CN104865233B

CN104865233B - 基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法

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Publication number: CN104865233B
Application number: CN201510295086.XA
Authority: CN
Inventors: 邢成芬; 袁宏博; 展永; 安海龙; 齐俊杰
Original assignee: Hebei University of Technology
Current assignee: Hebei University of Technology
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2035-06-02
Also published as: CN104865233A

Abstract

本发明为一种基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，该方法根据二氧化碳对该刺激响应共轭聚合物的荧光淬灭效应，来检测二氧化碳浓度或碳酸酐酶(CA)特异性催化CO₂在水中的转化效率的方法；所述的基于刺激响应共轭聚合物的结构式如下。本发明利用CO₂对聚噻吩的荧光淬灭效应特异性的检测CO₂，避免了共价连接、酶催化等复杂的化学生物程序，可以快速、简便的应用于生物化学传感。

Description

基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法

技术领域

本发明属于环境/食品/医学/生物检验测定技术以及化学传感/分析领域，具体涉及一种基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法。

背景技术

二氧化碳(CO₂)对维持大气循环、生态平衡、碳循环等方面起着重要作用，通过检测CO₂的浓度为提前预测火山爆发、地震及海啸提供巨大帮助。但是，随着现代工业的迅速发展，大量天然含碳资源被燃烧和消耗，使得前所未有的CO₂被排放到大气中，增大空气中CO₂的含量，导致“温室效应”，使地球表面温度升高。在封闭空间内，CO₂的浓度过高会对人体健康产生巨大影响，例如，头痛、心跳加速、永久性脑损伤、昏迷甚至死亡。因此，CO₂的传感及捕获研究越来越受到重视。

作为高等有机体的关键代谢产物之一，CO₂是调节和维持有机体体液离子平衡和pH平衡的重要角色；而且由于它具有一定的水溶性及良好的生物相容性和生物膜通透性，所以其代谢过程与有机体多项生命活动息息相关。例如，碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)是红细胞的主要蛋白质成分之一，其催化的最重要的反应是二氧化碳可逆的水合作用使它在生理pH值条件(pH＝～7.0)下很快进行，在碳酸酐酶的催化下二氧化碳水合的因子在10⁷左右。上述反应对帮助体内组织排除二氧化碳极为重要。此外，在睫状体上皮细胞中，CA对维持眼压平衡起着重要作用，临床上CA是治疗青光眼的主要药物靶点。因此，实现对二氧化碳含量以及转化的检测，在维护人类生命体健康、探索生命活动的规律以及控制温室气体排放等方面具有重大意义。

目前，CO₂的传感分析通常依赖红外光谱、气相色谱和电化学的方法来进行定性和定量分析。但是，这些方法需要的仪器体积庞大，造价昂贵，并且需要经过专门训练的操作人员。近年来，新型刺激响应共轭聚合物的研究引起了科研人员的浓厚兴趣，由于共轭聚合物强的捕获光的能力和荧光信号放大功能，检测体系的检测灵敏度大大提高，广泛应用于病原微生物、金属离子、小分子化合物以及疾病相关生物标志物的高灵敏诊断和检测领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于刺激响应共轭聚合物的应用，发明人根据研究发现该共轭聚合物能够特异性地响应二氧化碳,基于二氧化碳对该刺激响应共轭聚合物特异的荧光淬灭效应以及碳酸酐酶(CA)特异性催化二氧化碳转化的活性,将该共轭聚合物应用于二氧化碳浓度及碳酸酐酶催化二氧化碳转化检测。

本发明的技术方案为：

一种基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，为根据二氧化碳对该刺激响应共轭聚合物的荧光淬灭效应，来检测二氧化碳浓度或碳酸酐酶(CA)特异性催化CO₂在水中的转化效率的方法；

