CN1048496C

CN1048496C - 新抗生素波拉霉素(Polaramycin)A或B及其制造方法

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Publication number: CN1048496C
Application number: CN95100949A
Authority: CN
Inventors: 金文藻; 孟伟; 王以光; 朱昌雄; 张维西
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 1995-03-13
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 2000-01-19
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: CN1131193A

Abstract

本发明涉及从吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus CGMCC No 0220的培养物中，经酸化、过滤、菌体用溶剂提取，层析等方法分离到两种多羟基内酯(Polghydroxyl Lactone)类新抗生素，波拉霉素(Polaramycin)A.B。波拉霉素A，B具有如式(1)所示结构式，其中，波拉霉素A，B＝H；波拉霉素B，R＝CH₃，波拉霉素具有广谱抗真菌活性。

Description

新抗生素波拉霉素(Polaramycin)A或B及其制造方法

本发明属于两个新的多羟基内酯(Polyhydroxyl Lactone)抗生素，波拉霉素(Polaramycin)A或B及其制造方法，并涉及在医药及农药方面的用途。

迄今已发现的来源于微生物的抗生素已近万种，其中许多已作为医药、农药得到广泛应用，但至今仍然缺乏毒性低、效果好的医用抗真菌抗生素。另外，随着化学农药的广泛应用，由此造成的公害和环境污染也日益严重，因此对高效低毒的生物农药的要求也日益迫切。

本发明是在从放线菌中筛选抗真菌抗生素的过程中，由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus CGMCC No.0220的培养物中分离到具有很高抗真菌活性的多羟基内酯抗生素，波拉霉素A，B，基于光谱及质谱数据的分析确定，波拉霉素具有如式(1)所示结构式(波拉霉素A，R＝H；B，R＝CH₃)，该结构式可将波拉霉素A，B与迄今已知结构的所有抗真菌多羟基内酯抗生素相区别^{[1，2，4，5，6]}，波拉霉素A虽与抗生素MH 850B^[3]性质相近，但亦有区别，且后者结构至今尚不清楚，故认定波拉霉素A，B为新抗生素。

(该产生菌已保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京中关村，100080，保藏日期1995年1月25日，编号：CGMCC No.0220)式(1)波拉霉素A(R＝H)，B(R＝CH₃)

参考文献：1. Malolactomycin A J.Antibiotics 46(12)：1912-1915，19932. Malolactomycins A and B Tetrahedron 49(39)：8227-8836，19933. 抗生素MH 850A，B 日本公开特许公报平4-1876934. 抗生素MBA 028-24A 日本公开特许公报平4-2880835. 抗生素MBA 028-24B 日本公开特许公报平4-2817946. Guanidylfugin B 日本公开特许公报昭61-10595

本发明的目的在于提供如式(1)所示新结构的抗生素波拉霉素(Polaramycin)A或B及其制造方法。

本发明的内容与要点如下：1)波拉霉素A，B的结构及理化数据A)波拉霉素A的结构及理化数据

波拉霉素A具有如式(1)所示结构(R＝H)，其UV，IR，FABMS，元素分析，分子式，¹HNMR及¹³CNMR，DEPT数据如下，其结构式(1)是根据这些数据及¹H-¹H相关谱(COSY)，¹H-¹³C异核相关谱(HETCOR)以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱(HMBC)的分析确定的。UV：λ_max ^EtoHnm：222.8(图谱见附图1)IR(KBr)：3330，2905，1670(宽，强)，1595，1375，1265，

1130(肩)，1090(肩)，1060，970，835cm^-1(图谱见附图2)元素分析：C，59.95；H，9.17；N，3.99FABMS(m/z)：1090(M+H)⁺，1072，1045，987，324，306，

296，266，240，228，212，198，170，

156，142，128，114(图谱见附图3)分子式： C₅₅H₉₉N₃O₁₈ ¹HNMR(500MHz，CD₃OD，δin ppm，Jin Hz)

6.82(1H，t，J＝7)， 5.50(1H，dd，J＝15.5，6.0)

5.48(1H，dd，J＝15.5，8.0)， 5.31(1H，m)

4.83(1H，dd，J＝8.1，3.9)， 4.43(1H，dd，J＝5.5，2.0)

