CN104826104A

CN104826104A - 一种基于聚乙二醇修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN104826104A
Application number: CN201510227512.6A
Authority: CN
Inventors: 胡涛; 安文琪; 范蓓; 张婷婷; 马小伟; 潘若文
Original assignee: Hualan Biological Bacterin Co ltd; Hualan Biological Engineering Co ltd; Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Hualan Biological Bacterin Co ltd; Hualan Biological Engineering Co ltd; Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明描述了一种基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法。该疫苗的制备方法由如下步骤组成：(1)溴化氰活化脑膜炎球菌荚膜多糖；(2)用N-2-胺乙基-马来酰亚胺衍化溴化氰活化的多糖；(3)由2-亚氨基硫烷将破伤风类毒素的氨基转化为巯基；(4)脑膜炎球菌多糖的衍生物与破伤风类毒素的衍生物进行结合；(5)用聚乙二醇修饰多糖-蛋白结合物中的破伤风类毒素。通过上述步骤，可制备出新型、高效的脑膜炎多糖结合疫苗，用于预防流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的感染。

Description

一种基于聚乙二醇修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法

技术领域

本发明公开了一种基于聚乙二醇修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法。使用该方法制备的脑膜炎多糖结合疫苗，可用于预防流行性脑膜炎等疾病，属于生物医药领域。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是引起流行性脑脊髓膜炎的病原菌。脑膜炎奈瑟氏球菌主要通过咳嗽，喷嚏或接吻等方式进行传播，由鼻咽部侵入血液循环，引起菌血症和败血症。病人会出现恶寒、发热、恶心、呕吐，皮肤上有出血性皮疹，严重时该菌会侵染脑脊髓膜，发生化脓性脑脊髓膜炎。流行性脑膜炎通常以7岁以下的儿童和60岁以上老人的发病率最高，死亡率维持在5％-10％之间。

脑膜炎奈瑟氏球菌根据其荚膜多糖的特异性，可分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W₁₃₅、X、Y、Z共十三个血清型致病菌。其中，以A、C、W₁₃₅和Y群菌株的毒力最强，占发病病例的95％以上，是引起流行性脑膜炎最常见的4种致病菌株。传统的脑膜炎荚膜多糖疫苗仅能诱导短期的T细胞非依赖性免疫反应，免疫原性弱，且产生的抗体很快就会消失，尤其对两岁以下婴幼儿的保护效果最差。这是由于荚膜多糖是T细胞非依赖性抗原，只能激活非成熟的B细胞，产生IgM抗体，几乎不能诱导产生B记忆细胞，不具备免疫记忆能力。通过将荚膜多糖与具有强免疫原性的载体蛋白进行共价结合，可以将T细胞非依赖型的荚膜多糖转化为T细胞依赖型的多糖，提高荚膜多糖的免疫原性。人们在此基础上成功开发了多糖结合疫苗，在一定程度上解决了这一问题。然而，目前已上市的多糖结合疫苗的免疫原性仍有待进一步的提高。

近期的研究结果表明，当载体蛋白的剂量在0.025-2.5μg的范围内，能够提高多糖结合疫苗中多糖的免疫原性；当载体蛋白的剂量超过25μg以上时，能够显著抑制多糖的免疫原性。例如，当破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳疫苗和以破伤风类毒素为载体的流感嗜血杆菌多糖结合疫苗、脑膜炎多糖结合疫苗一起免疫注射时，抗流感嗜血杆菌和抗破伤风类毒素的抗体都会减少，这就是经典的载体抑制现象。因此，具有适度免疫原性的载体蛋白有助于提高多糖结合疫苗的免疫原性。通过改变载体蛋白的免疫原性来提高多糖结合疫苗的免疫原性，是优化载体蛋白和设计新型多糖结合疫苗的一种关键技术。

聚乙二醇(PEG)是一种中性、无毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修饰可有效增加载体蛋白的水化体积，减少肾小球的过滤作用，延长载体蛋白在体内的半衰期，提高其生物利用度；PEG分子覆盖在载体蛋白的表面，可屏蔽其抗原表位，可在一定程度上降低载体蛋白的免疫原性。因此，通过适度的PEG修饰，可以改变载体蛋白的免疫原性，获得具有适度免疫原性的载体蛋白，从而进一步提高多糖结合疫苗的免疫原性。

发明内容

(1)本发明提供了一种基于聚乙二醇修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，并以此方法制备出一种具有高免疫原性的脑膜炎多糖结合疫苗。

(2)本发明所涉及的脑膜炎多糖结合疫苗，所使用的脑膜炎多糖为血清型为A、C、W₁₃₅和Y群的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。

(3)本发明所涉及的脑膜炎多糖结合疫苗，所使用的蛋白载体为破伤风类毒素。

(4)本发明涉及一种脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其核心技术是通过PEG修饰适度地抑制载体蛋白的免疫原性，提高脑膜炎多糖结合疫苗中荚膜多糖的免疫原性。具体而言，通过控制载体蛋白所连接的PEG数量，在一定程度上屏蔽载体蛋白的抗原表位，获得具有适度免疫原性的载体蛋白，从而进一步提高多糖结合疫苗的免疫原性。