所述的基于刺激响应共轭聚合物的结构式如下：

其中，式(I)中n＝8～50，x＝1-12，y＝2-12；R选自下述基团中的任意一种：

所述的基于刺激响应共轭聚合物，优选为所述R为：n＝8-15；x＝2；y＝2。

所述的检测二氧化碳浓度的方法，包括以下步骤：

(1)、将基于刺激响应共轭聚合物溶于水，使其浓度为5.0～50μM，然后通入待测气体；

(2)、通过对步骤(1)中得到的通入了待测气体的溶液进行紫光灯照射，得到溶液中聚合物的颜色；或者，以375-450nm为激发波长，对步骤(1)中得到的通入了待测气体的溶液进行荧光检测，得到此时CO₂浓度下的基于刺激响应共轭聚合物的最大荧光强度(记为I)；

(3)、将步骤(2)中得到溶液中聚合物的颜色，与相同条件下的参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以定性的得到CO₂浓度的大小；或者，根据待测气体对聚合物的最大荧光强度(记为I)，与相同条件下的不含CO₂的时的聚合物最大荧光强度(I₀)比较，计算CO₂对共轭聚合物的淬灭效率，进而得到待测气体的二氧化碳含量。

所述的相同条件下的CO₂浓度与聚合物荧光淬灭效率或荧光颜色之间关系的测量方法，为以下两种方法之一任意，包括以下步骤：

方法一，所述的参比溶液中的CO₂浓度与聚合物荧光颜色之间关系的测量方法：

a)、制备CO₂的饱和水溶液；

b)、将饱和CO₂水溶液与检测缓冲液按不同比例混合，制得一系列间隔均匀的0～饱和浓度的CO₂的溶液，浓度间隔为0.10～0.20mM；

c)、将相同量的上述刺激响应共轭聚合物分别溶于步骤b)所得的溶液中，浓度为5.0～50μM,得到不同CO₂浓度下的参比溶液；

d)、在紫外灯下分别观察所述参比溶液，得到CO₂浓度与颜色的对应关系；

或者，方法二，

步骤a)～c)，同方法一，

d)、以375-450nm为激发波长，对CO₂含量为0时的参比溶液进行荧光检测，记录该溶液中的聚合物的荧光发射光谱，所得的最大荧光强度记为I₀；

e)、将步骤c)中得到一系列参比溶液，以375-450nm为激发波长，分别进行荧光检测，分别记录不同CO₂浓度的参比溶液中聚合物的荧光发射光谱，最大荧光强度记为I；

f)、计算CO₂对共轭聚合物的淬灭效率，从而得到CO₂浓度与所述聚合物淬灭效率((I₀-I)/I₀)的对应关系。

所述的检测碳酸酐酶(CA)特异性催化CO₂在水中的转化效率的方法，包括以下步骤：

在50mM的CO₂标准溶液中加入聚合物,使聚合物浓度为5.0～50μM；作为对照，在另一个50mM的CO₂标准溶液中加入聚合物和CA，使和对照例聚合物浓度相同，同时，CA浓度为1.0～10.0U；再分别以375-450nm为激发波长，记录545nm处荧光强度比值与时间的关系；通过比较含与不含CA时，聚合物淬灭效率等同的时间，可以判断CO₂在水中的转化效率。

上述方法所述b)中，所述检测缓冲液可为纯水溶液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液或PBS缓冲液，优选为纯水溶液。

所述的步骤(1)中的温度范围优选为0～30度下，最优选为0度；

所述紫外灯为365nm的紫外灯,照射时样品与紫外灯的距离为1-5cm。

本发明的实质性特点为：在共轭聚合物体系中，共轭骨架会形成一个“能带”，受光激发后产生的激发态电子可以在“能带”上自由迁移，在迁移过程中出现能量受体时，离域于聚合物骨架的激发态电子在发生荧光发射之前被受体分子捕获，使发射过程受到阻断。所以一个猝灭剂分子可能猝灭整条共轭聚合物链发出的荧光，这样就产生了增强的电子传递猝灭效果，这就是所谓的“分子线效应”。正是由于“分子线效应”，共轭聚合物传感体系能把环境的微小波动放大为荧光性质的改变，产生荧光信号放大功能。

本发明基于共轭聚噻吩物作为荧光探针，通过CO₂对聚噻吩的荧光淬灭效应，检测CO₂在水溶液中的浓度大小。此外，基于聚噻吩荧光探针能够快速响应CO₂的特点，该荧光探针也可用于检测碳酸酐酶。

