CN104830877B - 一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因及其应用 - Google Patents
一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因及其应用。本发明提供了一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因，即甲硫氨酸亚砜还原酶A5（MSRA5），能够在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同。其筛选耐热蓝莓品种的方法：人工模拟气候45℃热胁迫处理蓝莓6 h，并提取总RNA，逆转录成cDNA作为模板；以该基因CDS序列为模板设计的引物进行qRT‑PCR检测，凡检测到相对表达量为‘戴安娜’相对表达量1倍以上时，该蓝莓品种可鉴定为耐热品种。该方法相较于田间自然鉴定法更快捷、稳定和准确，是快速筛选耐热品种进行推广种植和耐热新品种育种的基础。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与蓝莓耐热相关的分子标记及其方法和用途。
背景技术
蓝莓(Vaccinium spp.)是原产于美国的多年生灌木果树，目前用于商业种植的蓝莓主要有北高丛蓝莓、南高丛蓝莓、和兔眼蓝莓三个种类。在北美洲，耐寒性强的北高丛蓝莓主要种植在中西部和东北部，而耐热性较强的南高丛蓝莓和兔眼蓝莓以种植在南部和西南部为主。蓝莓近年来不仅在中国北方进行大规模种植，还在亚热带的中国南方进行了栽培。高温是限制蓝莓生长的主要因素之一，随着气温逐年升高和中国蓝莓产业的南移，对于耐热蓝莓品种的筛选和耐热新品种的培育显得尤为重要。
‘戴安娜’是由28-8A(Katherine×Jersey)为母本和Scammell aka 1257A(826-1×Rubel)为父本杂交得到的，属于南高丛蓝莓，其具有良好的口感。在浙江金华地区大田种植三年后其死亡率为3.3％，我们还测得其半致死温度为47.32℃，具有较强的耐热性。
植物中甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)的研究相对较晚。肽链中甲硫氨酸易被过氧化氢等活性氧氧化成为甲硫氨酸-R,S-亚砜(Met-R，S-SO)，它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，MSR可将甲硫氨酸-R,S-亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性。高级植物拥有两种MSR，即MSRA和MSRB，MSRA也分为两个亚型，第一个亚型由细胞质和质体中的MSRA1-MSR4组成，第二个亚型由MSRA5组成。大量数据表明，环境压力和生物胁迫可以大大影响高等植物中的MSR基因表达，在过去几年中已经利用拟南芥突变体以及过表达体对于植物MSR的功能有了一定的了解，研究结果均表明MSR在植物抵抗由对高温、低温和强光等非生物胁迫造成的氧化损伤中起到非常重要的作用。
我们在研究蓝莓耐热性时发现甲硫氨酸亚砜还原酶A5(MSRA5)，能够在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同。应用人工模拟气候热胁迫处理蓝莓，再通过标记基因对耐热蓝莓品种筛选具有快捷、方便和准确的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同的标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5(MSRA5)的序列引物，并利用该引物进行蓝莓品种是否是耐热品种的鉴定方法。通过人工模拟气候热胁迫处理待测蓝莓品种，并检测其标记基因的表达量相对于‘戴安娜’的倍数，确定该蓝莓品种是否为耐热品种，加快对耐热蓝莓品种的筛选和耐热新品种的培育。
为了实现本发明目的，本发明的一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因及其应用，通过以下技术方案实现：
1.提供一种在高温胁迫条件下的不同蓝莓品种中上调表达且程度不同的标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5(MSRA5)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.针对上述基因的核苷酸序列，进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3(见表1)。
3.人工模拟气候45℃热胁迫处理‘戴安娜’和待检测蓝莓6h，并提取总RNA，逆转录成cDNA作为模板；以GAPDH为内参基因(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，见表1)，进行qRT-PCR鉴定。若标记基因在待测蓝莓品种叶片中的表达模式为上调表达，相对表达量为‘戴安娜’1倍以上时，该蓝莓品种可鉴定为耐热品种。
表1 进行qRT-PCR的相关引物
| 序列名称 | 序列 |
| SEQ ID No.2 | GCCCAATCATCATCCCCTCA |
| SEQ ID No.3 | TCGTTTTAGATCCACCAGCGTAA |
| SEQ ID No.4 | ACTACCATCCACTCTATCACCG |
| SEQ ID No.5 | AACACCTTACCAACAGCCTTG |
本发明与已有技术相比其特点为：本发明通过人工模拟气候热胁迫，再借助分子生物学技术，成功建立一种利用标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5(MSRA5)筛选蓝莓耐热性方法，该方法与占地广、费工、费时的常规田间自然鉴定法相比，本发明具有操作简单、周期短、省力、成本低、条件可控，结果稳定准确等优点。为蓝莓耐热品种鉴定和培育开辟了新的分子技术途径，对耐热蓝莓品种的选育具有重要理论意义和应用价值。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验耗材及药品，如无特殊说明，均为生物试剂公司购买得到；所有引物合成均由生工生物工程(上海)有限公司完成。以下实施例中所用的蓝莓材料均为公知公用。
实施例1：
一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因，甲硫氨酸亚砜还原酶A5(MSRA5)，其核苷酸序列SEQ ID No.1。
实施例2：
针对上述基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件(加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计评估的软件)进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
实施例3：
以6份蓝莓品种耐热性鉴定，筛选耐热品种为例，对本发明的具体应用方式进行说明。
1)实验材料
以当前生产上主栽的蓝莓品种为材料，共选择6个2年生供试蓝莓品种材料：北高丛蓝莓：‘达柔’、‘早蓝’和‘泽西’；南高丛蓝莓：‘夏普兰’、‘奧尼尔’、‘薄雾’。以南高丛蓝莓‘戴安娜’为对照。均购于青岛沃林蓝莓果业有限公司。上述蓝莓材料的半致死温度(LT50)见表2，‘达柔’、‘早蓝’和‘薄雾’都在45℃以下，而‘泽西’、‘夏普兰’和‘奧尼尔’都在45℃以上，因此‘泽西’、‘夏普兰’和‘奧尼尔’三种蓝莓品种可以认为是耐热品种。
