CN104856931A - 一种两性霉素b纳米复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种两性霉素B纳米复合物，含有两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG。本发明的两性霉素B纳米复合物，采用胆固醇-PEG对含有两性霉素B和胆固醇硫酸钠的纳米复合物进行修饰，不仅获得了令人满意的粒径、包封率等结果，更显示了良好的长循环性质。

Description

一种两性霉素 B 纳米复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种两性霉素B纳米复合物及其制备方法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

两性霉素B（Amphotericin B，AMB）是从链霉菌的培养液中分离而得的多烯类抗真菌药。它的抗真菌机制是与真菌细胞膜上的固醇（主要为麦角固醇）结合，改变膜通透性，细胞内容物流出，从而引起真菌细胞死亡。临床上用于治疗严重的深部真菌引起的内脏或全身感染。

两性霉素B水中不溶，为改善其溶解性，最先采用脱氧胆酸钠增溶，上市产品的商品名为Fungizone®。但Fungizone®有较强的肾毒性，几乎所有患者均可出现不同程度的肾功能损害，可出现蛋白尿、管型尿，血尿素氮及肌酐升高，肌酐清除率降低，也可引起肾小管性酸中毒，不良反应多，如静滴过程中或静滴后数小时发生寒战、高热、严重头痛、恶心和呕吐，有时并可出现血压下降、眩晕等。对血液系统、心血管系统、神经系统等都有毒性。

为改善不良反应，相继有两性霉素B脂质体Ambisome®、Amphotec®、 Amphocil®、Abelcet®、Fungisome®产品上市。后继上市的制剂均可以明显改善两性霉素B与正常细胞的结合率，提高了药物的稳定性与抗真菌能力，降低了毒性，减少两性霉素B所产生的副作用，但采用的关键辅料比较昂贵，制备工艺复杂，制备成本高。

Three Rivers Pharmaceuticals公司将两性霉素B开发成Amphotec ，虽然称为“脂质体”，但其结构与一般的胶束或脂质体结构不同（Complexes of amphotericin B and cholesteryl sulfate［J］. Journal of Liposome Research , 1993:3(3):473-490），其实际结构为两性霉素B与胆固醇硫酸钠（CS）组成的不含有内水相的盘状纳米复合物（Novel antifungal drug delivery: stable amphotericin B-cholesteryl sulfate discs［J］. International Journal of Pharmaceutics, 1991:75:45-54）。

上述的Amphotec等“脂质体”，本发明中称其为纳米复合物。静脉注射两性霉素B纳米复合物后半衰期较短，血药浓度降低很快，在一定程度上减弱了疗效。其原因是两性霉素B纳米复合物入血后快速被单核吞噬系统的库弗细胞（主要在肝脏部位）摄取，摄取的复合物在吞噬体内逐渐解离，游离的两性霉素B以较低的浓度再重新释放进入血液，因此给药后血浆中两性霉素B的浓度相对较低。纳米粒子在体内很容易被免疫识别系统识别和吞噬，为解决这一问题，通常加入甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）以制成长循环纳米制剂。然而本发明的发明人在实践中发现，由于两性霉素B纳米复合物的特殊结构，用mPEG2000-DSPE进行修饰后无长循环特性。

由于有较多的方法可能应用于制备两性霉素B纳米复合物，为了方便实验室样品制备和更容易实现产业化，我们选择了经过改良的有机溶剂注入法进行样品制备。

发明人对有机溶剂注入法制备两性霉素B纳米复合物的影响因素进行了试验，进行了有机溶剂选择，对注入温度、搅拌速度、油水相比例进行了优化，同时增加了微射流整粒工艺步骤。有机溶剂优选二甲基亚砜，注入温度为35℃-45℃，油水相比例为1:15-20。按照优化的工艺参数能够制备出粒径均匀、包封率高、质量稳定的两性霉素B纳米复合物。

发明内容

纳米粒子在体内很容易被免疫识别系统识别和吞噬，为解决这一问题，通常加入甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）以制成长循环纳米制剂。然而本发明的发明人在实践中发现，由于两性霉素B纳米复合物的特殊结构，用mPEG2000-DSPE进行修饰后无长循环特性。当采用含有两性霉素B、胆固醇硫酸钠和mPEG2000-DSPE的处方时，尝试在很大范围内调整mPEG2000-DSPE的使用量（mPEG2000-DSPE的摩尔数在胆固醇硫酸钠和mPEG2000-DSPE总摩尔数中所占比例小于等于40%，大于0。制备方法详见实施例3，虽然在粒径和包封率等方面可以满足要求，但其药代动力学参数表明该处方的纳米复合物消除快，AUC小。可见，mPEG2000-DSPE并不能使任意一种药物在制成纳米制剂后具有令人满意的长循环性质。药代动力学结果详见本发明的实施例6。