本发明的有益效果为：利用CO₂对聚噻吩的荧光淬灭效应特异性的检测CO₂，避免了共价连接、酶催化等复杂的化学生物程序，可以快速、简便的应用于生物化学传感。与传统的CO₂检测方法相比，本发明处理快速、简便、肉眼可视，高灵敏度，检测限可低至0.15mM；与各种先进的系统相比，本发明无需复杂的仪器设备，样品处理简单，成本低。此外，本发明对CO₂的响应速度迅速，即使在碳酸酐酶的催化下也能迅速的响应CO₂(10s)，从而达到检测碳酸酐酶的目的。因此，本发明在医学/食品/环境/生物检验测定技术以及化学传感/分析领域具有应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中含有不同浓度CO₂条件下所述聚合物的荧光光谱图。

图2为CO₂浓度与所述聚合物淬灭效率((I₀–I)/I₀)的对应关系。

图3为在365nm紫外灯下通入CO₂前后的颜色变化。

图4为在碳酸酐酶的催化下，所述聚合物在545nm处荧光强度比值与时间的关系。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的共轭聚合物具体为：所述R为：n＝8-15；x＝2；y＝2。缩写为PTP,其结构如式(II)所示：

式(II)化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

单体的合成：氮气保护下，将化合物NaOH(1.28g,32.0mmol)的甲醇溶液滴入到化合物3-氨乙基噻吩盐酸盐(525mg,3.20mmol)的甲醇溶液中，室温搅拌12h。旋蒸除去甲醇之后，加入二氯甲烷，水洗两次，将有机相用无水硫酸镁干燥，蒸掉溶剂，剩余物溶解在20mL甲醇中，然后依次加入1.42mL丙烯酸甲酯和20mg硼酸的水溶液(3mL)，加热至37℃反应24h。反应液冷却至室温后，减压蒸掉溶剂得粗品，硅胶柱层析纯化，石油醚：乙酸乙酯(4:1)作为展开剂，旋蒸除去溶剂真空干燥后得到无色油状液体。

PTP的合成：在反应瓶中依次加入10mL氯仿,无水三氯化铁(305mg,1.887mmol)，通N₂30min后滴加单体(142mg,0.472mmol)的3mL氯仿溶液，室温反应2天。向反应液中加入甲醇猝灭反应，过滤，甲醇/氯仿(1:1)洗涤滤渣，得到固体溶解在3mL DMSO中，加入0.4g NaOH的水溶液(3mL),加热至50℃反应12h。利用截留分子量为3500Da的透析袋透析2天；除去溶剂，干燥得到深红色固体。

实施例1、检测含有不同浓度CO₂条件下所述聚合物的荧光光谱

(a)制备零度下CO₂的饱和水溶液：在冰水中不断的通入纯净的CO₂气体30min以上，从而获得饱和的CO₂水溶液，此时CO₂的浓度为76.05mM；

(b)将饱和CO₂水溶液与检测缓冲液按不同比例混合，制得一系列含有不同CO₂浓度的标准溶液(0mM、0.15mM、0.3mM、0.45mM、0.75mM、1.05mM、1.2mM、1.5mM、3.0mM、7.5mM、15.0mM、22.5mM、30.0mM、45.0mM、60.0mM、76.0mM)；

(c)分别将5.0μL(1.0mM)PTP溶于500μL步骤(d)中含有不同浓度CO₂溶液(0mM、0.15mM、0.3mM、0.45mM、0.75mM、1.05mM、1.2mM、1.5mM、3.0mM、7.5mM、15.0mM、22.5mM、30.0mM、45.0mM、60.0mM、76.0mM)；

