CN104840672A - 温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用有效部位的提取工艺与筛选方法，特征在于制备出该复方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和乙醇部位，筛选出该复方治疗系统性硬化病免疫抑制作用的主要有效部位——水溶性部位和正丁醇部位，为进一步开发出治疗系统性硬化病的新药提供了实验依据。

Description

温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法。

背景技术

系统性硬化病（systemic sclerosis, SSc）是一种以皮肤增厚和纤维化以及内脏器官（包括心、肺、肾和消化道等）受累为特征的自身免疫性疾病，其病因尚不十分清楚，现代临床治疗多采用结缔组织形成抑制剂（如青霉胺、秋水仙碱等）、免疫抑制剂、糖皮质激素及运用针对血管和改善微循环的药物等。温阳化浊通络方由黄芪20～30 份，党参12～15 份，山药12～15 份，仙灵脾12～15 份，熟地15～20 份，桂枝9～12份，积雪草12～15 份，白芥子6～10 份，槌果藤15～20 份，丝瓜络9～12 份组成，具有补肺健脾益肾、化浊通络之功效，临床用于治疗SSc效果显著，且具有较高的安全性，但该方治疗SSc的主要药效部位尚不清楚，且传统的水煎煮法难免导致一些水不溶性成分的流失。有鉴于此，本发明即以药效评价为导向，通过体内、体外实验探讨温阳化浊通络方不同提取部位对免疫功能和脾淋巴细胞增殖的影响，筛选其免疫抑制作用的有效部位，阐明其药效物质基础。

发明内容

为筛选温阳化浊通络方免疫抑制作用的有效部位，阐明其药效物质基础。本发明目的就是提供一种该方关于免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法。

该温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法，其特征在于按下述步骤提取、筛选：

1.将复方中槌果藤蒸制10～30min之后以水煎煮5～15min，弃去煎液，而后将槌果藤沥干备用；

2.将复方中的药材黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:10～1:30以水合煎2～4次，每次30～90min，于最后一次煎煮时加入桂枝、积雪草、丝瓜络，合并水煎液，自然过滤或抽滤，回收药渣，滤液备用；

3.将步骤3中滤液以终醇浓度75～85%进行醇沉，并静置8～16h，离心得沉淀即为水溶性部位（I），上清液备用；

4.将步骤3中药渣以及步骤2所得槌果藤以80%～100%乙醇回流提取2～3次，合并滤液，分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，即得乙醚部位（II）、乙酸乙酯部位（III）、正丁醇部位（IV）；剩余乙醇液浓缩，备用；

5.将步骤4中上清液与步骤5乙醇浓缩液合并，即得乙醇部位（V）；

6.观察温阳化浊通络方不同提取部位对小鼠DTH反应的影响，以及对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响，筛选出温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能明显抑制小鼠DTH反应，抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SSc的有效部位。

该提取筛选工艺不同于传统的单纯水煎，旨在将温阳化浊通络方各个部位全部提取出来，以全面确定该方关于免疫抑制作用的有效部位。

本发明工艺中，黄芪主要成分黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等，能提高免疫功能，对淋巴细胞体外增殖具有抑制作用等；党参主要含党参苷、党参碱、黄酮类及糖类等成分，具有增强网状内皮系统功能，增加皮质酮分泌、调节免疫等药理作用；淫羊藿含有多糖、黄酮类、生物碱、萜类、木脂素等多种活性物质，对于抑制血栓形成，降低全血粘度并抑制经ConA刺激的T淋巴细胞早中期活化、增殖、钙离子内流，阻滞细胞周期在G₀/G₁期有明显作用；熟地具有调节免疫、抗氧化等作用；槌果藤主要成分有挥发油类、黄酮及其苷类、生物碱及酚酸类等，具有抗菌消炎、抗氧化保肝等作用；积雪草化学成分包括三萜皂苷、多炔烯类和挥发油等，具有调节免疫、抵抗纤维化、抗炎镇痛等作用；白芥子主要含芥子油苷，抑制炎性渗出，抗炎镇痛、抗前列腺增生等作用；桂枝有效成分为挥发油，具有扩张血管、解热镇痛、抗过敏、抗炎等作用；丝瓜络具有抗炎、镇痛及利尿等作用。