4.14(1H，m)， 4.12(1H，m)，

3.96(1H，m)， 3.94(1H，m)，

3.92(1H，m)， 3.89(1H，m)，

3.85(1H，ddd，J＝7.5，7.5，4)，3.80(1H，ddd，J＝7.5，7.5，2.7)，

3.67(1H，m)， 3.4(1H，d，J＝9.0)，

3.24(2H， s)， 3.20(2H，t，J＝7.0)，

2.56(1H，m)， 2.35(1H，m)

2.18(1H，m)， 1.95(1H，m)，

1.87(3H，s)， 1.046(3H，d，J＝7.0)，

0.995(3H，d，J＝6.7)， 0.970(6H，d，J＝6.8)

0.950(3H，d，J＝7.0)， 0.840(3H，d，J＝7.0)

(图谱见附图4)

¹³CNMR(125MHz，CD₃OD，δin ppm)及DEPT

174.11(C) 171.79(C) 169.54(C) 158.69(C)

144.16(CH) 134.25(CH) 134.11(CH) 128.94(C)

99.73(C) 80.3(CH) 77.13(CH) 77.08(CH)

76.30(CH) 73.43(CH) 72.35(CH) 72.29(CH)

71.76(CH) 70.55(CH) 69.69(CH) 66.22(CH)

65.62(CH) 65.36(CH) 46.51(CH₂) 46.07(CH₂)

45.82(CH) 44.74(CH₂) 44.37(CH) 43.64(CH₂)

42.48(CH₂) 41.99(CH₂) 41.49(CH₂) 41.20(CH₂)

40.93(CH) 40.66(CH) 40.18(CH) 37.72(CH₂)

35.31(CH) 34.93(CH₂) 33.98(CH₂) 32.06(CH₂)

30.83(CH₂) 30.63(CH₂) 30.37(CH₂) 30.12(CH₂)

29.90(CH₂) 27.92(CH₂) 27.65(CH₂) 27.57(CH₂)

17.74(CH₃) 15.52(CH₃) 14.53(CH₃) 14.37(CH₃)

12.60(CH₃) 11.12(CH₃) 10.30(CH₃)

(图谱见附图5)B)波拉霉素B的结构及理化数据：

波拉霉素B具有如式(1)所示结构(R＝CH₃)，其分子量比A大14，同时¹³CNMR谱比A多出了28.31ppm的信号，质谱中与侧链相关的碎片峰均比A大14个质量单位，说明波拉霉素B虽与抗生素MH850A^[3]性质相近，具有相同的分子量，但MH850A无¹HNMR谱中2.88ppm的信号，二者为不同物质，波拉霉素B的理化数据如下：UV：λ＝_max ^EtoH223nm(图谱见附图6)FABMS(m/z)：1104(M+H)⁺，1086，338，320，310，280，

254，242，226，212，184，170，142，

128(图谱见附图7)分子式： C₅₆H₁₀₁N₃O₁₈ ¹HNMR(500MHz，CD₃OD，δin ppm，Jin Hz)：

6.82(1H，t，J＝7)， 5.53(1H，dd，J＝15.0，6.0)，

5.49(1H，dd，J＝15.0，8.0) 5.32(1H，m)，

4.83(1H，m)， 4.42(1H，m)，

4.12-4.14(2H，m) 3.89-3.96(4H，m)，

3.85(1H，m)， 3.80(1H，m)，

3.68(1H，m)， 3.40(1H，d，J＝9.0)，

～3.3(2H，与甲醇信号重叠)，3.20(2H，t，J＝7.2)，

2.88(3H，s)， 2.57(1H，m)，

2.37(1H，m)， 2.20(1H，m)，

1.93(1H，m)， 1.87(3H，s)，

1.045(3H，d，J＝6.8)， 0.995(3H，d，J＝6.5)

0.965(6H，d，J＝7.0)， 0.951(3H，d，J＝7.0)，

0.841(3H，d，J＝7.0) (图谱见附图8)¹³CNMR(125MHz，CD₃OD，δin ppm)