(d)用荧光分光光度计或多功能酶标仪读取上述步骤(c)制备完成的样品的荧光光谱，激发光为410nm，发射光谱为450–700nm；

图1为本发明实施例1中检测含有不同浓度CO₂条件下所述聚合物的荧光光谱，从图中可以看出，从图中可以看出,随着CO₂浓度的升高,聚合物的荧光强度越来越低。

实施例2、CO₂浓度与聚合物PTP在最大发射波长的荧光强度比值(简写为(I₀-I)/I)的对应关系。

根据实施例1中步骤(d)得到的荧光光谱，计算不同CO₂浓度相对于不含CO₂时(即I₀)在最大发射波长的荧光强度比值(简写为(I₀-I)/I₀)，根据比值大小判断CO₂的浓度，比值越大说明CO₂的浓度越高(结果如图2所示)。

从图2或下表中可以看出,随着CO₂浓度的升高,CO₂对聚合物的淬灭效率越高。

CO2的浓度(mM)	聚合物的荧光淬灭效率((I₀-I)/I₀)×％
		0	0
0.15	3.10722
		0.3	9.39816
0.45	18.3439

0.75	23.08632
		1.05	26.80277
1.2	30.87735
		1.5	37.41683
3.0	46.71687
		7.5	50.71499
15.0	55.83798
		22.5	60.38617
30.0	65.32423
		45.0	67.25255
60.0	74.30055
		76.05	77.28225

实施例3、通过肉眼可见的颜色变化定性的直接判断CO₂的浓度的大小。

在365nm的紫外灯下直接观察实施例1中不含CO₂和含有饱和浓度CO₂(76.05mM)的样品。

从图3可以看出，不含CO₂的样品呈亮度较高的黄色荧光，左图；含有饱和浓度CO₂的样品呈亮度较低橙色荧光，右图。

实施例4、基于碳酸酐酶(CA)对二氧化碳水合作用的催化检测碳酸酐酶。

(a)根据饱和的CO₂水溶液，配置含有50mM CO₂的溶液。

(b)将5.0μL(1.0mM)PTP溶于500μL步骤(a)中50mM CO₂的溶液作为对照(样品1)；

(c)将CA加入到500μL步骤(a)中50mM CO₂的溶液，使CA浓度为1.0U，然后再加入5.0μL(1.0mM)PTP，得到样品2；

(d)用荧光分光光度计立即读取上述步骤(b)和(c)制备完成的样品1和2在545nm处的荧光强度值与时间的关系。激发光为410nm，发射光为545nm，时间为0-50s。

(e)分别计算不含和含有CA时荧光强度比值(简写为(I/I₀,I₀为初始时间的荧光强度)与时间的关系

从图4可以看出，在碳酸酐酶的催化下，使得CO₂的转化效率大大提高,从而导致PTP的荧光强度迅速降低(约10s)。因此，本发明可以用于检测碳酸酐酶。

实施例5、应用本发明检测地窖中的二氧化碳含量。

(a)选择放置蔬菜用、深10米的地窖，采集地窖中的气体，

(b)将5.0μL(1.0mM)PTP溶于500μL的水溶液，然后通入步骤(a)中采集到的气体30min。

(c)以410nm为激发波长，进行荧光检测，记录步骤(a)中聚合物的荧光发射光谱，得到该地窖中气体对聚合物的荧光淬灭效率为18.0％。

(d)通过与标准条件下的聚合物荧光淬灭效率相比较，得到通入大气30min后的水溶液，二氧化碳含量为约0.45mM，该结果与二氧化碳检测仪(型号：HAL-HCO)检测结果相一致(0.43mM)。因此，本发明适用于检测二氧化碳的含量。

根据以上实施例我们可以看出，聚合物的淬灭效率((I₀-I)/I₀)值越大，说明样品中含有的CO₂浓度越多；通过比较含与不含CA时，聚合物淬灭效率等同的时间，可以判断CO₂在水中的转化效率。

所述对照样品(即无CO₂溶液)在365nm紫外灯下为黄色，在所述饱和CO₂水溶液的标准溶液在365nm紫外灯下为橙色；待测样品的颜色越接近于橙色说明CO₂含量越大。

本发明未尽事宜为公知技术。

Claims

1.一种基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为根据二氧化碳对该刺激响应共轭聚合物的荧光淬灭效应，来检测二氧化碳浓度或碳酸酐酶特异性催化CO₂在水中的转化效率的方法；