本发明的发明人在实践中出乎意料地发现，采用胆固醇-PEG（CH-PEG）对含有两性霉素B和胆固醇硫酸钠的纳米复合物进行修饰，不仅获得了令人满意的粒径、包封率等结果，更显示了良好的长循环性质。

背景技术中所述的注射用两性霉素B脂质体Amphotec，处方中含有两性霉素B和胆固醇硫酸钠，虽然胆固醇硫酸钠的硫酸钠部分也具有一定的亲水性，但是当使用胆固醇硫酸钠制备纳米复合物时，该纳米复合物并不具有理想的延长体内循环的性质，仅仅是可以增大两性霉素B的溶解性。由本发明实施例6可以看到，虽然AMB:CS:CH-PEG=10:10:0的处方所获得的体内半衰期与含有CH-PEG的处方相比没有明显差异，但其药时曲线下面积（AUC_0-t和AUC_{0- ∞}）比后者小得多，并且其血浆清除率Cl比后者大几十倍，因此含有CH-PEG的处方在体内可以更好地发挥药效。

本发明提供了一种两性霉素B纳米复合物，含有两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG。

进一步地，两性霉素B的摩尔数与胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG总摩尔数的比为1:1。

进一步地，胆固醇-PEG的摩尔数在胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG总摩尔数中所占比例为a，其中0＜a≤20%。

进一步地，两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG的摩尔比为10:9:1或10:8:2。

本发明还提供了另一种制备所述两性霉素B纳米复合物的方法，含有以下步骤：两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG溶解于有机溶剂中作为油相，配制水相，将水相置于容器中，搅拌，将油相注入水相中，继续搅拌，去除有机溶剂，整粒。

本发明提供一种药物组合物，含有上述两性霉素B纳米复合物和药学上可接受的赋形剂或载体。其中所述药学上可接受的赋形剂或载体选自冻干保护剂。其中所述冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、海藻糖或甘露醇。

本发明还提供了所述两性霉素B纳米复合物在制备治疗抗真菌药物中的用途

具体实施方式

通过以下的具体例子，可以更加具体的说明本发明，但本发明不局限于以下例子。

其中含量（%）是指重量百分比。AMB为两性霉素B，CS为胆固醇硫酸钠，CH-PEG为胆固醇-PEG，AMB-C为两性霉素B纳米复合物，CH-PEG-AMB-C为胆固醇-PEG修饰的两性霉素B纳米复合物。mPEG-DSPE-AMB-C为mPEG-DSPE修饰的两性霉素B纳米复合物。

实施例 1

两性霉素B纳米复合物的制备（有机溶剂注入法）。

精密称取摩尔比为10:10:0或10:9:1的两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG溶解于适量的二甲基亚砜中，作为油相。配制95g/L的乳糖、0.564g/L的氨丁三醇、37.2mg/L的依地酸二钠水溶液，作为水相。将水相（25℃）置于合适容器中，用混合乳化机进行搅拌（1200rpm/min），将油相缓慢注入水相中，控制油水相比为1:17.5，继续搅拌2-3min；将得到的初乳用超滤的方法去除二甲基亚砜；用微射流进行整粒，得到粒度均一的纳米复合物；然后分装于西林瓶中进行冷冻干燥。

实施例 2

胆固醇-PEG加入量范围筛选。

采用实施例1的方法制备两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG摩尔比为10:10:0、10:9:1、10:8:2、10:7:3、10:6:4的两性霉素B纳米复合物，相同整粒条件下用微射流进行整粒后检测粒径，结果显示10:7:3、10:6:4的两性霉素B纳米复合物PDI较大，说明粒径不均匀，纳米制剂粒径会影响其安全性及有效性，所以处方中胆固醇-PEG加入量限制为小于等于20%（即胆固醇-PEG在胆固醇-PEG与胆固醇硫酸钠总摩尔数中所占比例小于等于20%）。

注：PDI为多分散系数，反映粒径均匀度。

实施例 3

精密称取摩尔比为10:9:1的两性霉素B、胆固醇硫酸钠和mPEG2000-DSPE溶解于适量的二甲基亚砜中，作为油相。配制95g/L的乳糖、0.564g/L的氨丁三醇、37.2mg/L的依地酸二钠水溶液，作为水相。将水相（25℃）置于合适容器中，用混合乳化机进行搅拌（1200rpm/min），将油相缓慢注入水相中，控制油水相比为1:17.5，继续搅拌2-3min；将得到的初乳用超滤的方法去除二甲基亚砜；用微射流进行整粒，得到粒度均一的纳米复合物；然后分装于西林瓶中进行冷冻干燥。