174.08 171.80 169.55 158.31 144.19

134.17 134.17 128.95 99.76 80.29

77.22 77.06 76.36 73.55 72.42

72.30 71.66 70.60 69.71 66.32

65.67 65.42 46.48 46.10 45.76

44.73 44.28 43.58 42.56 42.01

41.57 41.19 40.91 40.66 40.18

37.76 35.37 34.95 33.96 32.07

30.80 30.66 30.36 30.14 29.95

28.31 27.92 27.67 27.58 17.75

15.51 14.59 14.37 12.60 11.17

10.32

(图谱见附图9)2)波拉霉素的生物活性：

波拉霉素(Polaramycin，其中A占90％以上)，除对革兰氏阳性细菌有一定作用外，特别对一些致病真菌及一些引起植物病害的真菌具有较高活性，分别示如表1及表2。

表一波拉霉素的抗真菌谱

试验菌	抑菌直径，nm
试验菌	抑菌直径，nm	啤酒酵母，2.399清酒酵母清酒酵母/PBR⁺新型隐球菌，14白色念珠菌，Duke株白色念珠菌，Duke株/AmBR⁺⁺白色念珠菌，3热带念珠菌假热带念珠菌季也蒙氏念珠菌付克柔氏念珠菌地丝菌Pedrosoi单孢枝菌棕黄小芽孢菌石膏样小芽孢菌石膏样毛菌须癣毛菌断发毛菌拟青霉菌根霉菌黑色曲霉曲霉/NAmBR⁺⁺⁺	15202022202318201719201632182020253315121220

波拉霉素1000μg/ml，纸片法，纸片直径5mm；培养条件：酵母样真菌为35℃，24小时，

丝状真菌为28℃，48-72小时。+ Papulacandin B耐药株++ Amphotericin B耐药株+++ 天然Amphotericin B耐药株

表2 波拉霉素对引起植物病害的真菌的抗菌谱

试验菌	ID₅₀，μg/ml
试验菌	ID₅₀，μg/ml	大豆根腐I大豆根腐II大豆根腐III黄瓜炭疽黄瓜镰刀番茄灰霉番茄疫病苹果轮纹苹果腐烂苹果干腐棉花枯萎芝麻枯萎黄柿枯萎人参锈腐柑桔黑霉梨病小麦根腐-3小麦根腐-5小麦赤霉西瓜枯萎芦笋枯萎	0.6250.6250.6250.6250.62551.251.25＜0.6250.6250.625＜1.25＜0.62550.6250.6250.6251.25＞5＜0.625＜0.625

3)波拉霉素的制造方法A)菌种及培养条件：

波拉霉素(Polaramycin)由吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus(CGMCC No.0220)产生。菌种特征为：在葡萄糖-天门冬素培养基(磷酸氢二钾0.05％，天门冬素0.05％，葡萄糖1％，洋菜1.2％)上，25-28℃培养10-14天，基内菌丝生长丰富，颜色微黄转灰，孢子灰黑，气生菌丝吸水，孢子椭圆形，表面光滑，孢子丝呈螺旋状。

将菌种斜面用挖块法接种于种子培养基(黄豆饼粉2-4％，葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄ 03％，CaCO₃ 0.15％)，25-28℃培养48-72小时，以5-10％接种量种入发酵培养基(黄豆饼粉2-3％，葡萄糖3-5％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.3％)，25℃培养96小时。B)波拉霉素A，B的分离

发酵培养物中，加入草酸调节PH到4-4.5，并加入培养物体积1％(W/V)的硅藻土过滤，滤液弃去，滤饼于40℃以下风干，干燥菌体用甲醇或乙醇等低级醇浸泡，或将菌体装于柱中用上述溶剂渗漉，将活性渗漉液或浸泡液减压浓缩至干或只余水液，干残余物或从水液中分离，干燥的水不溶物用乙酸乙酯反复洗涤，乙酸乙酯不溶物用于分离波拉霉素，可用下述两法纯化。(1)不溶物溶于甲醇，通过用甲醇溶胀的Sephadex LH-20柱纯化，用甲醇展开，收集活性部分，浓缩至1/5体积，用浓缩液5倍体积的乙酸乙酯沉淀，收集沉淀物，通过C-18反相硅胶柱纯化，用85％甲醇作流动相，用UV220nm监测，收集活性峰，浓缩至只余水液，分离形成的沉淀，从含水醇中结晶，即可得到波拉霉素。(2)上述(1)中之LH-20柱活性洗脱物，通过硅胶柱层析纯化，先后用甲醇∶乙酸乙酯(3∶1)，(5∶1)，(7∶1)混合物展开，用活性检测追踪分离过程，其中甲醇∶乙酸乙酯(7∶1)混合物可将活性物质洗脱，将活性洗脱物干燥后，再用(1)法相同条件经C-18反相硅胶柱层析纯化，得到波拉霉素，用上述两法所获之波拉霉素，经制备薄层分离[Kieselgel 60 F₂₅₄，20×20cm TLC板，用2-丁醇∶H₂O(4∶1)展开]，从含水甲醇中重结晶，分别得到波拉霉素A，B的白色晶形粉末，其中波拉霉素A占波拉霉素复合物的90％以上，B占5-10％。