所述的基于刺激响应共轭聚合物的结构式如下：

式（）

其中，式（）中n＝8～50，x = 1-12，y = 2-12；R选自下述基团中的任意一种：

。

2.如权利要求1所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的基于刺激响应共轭聚合物为所述R为：；n=8-15；x =2；y = 2。

3.如权利要求1所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的检测二氧化碳浓度的方法，包括以下步骤：

（1）、将基于刺激响应共轭聚合物溶于水，使其浓度为5.0~50 μM，然后通入待测气体；

（2）、通过对步骤（1）中得到的通入了待测气体的溶液进行紫光灯照射，得到溶液中聚合物的颜色；或者，以375-450 nm为激发波长，对步骤（1）中得到的通入了待测气体的溶液进行荧光检测，得到此时CO₂浓度下的基于刺激响应共轭聚合物的最大荧光强度，基于刺激响应共轭聚合物的最大荧光强度记为I；

（3）、将步骤（2）中得到溶液中聚合物的颜色，与相同条件下的参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以定性的得到CO₂浓度的大小；或者，根据待测气体对聚合物的最大荧光强度，与相同条件下的不含CO₂的时的聚合物最大荧光强度比较，计算CO₂对共轭聚合物的淬灭效率，进而得到待测气体的二氧化碳含量；其中，待测气体对聚合物的最大荧光强度记为I，相同条件下的不含CO₂的时的聚合物最大荧光强度记为I₀。

4.如权利要求3所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的相同条件下的CO₂浓度与聚合物荧光淬灭效率或荧光颜色之间关系的测量方法，为以下两种方法之一任意，包括以下步骤：

a）、制备CO₂的饱和水溶液；

b）、将饱和CO₂水溶液与检测缓冲液按不同比例混合，制得一系列间隔均匀的0～饱和浓度的 CO₂的溶液，浓度间隔为0.10～0.20mM；

c）、将相同量的上述刺激响应共轭聚合物分别溶于步骤b）所得的溶液中，浓度为5.0~50 μM, 得到不同CO₂浓度下的参比溶液；

d）、在紫外灯下分别观察所述参比溶液，得到CO₂浓度与颜色的对应关系；

或者，方法二，

步骤a）～c），同方法一，

d）、以375 - 450 nm为激发波长，对CO₂含量为0时的参比溶液进行荧光检测，记录该溶液中的聚合物的荧光发射光谱，所得的最大荧光强度记为I₀；

e）、将步骤c）中得到一系列参比溶液，以375-450 nm为激发波长，分别进行荧光检测，分别记录不同CO₂浓度的参比溶液中聚合物的荧光发射光谱，最大荧光强度记为I；

f）、计算CO₂对共轭聚合物的淬灭效率，从而得到CO₂浓度与所述聚合物淬灭效率的对应关系；其中，聚合物淬灭效率的计算公式为：（I₀-I）/I₀。

5.如权利要求1所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的检测碳酸酐酶特异性催化CO₂在水中的转化效率的方法，包括以下步骤：

在50 mM的CO₂标准溶液中加入聚合物,使聚合物浓度为5.0~50 μM；作为对照，在另一个50 mM的CO₂标准溶液中加入聚合物和碳酸酐酶，使和对照例聚合物浓度相同，同时，碳酸酐酶浓度为1.0~10.0 U；再分别以375 - 450 nm为激发波长，记录545 nm处荧光强度比值与时间的关系；通过比较含与不含碳酸酐酶时，聚合物淬灭效率等同的时间，可以判断CO₂在水中的转化效率。

6.如权利要求1所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述b）中，所述检测缓冲液可为纯水溶液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液或PBS缓冲液。

7.如权利要求3所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的步骤（1）中的温度范围优选为0~30度。

8.如权利要求7所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述的步骤（1）中的温度最优选为0度。

9.如权利要求3所述的基于刺激响应共轭聚合物用于检测二氧化碳含量或转化的方法，其特征为所述紫光灯为365 nm的紫外灯,照射时样品与紫光灯的距离为1-5cm。