由于温阳化浊通络方中成分纷繁复杂，且各种化合物极性大小相差甚大，单纯采取水煎的传统方式不可能全面利用复方有效成分，故而有本发明之工艺。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为温阳化浊通络方不同提取部位对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响；

图2  温阳化浊通络方不同提取部位对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，但本发明的内容不仅限于此。

实施例1

温阳化浊通络方由黄芪30g，党参15g，山药15g，淫羊藿15g，熟地20g，桂枝12g，积雪草15g，白芥子10g，槌果藤20g，丝瓜络12g。

1.该复方免疫抑制作用有效部位的提取

（1）将复方中槌果藤蒸制20min之后以水煎煮5min，弃去煎液，而后将槌果藤沥干备用；

（2）将复方中的药材黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:25以水合煎4次，每次90min，于最后一次煎煮时加入桂枝、积雪草、丝瓜络，合并水煎液，自然过滤或抽滤，回收药渣，滤液备用；

（3）将步骤2中滤液以终醇浓度85%进行醇沉，并静置16h，离心得沉淀即为水溶性部位（I），上清液备用；

（4）将步骤2中药渣以及步骤1所得槌果藤以100%乙醇回流提取2次，合并滤液，分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，即得乙醚部位（II）、乙酸乙酯部位（III）、正丁醇部位（IV）；剩余乙醇液浓缩，备用；

（5）将步骤3中上清液与步骤4乙醇浓缩液合并，即得乙醇部位（V）。

2. 该复方免疫抑制作用有效部位的筛选

（1）方法

①DTH反应测定

取80只ICR小鼠，按体质量分层随机分出10只作为空白对照组，其余小鼠参照相关实验方法建立DTH小鼠模型：实验开始日（d1）和d2在小鼠腹部固定部位脱毛，面积约3cm2，于去毛部位涂0.5% DNFB（以丙酮：橄榄油4:1的比例配置）40μl致敏，d7于左耳内外侧涂0.3% DNFB 20μl激发。按体质量随机将造模小鼠分为 7组： 模型组、Dex组（1.5mg/kg）、水溶性部位组（982 mg/kg）、乙醚部位组（136mg/kg）、乙酸乙酯部位组（35 mg/kg）、正丁醇部位组（315mg/kg）、乙醇部位组（721mg/kg）。自致敏前2d开始，按上述剂量每天灌胃实验药物0.2ml/10g，空白对照组、模型对照组灌胃等量蒸馏水，1次/d，连续 8d。激发48h后颈椎脱臼法处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器在相同部位取直径8 mm 耳片，以游标卡尺测量厚度并以分析天平称量重量，同时取小鼠胸腺及脾脏称重。以左右耳片厚度、重量之差为肿胀度；以每10g小鼠的脾重和胸腺重作为脾指数和胸腺指数脾。（胸腺）指数=［脾（胸腺）质量（mg）/体质量（g）］×10。

②脾细胞悬液的制备   将处死的小鼠放入75%乙醇中浸泡消毒1分钟，无菌条件下取脾脏并去掉被膜，于200目筛网上轻捻脾组织，使细胞经筛网过滤至离心管中，离心（1500r/min，10min)后弃上清。用红细胞裂解液除去红细胞，用PBS冲洗2～4次。最后加入10% FCS-RPMI-1640培养液调节小鼠脾淋巴细胞浓度为3×10⁶个/ml备用。

