像传感器芯片表面；底板厚度为5μm～100μm，腔体高度为50μm～100μm，顶板厚度≥50μm。
5.根据权利要求3或4所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述样品微腔的腔体形状为椭圆或者圆角菱形，腔体的两端分别设有一个或者多个进样口和出样口。
6.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述延迟荧光样品是利用具有延迟荧光特性的荧光材料标记后的生物细胞或者微生物，其中荧光信号在激发光熄灭后仍能保持一段时间即延迟时间T1。
7.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述图像传感器芯片采用CMOS图像传感器，或者采用半浮栅晶体管，或者采用复合介质栅光敏探测器阵列。
8.根据权利要求7所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述图像传感器芯片具有的像素数目≥1000万。
9.根据权利要求1所述的一种利用延迟荧光的荧光显微成像装置，其特征在于，所述遮光罩为一个厚度大于2mm且不透光的盖子。
10.一种利用延迟荧光的荧光显微成像方法，其特征在于，具体步骤如下：
第一步，将样品微腔紧贴并固定在图像传感器芯片表面，取适量延迟荧光样品注入样品微腔内；
第二步，盖上遮光罩，打开开关，时序控制模块开始工作，激发光源发出持续时间为T2的激发脉冲，入射到样品微腔上；在激发光熄灭的时刻，图像传感器芯片开始采集荧光信号并传输给图像数据处理与显示模块，采集时间为T3；
第三步，由图像数据处理与显示模块存储并显示样品的荧光信号。
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| GERARD MARRIOTT: "Time resolved imaging microscopy Phosphorescence and delayed fluorescence imaging", 《BIOPHYSICAL SOCIETY》 * |
| 毕玉花 等: "延迟荧光分析和激光共聚焦技术在检测非洲菊发育过程中表皮细胞叶绿素变化中的应用", 《生物物理学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113670880A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-19 | 南京大学 | 一种荧光显微成像装置及成像方法 |
| CN114594592A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-06-07 | 中国科学技术大学 | 测量高次谐波成像方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN114594592B (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-29 | 中国科学技术大学 | 测量高次谐波成像方法、装置、电子设备及存储介质 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109827935B (zh) | 2020-05-01 |
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