实施例 4

粒径及包封率的测定。

采用实施例1和实施例3的方法制备如下表所述各组分比例的两性霉素B纳米复合物，将制备的两性霉素B纳米复合物加纯水进行复溶，稀释适当倍数用马尔文Nano ZS激光粒度测定仪测定粒径大小。结果见下表。

包封率为复合两性霉素B与复合两性霉素B和游离两性霉素B总和的比值，包封率反映了两性霉素B纳米复合物载药情况。采用紫外-可见分光光度法测定，检测波长为405nm，两性霉素B复合部分以甲醇为溶剂，两性霉素B游离部分以甲醇-二甲基亚砜（80:20）为溶剂。采用带微孔滤膜（孔径0.22μm）过滤装置的Ultrafree-CL离心超滤管，离心分离复合部分和游离药部分，复合部分用水冲洗，游离药部分用甲醇-二甲基亚砜（80:20）冲洗。计算包封率

EE%= A_{复合 /} (A_{复合 +} A_游离) ×100%。结果见下表。

两性霉素B纳米复合物的粒径及包封率

。

由上表结果可见，所述纳米复合物的粒径、PDI及包封率均令人满意。

实施例 5

胆固醇-PEG修饰的两性霉素B纳米复合物稳定性。

采用实施例1的方法制备两性霉素B纳米复合物，分别于0、1、2、3、6个月测定包封率及粒径，结果显示6个月纳米复合物粒径和包封率基本不变。粒径及包封率结果见下表。

实施例 6

两性霉素B纳米复合物与胆固醇-PEG修饰的两性霉素B纳米复合物体内药动学比较

取12只体重在180-220g的雄性Wistar大鼠分3组，尾静脉注射给予两性霉素B纳米复合物（AMB:CS:CH-PEG=10:10:0）或胆固醇-PEG修饰的两性霉素B纳米复合物或 mPEG-DSPE修饰的两性霉素B纳米复合物5 mg·kg^-1，给药容积为5 mL/kg。采血时间点为给药后0.5、1、2、4、8、24、48和72小时。采血方法为大鼠内眼眦静脉采血，每只大鼠每次采血量为500μl。置于肝素抗凝管中，以3000 r•min^-1离心5 min，分取上层血浆，-20℃保存待测。

取100 mL血浆样品置2 mL塑料离心管中，分别加入200 mL内标工作溶液（含氯硝西泮0.8 µg/mL的甲醇溶液），100 mL甲醇，涡旋30 s，离心（10,000 g）5 min后，取上清液装入进样小瓶，10 mL进行 LC/MS/MS分析，记录色谱图。采用WinNonlin（Ver6.2，Phoenix）软件计算，大鼠静脉注射两性霉素B纳米复合物后主要药动学参数如下表所示。

大鼠静脉注射两性霉素B纳米复合物后主要药动学参数对比

。

主要药代动力学参数对比结果表明，胆固醇-PEG修饰的两性霉素B纳米复合物在大鼠静注后C_max和AUC有明显增大。而mPEG2000-DSPE修饰的两性霉素B纳米复合物与不经mPEG2000-DSPE修饰的两性霉素B纳米复合物在药代动力学上没有明显的差异，未达到长循环的效果。

Claims (9)

1.一种两性霉素B纳米复合物，含有两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG。

2.如权利要求1所述的两性霉素B纳米复合物，其特征在于两性霉素B的摩尔数与胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG总摩尔数的比为1:1。

3.如权利要求1所述的两性霉素B纳米复合物，其特征在于胆固醇-PEG的摩尔数在胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG总摩尔数中所占比例为a，其中0＜a≤20%。

4.如权利要求1所述的两性霉素B纳米复合物，其特征在于两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG的摩尔比为10:9:1或10:8:2。

5.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的两性霉素B纳米复合物的方法，含有以下步骤：两性霉素B、胆固醇硫酸钠和胆固醇-PEG溶解于有机溶剂中作为油相，配制水相，将油相注入水相中，去除有机溶剂，整粒，即得所述的两性霉素B纳米复合物。

6.一种药物组合物，含有如权利要求1-4中任一项所述两性霉素B纳米复合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的赋形剂或载体选自冻干保护剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、海藻糖或甘露醇。

9.如权利要求1-4中任一项所述两性霉素B纳米复合物在制备治疗抗真菌药物中的用途。