③T、B淋巴细胞增殖活性分析   分别检测 ConA 刺激的 T 淋巴细胞增殖和LPS刺激的B淋巴细胞增殖。将上述脾细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl。实验分组如下：空白本底组（只加RPMI-1640培养基）、对照组（加入终浓度为5μg/ml 的ConA或10μg/ml 的LPS）、不同浓度温阳化浊通络方各部位提取物干预下的实验组（分别加入终浓度为5μg /ml、15μg /ml、25μg /ml、35μg /ml的各部位提取物）、Dex组（加入Dex，终浓度同上），每组设10个复孔。将培养板于37℃、5% CO₂温箱中培养48h。之后每孔分别加入10μl MTT溶液再继续培养4h，然后加入100μl/孔酸化的SDS，震荡3min，温箱培养3h。用酶标仪于波长490nm处测吸光度（A值），计算T、B淋巴细胞的抑制率。抑制率%=（对照组A均值-实验组A均值）/（对照组A均值-空白本底组A均值）×100%。

④统计学方法  采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

（2）结果

①温阳化浊通络方不同提取部位对DTH小鼠耳壳肿胀度的影响   见表1。与空白组比较，DTH模型组耳壳增重、增厚显著（P＜0.01）。与模型组比较，温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位组均能显著抑制小鼠耳壳的肿胀（P＜0.01），同时温阳化浊通络方乙醇部位组亦能抑制小鼠耳壳的肿胀（P＜0.05）。

表1  温阳化浊通络方不同提取部位对DTH小鼠耳壳肿胀度的影响（                                                ±s，n=10）

组别	剂量（mg/kg）	耳壳增重（mg）	耳壳增厚（mm）
				空白对照组	—	1.012±0.069	0.095±0.005
模型组	—	10.301±2.091#	0.199±0.017#
				Dex组	1.5	4.489±1.476**	0.112±0.015**
水溶性部位组	982	5.300±1.056**	0.119±0.0116**
				乙醚部位组	136	8.964±1.819	0.200±0.011
乙酸乙酯部位组	35	9.399±1.826	0.193±0.008
				正丁醇部位组	315	4.876±1.033**	0.109±0.022**
乙醇部位组	721	7.522±1.867*	0.162±0.005*

注：与空白对照组比较，^# P＜0.01；与模型组比较，^* P＜0.05，^** P＜0.01。

②温阳化浊通络方不同提取部位对DTH小鼠脾和胸腺指数的影响  见表2。与空白组比较，DTH模型组脾、胸腺指数均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位组小鼠免疫器官的脏器指数均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2  温阳化浊通络方不同提取部位对DTH小鼠脾和胸腺指数的影响（±s，n=10）

组别	剂量（mg/kg）	脾指数	胸腺指数
				空白对照组	—	4.740±0.429	2.339±0.153
模型组	—	6.943±0.090#	3.062±0.283#
				Dex组	1.5	4.348±0.214**	1.095±0.105**
水溶性部位组	982	4.510±0.104**	1.172±0.094**
				乙醚部位组	136	6.053±0.282	2.933±0.103
乙酸乙酯部位组	35	6.131±0.262	3.076±0.128
				正丁醇部位组	315	4.126±0.235**	1.094±0.095**
乙醇部位组	721	6.715±0.221	2.884±0.188

与空白对照组比较，^# P＜0.01；与模型组比较， **P＜0.01。

③温阳化浊通络方不同提取部位对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响   见图1、图2。温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位各剂量组对ConA 诱导的 T淋巴细胞增殖和LPS 诱导的 B淋巴细胞增殖均呈现明显的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。同时，浓度为35μg /ml水溶性部位对T淋巴细胞增殖的抑制效应、浓度为25～35μg /ml正丁醇部位对B淋巴细胞增殖的抑制效应甚至高于Dex组（P＜0.05）。另外，高浓度（25～35μg /ml）乙醇部位也表现出对T、B淋巴细胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。图1  温阳化浊通络方不同提取部位对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响。其中：与同组5μg /ml 浓度比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与Dex组比较，▲P＜0.05。图2  温阳化浊通络方不同提取部位对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响，其中：与同组5μg /ml 浓度比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与Dex组比较，▲P＜0.05。

本发明中温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能明显抑制小鼠DTH反应；抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SSc的有效部位。

实施例2

黄芪25g，党参13g，山药13g，淫羊藿13g，熟地18g，桂枝10g，积雪草13g，白芥子8g，槌果藤17g，丝瓜络11g。

其制备工艺如下：

1.将复方中槌果藤蒸制15min之后以水煎煮8min，弃去煎液，而后将槌果藤沥干备用；

2.将复方中的药材黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:20以水合煎3次，每次90min，于最后一次煎煮时加入桂枝、积雪草、丝瓜络，合并水煎液，自然过滤或抽滤，回收药渣，滤液备用；

3.将步骤2中滤液以终醇浓度80%进行醇沉，并静置14h，离心得沉淀即为水溶性部位（I），上清液备用；

4.将步骤2中药渣以及步骤1所得槌果藤以90%乙醇回流提取2次，合并滤液，分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，即得乙醚部位（II）、乙酸乙酯部位（III）、正丁醇部位（IV）；剩余乙醇液浓缩，备用；

5.将步骤3中上清液与步骤4乙醇浓缩液合并，即得乙醇部位（V）。

温阳化浊通络方不同部位提取物免疫抑制作用的筛选方法同实施例1的方法。筛选结果是温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能明显抑制小鼠DTH反应；抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SSc的有效部位。

实施例3

本发明药物一种治疗系统性硬化病的中药颗粒剂，由下述重量组份的原料配制而成：

黄芪20g，党参12g，山药12g，淫羊藿12g，熟地15g，桂枝9g，积雪草12g，白芥子6g，槌果藤15g，丝瓜络9g。

其制备工艺如下：

1.将复方中槌果藤蒸制10min之后以水煎煮10min，弃去煎液，而后将槌果藤沥干备用；

2.将复方中的药材黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:15以水合煎3次，每次60min，于最后一次煎煮时加入桂枝、积雪草、丝瓜络，合并水煎液，自然过滤或抽滤，回收药渣，滤液备用；

3.将步骤2中滤液以终醇浓度80%进行醇沉，并静置12h，离心得沉淀即为水溶性部位（I），上清液备用；

4.将步骤2中药渣以及步骤1所得槌果藤以80%乙醇回流提取3次，合并滤液，分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，即得乙醚部位（II）、乙酸乙酯部位（III）、正丁醇部位（IV）；剩余乙醇液浓缩，备用；

5.将步骤3中上清液与步骤4乙醇浓缩液合并，即得乙醇部位（V）。

温阳化浊通络方不同部位提取物免疫抑制作用的筛选方法同实施例1的方法。筛选结果是温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能明显抑制小鼠DTH反应；抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SSc的有效部位。

Claims (1)

1.温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的提取筛选方法，其特征在于按下述步骤提取、筛选：

（1）将复方中槌果藤蒸制10～30min之后以水煎煮5～15min，弃去煎液，而后将槌果藤沥干备用；

（2）将复方中的药材黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、白芥子，按料液比1:10～1:30以水合煎2～4次，每次30～90min，于最后一次煎煮时加入桂枝、积雪草、丝瓜络，合并水煎液，自然过滤或抽滤，回收药渣，滤液备用；

（3）将步骤（3）中滤液以终醇浓度75～85%进行醇沉，并静置8～16h，离心得沉淀即为水溶性部位（I），上清液备用；

（4）将步骤（3）中药渣以及步骤（2）所得槌果藤以80%～100%乙醇回流提取2～3次，合并滤液，分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，即得乙醚部位（II）、乙酸乙酯部位（III）、正丁醇部位（IV）；剩余乙醇液浓缩，备用；

（5）将步骤（4）中上清液与步骤（5）乙醇浓缩液合并，即得乙醇部位（V）；

（6）观察温阳化浊通络方不同提取部位对小鼠DTH反应的影响，以及对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响，筛选出温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能明显抑制小鼠DTH反应，抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SSc的有效部位。