(5)本发明涉及一种脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，由以下步骤组成：(a)溴化氰活化脑膜炎球菌荚膜多糖；(b)用N-2-胺乙基-马来酰亚胺衍化溴化氰活化的荚膜多糖；(c)由2-亚氨基硫烷将破伤风类毒素的氨基转化为巯基；(d)脑膜炎荚膜多糖的衍生物与破伤风类毒素的衍生物进行共价结合；(e)用聚乙二醇修饰多糖-蛋白结合物中的破伤风类毒素。

使用本发明所制备的脑膜炎多糖结合疫苗，能预防由A、C、W₁₃₅和Y群血清型脑膜炎奈瑟氏球菌感染引起的疾病，适用于2个月以上各年龄段的儿童。该多糖结合疫苗的特点是通过PEG修饰适度地抑制载体蛋白的免疫原性，从而获得较高免疫原性的多糖结合疫苗。

附图说明

图1多糖结合疫苗的制备反应示意图。

图2多糖结合疫苗的分离纯化。分离纯化由Sephacryl 300凝胶过滤柱(2.6cm×60cm)进行。流动相为20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，流速为0.5ml/min。

图3¹H NMR测定多糖结合疫苗的结构。

图4多糖结合疫苗的免疫原性。图a为在第7天、14天和21天产生的多糖特异性的IgG抗体滴度；图b为在第21天产生的多糖特异性的IgG1和IgG2a抗体滴度；图c为在第21天产生的多糖特异性的IgM抗体滴度；图d为在第21天产生的载体蛋白特异性的IgG抗体滴度。

图5脑膜炎多糖特异性抗体的特异性和亲合性。图a为多糖特异性抗体的特异性；图b为多糖特异性抗体的亲合性。

具体实施方式：

通过以下具体的实施例，进一步说明本发明。

实施例1：制备未被PEG修饰的脑膜炎多糖结合疫苗

未被PEG修饰的脑膜炎多糖结合疫苗(PS-TT)的制备反应如图1所示。将15mg A群脑膜炎球菌荚膜多糖溶于3ml生理盐水中，使其终浓度为5mg/ml。用0.5M氢氧化钠将溶液的pH值调节为10.8。加入30μl溴化氰溶液(50％，w/v)进行活化，于室温下反应30分钟。活化过程中，用0.5M NaOH将溶液的pH值维持在10.5左右。随后，用0.5M的盐酸将溶液的pH值调节至8.5左右，终止活化反应。随后，加入15mg N-2-胺乙基-马来酰亚胺，于4℃下反应过夜，获得脑膜炎多糖的活化产物。

将破伤风类毒素(TT)与2-亚氨基硫烷以摩尔比为1：50的比例混合，反应pH值为7.4，于4℃条件下反应过夜。如图1所示，2-亚氨基硫烷会将破伤风类毒素分子的氨基转化成巯基。用截留分子量为10kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的2-亚氨基硫烷。将活化的多糖与活化的载体蛋白混合，多糖与载体蛋白的质量比为1:1，于4℃条件下反应过夜，获得未被PEG修饰的脑膜炎多糖结合疫苗(PS-TT)。

实施例2：制备两组PEG修饰程度不同的多糖结合疫苗

分别将1.5mg和5mg单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG5K-mal，PEG的分子量为5kDa)与2ml的PS-TT溶液混合，其中PS-TT的蛋白浓度为2mg/ml。如图1所示，修饰反应在20mM磷酸缓冲液(pH7.4)中进行，于4℃下反应过夜。其中，mPEG5K-mal与PS-TT中载体蛋白的质量比分别为0.3:1和1:1。用截留分子量为50kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的mPEG5K-mal。两组PEG修饰程度不同的多糖结合疫苗分别命名为PS-TT-PEG1和PS-TT-PEG2。PS-TT-PEG1可视为PEG适度修饰的产物，而PS-TT-PEG1为PEG过度修饰的产物。

实施例3：多糖结合疫苗的结构表征

使用Sephacryl 300凝胶过滤柱(2.6cm×60cm)对多糖结合疫苗进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。如图2所示，与载体蛋白相比，PS-TT、PS-TT-PEG1和PS-TT-PEG2的出峰时间明显提前。这表明载体蛋白与荚膜多糖结合后，分子量显著增加。由于三种多糖结合疫苗均在凝胶过滤柱的外水体积出峰，三种多糖结合疫苗的出峰时间一致。收集多糖结合疫苗对应的洗脱峰。

用¹H-NMR进行检测多糖结合疫苗。如图3所示，荚膜多糖在3.7-5.5ppm处出现了特征峰，对应于荚膜多糖的骨架。其中，5.0-5.5ppm处的特征吸收峰对应于多糖的吡喃甘露糖。2.0-2.2ppm处的特征吸收峰对应于多糖的O-乙酰基。与荚膜多糖相比，PS-TT在0.5-1.8ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪链氨基酸残基，这表明荚膜多糖通过化学方法成功地偶联了载体蛋白。与PS-TT相比，PS-TT-P1和PS-TT-P2在3.3ppm和3.5-3.7ppm处出现了特征吸收峰，对应于PEG中的CH₃O-和-CH₂CH₂O-基团。

实施例4：多糖结合疫苗免疫原性的测定

选取24只5周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15-22克。随机分为4组，即脑膜炎多糖组、PS-TT组、PS-TT-P1组和PS-TT-P2组，每组6只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖的样品，每周注射1次，共注射3次。注射后分别在第7天和第14天于尾静脉取血，第21天后断头取血。用ELISA法检测小鼠血浆中多糖特异性的IgM、IgG、IgG1和IgG2a滴度。

用ELISA方法测定多糖结合疫苗的免疫原性。如图4a所示，脑膜炎多糖组在免疫第一针后的多糖特异性抗体滴度很低，第二针和第三针也未能显著提高脑膜炎多糖组的抗体滴度。这表明脑膜炎多糖是弱的免疫原，不能诱导免疫记忆。PS-TT组在免疫第一针后的多糖特异性抗体滴度很低，但第二针和第三针能显著提高PS-TT组的抗体滴度。这表明共价结合载体蛋白能诱导多糖特异性的免疫记忆，并能增强针对多糖的免疫应答。与脑膜炎多糖组相比，PS-TT组的多糖特异性抗体滴度增加了80倍。与PS-TT组相比，PS-TT-P1组的多糖特异性抗体滴度增加了2.7倍，而PS-TT-P2组的多糖特异性抗体滴度降低了1.4倍。这表明PEG对载体蛋白的适度修饰能增强多糖结合疫苗的免疫原性，而PEG对载体蛋白的过度修饰却降低了多糖结合疫苗的免疫原性。

如图4b所示，PS-TT、PS-TT-P1和PS-TT-P2所诱导的IgG抗体主要是多糖特异性的IgG1抗体，也有少量的IgG2a抗体产生。如图4c所示，这三种多糖结合疫苗所诱导产生的多糖特异性IgM抗体水平相当。这表明PEG修饰未能显著改变多糖特异性的IgM抗体水平。如图4d所示，PS-TT-P1组诱导的载体蛋白特异性的IgG抗体滴度要低于PS-TT组，却要显著高于PS-TT-P2组。这表明PEG的适度修饰能将降低载体蛋白的免疫原性，而PEG的过度修饰会进一步降低载体蛋白的免疫原性。因此，PEG的适度修饰能通过降低载体蛋白的免疫原性，提高机体对多糖结合疫苗中多糖特异性的免疫应答。

实施例5：脑膜炎荚膜多糖特异性抗体的特异性和亲和性

向200倍稀释的PS-TT、PS-TT-P1和PS-TT-P2组小鼠血浆中加入0-15μg的游离脑膜炎多糖。用竞争ELISA法检测小鼠血浆中抗脑膜炎多糖的IgG抗体水平。如图5a所示，随着脑膜炎多糖加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到15μg时，抗体结合多糖的能力丧失。这表明小鼠产生的多糖特异性抗体能够特异性地结合脑膜炎多糖。

用硫氰酸钠法测定抗多糖的抗体亲合性。如图5b所示，脑膜炎多糖组的多糖特异性抗体亲合指数为0.92mol/L。相比之下，PS-TT、PS-TT-P1和PS-TT-P2组的抗体亲合指数分别为2.33mol/L、2.80mol/L和1.67mol/L。这表明结合载体蛋白能显著提高多糖特异性抗体的亲合性，而适度的PEG修饰能进一步提高多糖特异性抗体的亲合性。

Claims

1.一种基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，通过聚乙二醇适度修饰载体蛋白的方法制备脑膜炎多糖结合疫苗。

2.权利要求1所述的基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于脑膜炎球菌多糖为A、C、W₁₃₅群和Y群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。

3.权利要求1所述的基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所用的载体蛋白为破伤风类毒素。

4.权利要求1所述的基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，聚乙二醇是分子量为2000-40000Da的聚乙二醇马来酰亚胺。

5.权利要求1所述的基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，由以下五步组成：(1)溴化氰活化脑膜炎球菌荚膜多糖；(2)用N-2-胺乙基-马来酰亚胺衍化溴化氰活化的多糖；(3)由2-亚氨基硫烷将破伤风类毒素的氨基转化为巯基；(4)脑膜炎球菌多糖的衍生物与破伤风类毒素的衍生物进行结合；(5)用聚乙二醇修饰多糖-蛋白结合物中的破伤风类毒素。

6.权利要求1所述的基于聚乙二醇共价修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，聚乙二醇与载体蛋白的质量比为(0.5-3):10。

7.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其特征在于，所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗由根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制得。