2)蓝莓人工模拟气候热胁迫处理
将蓝莓材料放入人工气候室进行6h的热胁迫，温度设为45℃，控制湿度75％。对其进行处理后取完整、无病虫害的当年生春夏梢自顶向下数第2-4叶位的叶片用于分析测定。
3)RNA提取及cDNA合成
用改良CTAB法提取热胁迫后的蓝莓叶片的总RNA，并逆转录成cDNA。
4)荧光定量PCR
以GAPDH为内参基因(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)，进行qRT-PCR鉴定(以大连宝生物荧光定量试剂盒RR82LR为例)：
反应条件：95℃30s；95℃5s，58℃35s，总共40个循环，进行qRT-PCR检测，并使用2-ΔΔCt法进行计算分析。
结果表明(表2)，‘泽西’、‘夏普兰’和‘奧尼尔’三种蓝莓品种相对表达量为‘戴安娜’的1倍以上，这三种蓝莓品种可鉴定为耐热品种，其结果与测得的半致死温度一致。
表2 供试蓝莓的MSRA5相对于‘戴安娜’的相对表达量和半致死温度(LT50)
| 达柔 | 早蓝 | 泽西 | 夏普兰 | 奧尼尔 | 薄雾 | |
| MSRA5 | 0.53 | 0.70 | 1.75 | 1.84 | 1.59 | 0.64 |
| LT50(℃) | 43.20 | 44.68 | 48.30 | 49.20 | 48.62 | 44.32 |
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江师范大学
<120> 一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 蓝莓
<400> 1
atgaagccgc gggggagaaa tctcctctct cctcgaatcg cttgctttgc atttctgtgc 60
agcattttaa tggcggacac ggctttgagc atcaggttac cggatcggat ctctcaactt 120
ccgattgact cgcccaatca tcatcccctc aaaacagcgg ttttcgccct tggtagcttc 180
tggagatctg aagccgtttt cggatgcttg gatggcgtcg ttacgacgac agtcggttac 240
gctggtggat ctaaaacgaa ccccgagtac cgtagcttgg gtgatcacgc tgaatctgtg 300
cagattgaat atgatcctag gctgatcaac ttcaggcagc ttttggaggt cttctggtcc 360
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attatcttca ctaatgggag tgaagaatcc agactagctg cagtcaccaa agaaagagag 480
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atcattagaa aaggttggcc catgttaaga gaattctag 759
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcccaatcat catcccctca 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgttttaga tccaccagcg taa 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actaccatcc actctatcac cg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacaccttac caacagcctt g 21
Claims (5)
1.一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的一种与蓝莓耐热能力相关的标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5，其特征在于，其能够在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同。
3.权利要求1所述的与蓝莓耐热能力相关的标记基因甲硫氨酸亚砜还原酶A5的qRT-PCR引物，其特征在于，以其CDS序列为模板，进行qRT-PCR引物的设计，引物序列如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示。
4.权利要求3所述的qRT-PCR引物的应用，其特征在于，包括以下步骤：
人工模拟气候热胁迫处理‘戴安娜’和待检测蓝莓品种，并提取总RNA，逆转录成cDNA作为模板，以GAPDH为内参基因，其引物序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，以权利要求3所述引物为引物，进行qRT-PCR检测鉴定：
qRT-PCR反应体系如下：
反应条件：95℃30s；95℃5s，58℃35s，总共40个循环，进行qRT-PCR检测，并使用2-ΔΔCt法进行计算分析；
检测分子标记相对表达量，如果检测到相对表达量为‘戴安娜’相对表达量1倍以上时，该蓝莓品种可鉴定为耐热品种。
5.根据权利要求4所述的qRT-PCR引物的应用，其特征在于，人工模拟气候热胁迫处理条件为在45℃的光照培养箱中处理6h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Guo Weidong Inventor after: Chen Qiaoyue Inventor after: Ye Meijuan Inventor after: Jiang Chachen Inventor after: Zheng Xiaomei Inventor after: Wu Chenchen Inventor before: Guo Weidong Inventor before: Ye Meijuan Inventor before: Jiang Chachen Inventor before: Zheng Xiaomei Inventor before: Wu Chenchen |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20150812 Assignee: Jinhua lantu Agricultural Technology Co.,Ltd. Assignor: ZHEJIANG NORMAL University Contract record no.: X2021330000493 Denomination of invention: A marker gene related to heat tolerance of blueberry and its application Granted publication date: 20171128 License type: Common License Record date: 20211019 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |