CN104805153B - 利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于木质纤维素酶解技术领域，公开了一种利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法。该方法包括以下步骤：把待酶解木聚糖配置成酶解液，加入木聚糖质量0.5～50％的长链脂肪醇，再加入木聚糖酶进行酶解反应，得到酶解后糖类水解液。本发明方法首次提出以长链脂肪醇为酶解助剂，利用长链脂肪醇对木聚糖酶解糖化的促进作用，有效提高糖化得率，最高可提高16.6％。本发明使用的长链脂肪醇掺量低，且来源广泛，可从植物提取得到，具有可再生性的优点，且酶解过程中没有泡沫的产生，有利于安全生产，是一种安全高效的生产方法。
Description
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域，特别涉及一种利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法。
背景技术
随着经济发展和人民生活水平的提高，国内木糖醇市场不断扩大，进一步发展木糖和木糖醇，具有十分优越的条件。我国玉米芯的年产量已经超过了4000万t，对玉米芯中富含的半纤维素资源的利用越来越引起国家和企业的重视，国内相继出现了以山东禹城福田药业有限公司和浙江华康药业股份有限公司为首的木糖与木糖醇生产企业，以农村丰富廉价的的玉米芯资源为原料，采用新型成套生产工艺，生产高附加值糖醇化学品，带动了整个木糖和木糖醇产业的发展。
木糖作为一种重要的可再生生物质资源，是当下一个研究和投资热点。木糖是木聚糖的组分单体，为五碳糖，在自然界中经常以吡喃环的形式存在。而木聚糖广泛存在于玉米芯、麦草秸秆、玉米秸秆等农业废弃物中。木糖的结构特点决定了木糖具有以下功能特性及应用：1、不被消化吸收，没有能量值，是肥胖及糖尿病患者可以食用的无热量甜味剂；2、活化人体肠道内的双岐杆菌，改善人体的肠道微环境；3、木糖与食物的配伍性很好，与钙同时摄入时，可以提高人体对钙的吸收率和保留率；4、可以高效的引起美拉德反应，提色效果明显，可用于生产食品调味剂级食品行业金褐色的着色；5、医药原料和医药中间体。而且木糖还是生产木糖醇、糠醛等化学品的重要化工原料。
目前的研究热点是利用酶解技术将玉米芯等农林废弃物水解生产木糖，与酸水解法制备木糖的工艺相比，酶解法制备纤维素乙醇的工艺具有反应条件温和、反应专一性高以及绿色环保、不排放对环境有害的物质等优势。但目前该工艺面临着众多的瓶颈问题，主要包括：酶成本高、酶解效率低、酶用量大和酶利用率低。这几个方面的原因导致了酶解木糖的生产成本高，不具备经济可行性，制约酶解木糖的工业化生产。
目前已经有许多研究学者针对酶解技术中存在的酶解效率低、生产成本高等问题展开了一系列的研究，其中一种有效的工艺途径是通过在酶解过程中添加酶解助剂如非离子表面活性剂、非催化性蛋白质及生物表面活性剂等增加木质纤维素酶法糖化得率。国内外学者研究发现非离子表面活性剂、非催化性蛋白及生物表面活性剂等可以有效促进木质纤维素底物的酶解，提高木质纤维素底物的糖化得率。
在过去的30年里，大量的学者对于如何提高木质纤维酶解效率、降低生产成本等问题展开了研究。
Lou等将一种由酶解木质素和聚乙二醇通过环氧氯丙烷交联合成的水溶性的木质素聚氧乙烯醚(EHL-PEG)用于促进玉米秸秆的酶解糖化。在EHL-PEG作用下，玉米秸秆的72h酶解效率从16.7％提高到70.1％，而PEG4600为52.3％。当木质纤维素中木质素含量越高，EHL-PEG强化酶解的效果比PEG4600越显著(Bioresource Technology,2015,185:165-170.)。Seo等通过研究也发现Tween 20可以有效提高木质纤维素的糖化得率，而且在不同的纤维素酶的条件下其作用不同，作者认为Tween 20可以有效增大纤维素与纤维素酶的接触面积，从而可以提高纤维素酶的利用效率，促进木质纤维素的酶解(BioresourceTechnology,2011,102:9605-9612.)。Zhang等通过研究发现在不添加酶解助剂的情况下，木质纤维素的糖化得率低，而通过添加PEG4000则可以有效提高木质纤维素的糖化得率，作者认为PEG4000可以有效地降低纤维素酶在木质素组分上的非反应性吸附，提高纤维素酶的利用效率，从而可以降低生产成本，推动纤维素乙醇的工业化(Journal of ChemicalTechnology and Biotechnology,2011,86(1):115-120.)。Wang等通过添加牛血清蛋白质提高whatman 1号滤纸的糖化得率，其认为牛血清蛋白质可以增强纤维素酶在水解液中的酶活性，可以降低纤维素酶解过程所需要的纤维素酶载量(Applied Biochemistry andBiotechnology,2013,170,(3):541-551.)。Zhu等研究发现来自SPORL处理的松木底物的木质素磺酸盐可以有效提高松木底物的酶解糖化得率，而且通过调节pH可以有效提高木质素磺酸盐对木质纤维素酶解的促进效果，实验结果显示，在pH为5，酶载量为13FPU/g葡聚糖时，经过SPORL预处理的松木底物的酶解糖化得率可达到91％(Biotechnology forBiofuels,2013,6:9.)。Zhou等研究发现通过添加不同分子量的木质素磺酸盐可有效提高不同种类的木质纤维素的酶解糖化得率，其中对经过Kraft法预处理的松木底物的促进作用最大，其次是经过SPORL法预处理的松木底物。(Industrial&Engineering ChemistryResearch,2013,52(25):8464-8470.)
但是以上研究针对的酶解底物是纤维素，适用的生物酶是纤维素酶。对于通过助剂提高木聚糖酶解的技术还鲜有学者涉足，同时以上研究所用到的非离子表面活性剂如PEG，Tween等和牛血清蛋白质等价格昂贵，不利于降低酶解木糖的生产成本，而且PEG和Tween等酶解助剂在使用过程中容易出现起泡现象，这也不利于工业上的安全生产。
发明内容
为了克服上述现有技术的木聚糖酶解效率低、酶用量大和酶利用率低等缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，包括以下步骤：
把待酶解木聚糖配置成酶解液，加入木聚糖质量0.5～50％的长链脂肪醇，再加入木聚糖酶进行酶解反应，得到酶解后糖类水解液。
所述的待酶解木聚糖可为纯木聚糖、富含木质纤维素的农作物或农林废弃物，如玉米芯等。
当所述的待酶解木聚糖不为纯木聚糖时，优选进行预处理后再进行酶解反应，所述预处理可为将待酶解木聚糖浸泡于氢氧化钠/尿素水溶液。
所述氢氧化钠/尿素水溶液中氢氧化钠的浓度优选为4wt％，尿素的浓度优选为12wt％。
所述浸泡的时间为30～40min即可。
为了减少浸泡过程中木聚糖的损失，优选尽量降低浸泡过程中体系的温度，更优选为0℃以下进行。
上述预处理是为了破坏材料中的细胞结构，有利于酶解助剂的作用。
所述的长链脂肪醇可为正辛醇、正癸醇、正十二醇、正十四醇、正十六醇和正十八醇中的至少一种。优选为正辛醇、正癸醇和正十二醇中的至少一种。
所述酶解液中木聚糖的浓度优选为2～20wt％。
所用木聚糖酶的量为常规木聚糖酶解糖化用量即可，优选为1～10mgProtein/g(DW)木聚糖。
所述酶解反应的条件为常规酶解条件即可，优选为45～60℃下反应48～96h；更优选为50℃下反应70h。
所述酶解液使用缓冲液配置，为常规木聚糖酶适用缓冲溶液系统即可，如pH＝4.5～6.0，离子强度为25～100mmol/L的缓冲液。优选为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，更优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。
本发明的机理为：
本发明方法首次提出以长链脂肪醇为酶解助剂，利用长链脂肪醇对木聚糖酶解糖化的促进作用，有效提高糖化得率，最高可提高16.6％，且酶解过程中没有泡沫的产生，有利于安全生产，是一种安全高效的生产方法。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明以长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖的酶解，可使木聚糖的糖化得率提高8.7～16.6％。
(2)本发明使用的长链脂肪醇掺量低，且来源广泛，可从植物提取得到，具有可再生性的优点。
(3)本发明利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，酶解过程中没有泡沫产生，有利于安全生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取100质量份木聚糖(阿拉丁上海有限公司)，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正癸醇，再加入10mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶(Genencor公司提供)，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正癸醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正癸醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高16.6个百分点(由空白的60.5％提高到了77.1％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例2
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正辛醇，再加入10mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正辛醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正辛醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高15.0个百分点(由空白的60.5％提高到了75.5％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例3
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正癸醇，再加入1mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正癸醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正癸醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高10.3个百分点(由空白的48.3％提高到了58.6％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例4
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正辛醇，再加入1mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正辛醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正辛醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高8.8个百分点(由空白的48.3％提高到了57.1％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例5
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正十二醇，再加入10mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正十二醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正十二醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高15.4个百分点(由空白的60.5％提高到了75.9％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例6
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入1质量份正辛醇，再加入10mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正辛醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正辛醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高14.4个百分点(由空白的60.5％提高到了74.9％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例7
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入50质量份正十二醇，再加入1mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正十二醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正十二醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高8.7个百分点(由空白的48.3％提高到了57.0％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例8
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入1质量份正辛醇，再加入1mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加正辛醇，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加正辛醇的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高10.3个百分点(由空白的60.5％提高到了70.8％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例9：对比实施例
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份PEG4600，再加入10mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加PEG4600，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加PEG4600的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高12.1个百分点(由空白的60.5％提高到了72.6％)。反应现象及结果如表1所示。
实施例10：对比实施例
取100质量份木聚糖，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份PEG4600，再加入1mgProtein/g(DW)以木聚糖含量计的木聚糖酶，在50℃温度下振荡反应72h，以不添加PEG4600，其他组分及用量相同的酶解体系为空白对比。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，分别通过高效液相色谱测定木糖含量，结果显示添加PEG4600的酶解体系相对于空白对比的糖化得率高6.5个百分点(由空白的48.3％提高到了54.8％)。反应现象及结果如表1所示。
表1各实施例糖化得率增加量统计
| 糖化得率增加量(％) | 起泡情况 | |
| 实施例1 | 16.6 | 无泡沫 |
| 实施例2 | 15.0 | 无泡沫 |
| 实施例3 | 10.3 | 无泡沫 |
| 实施例4 | 8.8 | 无泡沫 |
| 实施例5 | 15.4 | 无泡沫 |
| 实施例6 | 14.4 | 无泡沫 |
| 实施例7 | 8.7 | 无泡沫 |
| 实施例8 | 10.3 | 无泡沫 |
| 实施例9 | 12.1 | 有泡沫 |
| 实施例10 | 6.5 | 有泡沫 |
根据表1可以看出，本发明按照一定比例将长链脂肪醇加入反应体系中可以使糖化得率增加量达到8.7～16.6个百分点。与对比实施例中的酶解助剂PEG4600对比效果更好，而且在酶解过程中不会起泡沫。所以实验证明利用长链脂肪醇为酶解助剂可以显著提高木聚糖酶解糖化得率，且生产安全。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于包括以下步骤：把待酶解木聚糖配置成酶解液，加入木聚糖质量0.5～50 %的长链脂肪醇，再加入木聚糖酶进行酶解反应，得到酶解后糖类水解液；
所述的待酶解木聚糖为纯木聚糖、富含木质纤维素的农作物或农林废弃物；
当所述的待酶解木聚糖不为纯木聚糖时，进行预处理后再进行酶解反应，所述预处理为将待酶解木聚糖浸泡于氢氧化钠/尿素水溶液；
所述的长链脂肪醇为正辛醇、正癸醇、正十二醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所述酶解液中木聚糖的浓度为2～20 wt%。
3.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所用木聚糖酶的量为1～10 mg/g木聚糖。
4.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所述酶解反应的条件为45～60℃下反应48～96 h。
5.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所述酶解反应的条件为50℃下反应70 h。
6.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所述酶解液使用缓冲液配置，所述缓冲液为pH=4.5～6.0，离子强度为25～100mmol/L的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的利用长链脂肪醇为酶解助剂促进木聚糖酶解糖化的方法，其特征在于：所述酶解液使用缓冲液配置，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
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