C)实施例：

发酵培养物10立升，加草酸20g，PH4-4.5，加硅藻土150g，过滤，滤液弃去，菌体于40℃以下干燥后，得干菌体490g，置于5×60cm玻璃柱中，用95％乙醇渗漉，漉出液每500ml收集一份，1-3份活性较高，合并浓缩至于，得棕色干燥残余物43g，用乙酸乙酯洗涤残余物，每次200ml，乙酸乙酯不溶部分干燥后得干粉末20g，取上述乙酸乙酯不溶物2g，用甲醇10ml溶解，甲醇溶液经Sephadex LH-20柱(3×80cm)纯化，用甲醇展洗，收集流出液，每份25ml，活性物质集中在12-14份，合并活性洗脱液，浓缩至15ml，用乙酸乙酯75ml沉淀，干燥后的沉淀物280mg，此沉淀物再经硅胶柱层析(青岛海洋化工厂层析用硅胶，120-140目，3×40cm)，柱子用甲醇∶乙酸乙酯(3∶1)，(5∶1)混合物展洗后，以甲醇∶乙酸乙酯(7∶1)混合物洗脱活性物质，浓缩干燥后得活性洗脱物75mg，此洗脱物再经反相OD柱(2×70cm)层析，85％甲醇展开，用UV220nm监测，收集活性峰，浓缩干燥后，得到白色波拉霉素粉末8mg，波拉霉素经制备TLC[MerckKieselgel 60 F₂₅₄，20×20cm硅胶板，展开剂2-丁醇∶水(4∶1)]分离，可分别得到波拉霉素A(R_f 0.34)，B(R_f 0.27)，从10立升发酵液中可用上述方法分别得到波拉霉素A 55mg，波拉霉素B 5mg。

附图说明：

图1 波拉霉素A的紫外光谱

图2 波拉霉素A的红外光谱

图3 波拉霉素A的FAB质谱

图4 波拉霉素A的¹HNMR谱

图5 波拉霉素A的¹³CNMR谱

图6 波拉霉素B的紫外光谱

图7 波拉霉素B的FAB质谱

图8 波拉霉素B的¹HNMR谱

图9 波拉霉素B的¹³CNMR谱

Claims

1.一种结构式如下的波拉霉素A或B：

其特征是：式中R＝H时，为波拉霉素A；

R＝CH₃时，为波拉霉素B。

2.一种如权利要求1所示波拉霉素A或B结构式化合物的制备方法，其特征是用吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicusCGMCC No.0220进行深层发酵、溶媒提取和层析分离，得到所述的波拉霉素A或B。

3.按照权利要求2所说的波拉霉素A或B的制备方法，其特征是将菌种在组成为：磷酸氢二钾0.05％，天门冬素0.05％，葡萄糖1％，洋菜1.2％的葡萄糖-天门冬素培养基上，25-28℃培养10-14天，将菌种斜面接种到种子培养基：黄豆饼粉2-4％，葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄ 0.3％，CaCO₃ 0.15％，25-28℃培养48-72小时，以5-10％接种量种入发酵培养基：黄豆饼粉2-3％，葡萄糖3-5％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.3％，25℃培养96小时。

4.按照权利要求2所说的波拉霉素A或B的制备方法，其特征是将发酵培养物酸化至PH 4-4.5，过滤，菌体用乙醇或其它低级醇以浸泡法或渗漉法提取，干提取物用乙酸乙酯洗涤，乙酸乙酯不溶物的甲醇溶液经Sephadex LH-20柱纯化，甲醇作展开剂，再经硅胶柱层析，用甲醇：乙酸乙酯混合物作流动相，最后用C-18反向硅胶柱层析，以85％甲醇展开得到波拉霉素，波拉霉素A，B用制备薄层层析，以2-丁醇∶H₂O＝4∶1作展开剂进行分离。