CN110283863A - 一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,具体的为一种稀酸结合亚氯酸钠的两段式预处理法从针叶材中制取可发酵性糖。其以高木质素含量的针叶材木质纤维原料,即针叶材为原料,先通过稀酸高温处理,然后过滤洗涤干燥,再将干燥的残渣经过亚氯酸钠处理,得到易于酶水解的底物,经过酶水解制取可发酵性糖。该法实现了针对顽固针叶材进行有效的预处理,实现了针叶材木质纤维原料的高效生物转化。
Description
技术领域
本发明属于生物乙醇领域,具体涉及一种针叶材预处理方法及其在可发酵性糖中的应用。
背景技术
随着人类社会对以石油为代表的化石资源的开采利用以及大量使用化石资源引发的全球气候和环境问题,寻找可再生的资源替代化石原料生产能源和化学品成为近年来的研究热点。生物质资源由于其储量丰富、可再生性等特点成为石油替代战略的最佳原料之一,其主要包括淀粉质原料、糖质原料和植物纤维原料,可用于生产能源、化学品。我国有丰富的林业资源,并且每年有大量的林业生产剩余物,这些废弃物目前利用率较低,大量的林业生产剩余物得不到有效的利用而被焚毁或堆埋。如果将这些林业生产剩余物等植物纤维原料中的纤维素降解成可发酵性单糖,继而通过微生物发酵将可发酵性单糖转化为乙醇、丁醇、有机酸等化工产品,将有助于我国工业向低碳、低能耗、环保性工业转型,从而实现经济的可持续发展。
天然植物纤维原料中,可利用的糖类物质主要是纤维素和半纤维素,其与木质素之间相互粘合形成致密的交联结构。大多数微生物不能够直接转化纤维素,首先需将纤维素、半纤维素降解成可发酵性单糖后方可利用。采用酶法降解植物纤维原料中的纤维素,必须经过适当的预处理方法除去原料中的部分木质素和半纤维素,以增加纤维素对酶的科技度,从而提高酶水解得率。植物纤维原料中的纤维素经过酶水解后降解成己糖,经过微生物发酵即可生成乙醇或有机酸等化工产品。
针叶材是一种在全球分布很广的木质纤维原料,其木质结构具有纤维素含量高、木质素含量高及灰分少等特点,除此之外,针叶材木质素结构单元主要是愈创木基,相比其它类型木质素更为稳定。针对针叶材植物纤维原料目前常用的有效预处理方法为硫酸预浸-蒸汽爆破法。主要是首先通过稀酸预浸原料,然后在高温高压的条件下瞬时泄压爆破,实现原料的组分分离和结构变化,增加纤维素与纤维素酶的可及度。然而由于针叶材的木质素含量高,且几乎都为稳定的愈创木基木质素,即使经过硫酸预浸及蒸汽爆破,最终获得的物料仍然会有较多的木质素残留,极大地影响和抑制了物料的酶水解效果。同时,蒸汽爆破的处理工艺涉及高压操作,存在潜在的危险,逐渐在生产上被淘汰,不再适合以后的工业发展。针对木质素含量极高的针叶类木质纤维原料,有效的预处理方式及最大限度的回收木质纤维素中的纤维素组分是一个难题。
综上所述,从生产工艺的可行性及高效生物转化的角度出发,目前针对针叶材等软木的预处理方法存在一定问题,有待于寻找一种新的安全、高效的预处理方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,以解决针对针叶材木质资源技术不足的问题,使该方法满足工业化的要求。
为解决上述问题,本发明采用的技术方案如下:
一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其具体的为一种稀酸结合亚氯酸钠两段式预处理针叶材制取可发酵性糖的方法,其包括针叶材的预处理和酶解,其中,所述的预处理包含以下步骤:
(1)稀酸预处理,将针叶材原料放入到稀酸水溶液中,其技术条件为:稀酸溶液质量百分比浓度为0.2~1%,固液比为1:3~1:10g/mL,预处理温度为130~180℃,预处理时间为30~80min,反应结束后,过滤,水洗残渣至自然pH,干燥,得到残渣;
(2)亚氯酸钠预处理,将步骤(1)所制备的残渣置于亚氯酸钠水溶液中,其技术条件为:亚氯酸钠溶液质量百分比浓度为2.5%~15%,pH为3.0~6.0,固液比为1:5~1:50g/mL,预处理温度为60~85℃,预处理时间为30~90min,反应结束后,过滤,水洗残渣至自然pH,干燥,得到底物。
步骤(1)中,稀酸溶液质量百分比浓度优选为0.4%,固液比优选为1:8g/mL,预处理温度优选为160℃,预处理时间优选为60min;
步骤(2)中,所述的亚氯酸钠预处理具有时间短、且不需要再反应过程中添加新的亚氯酸钠的有点,其中,亚氯酸钠溶液质量百分比浓度为优选为7.5%,pH优选为4.5,固液比优选为为1:20g/mL,预处理温度优选为75℃,预处理时间优选为为40min。
其中,所述的针叶材是一种具有高顽固性的木质纤维原料,其含有20~34%的木质素,其中所述的木质素中含有稳定的愈创木基木质素结构单元。其中,所述的针叶材属于软木。
其中,所述的酸为硫酸、盐酸、乙酸和柠檬酸中的任意一种或几种的组合,其中优选硫酸。其主要作用在于在稀酸预处理是提供酸性环境,以降解半纤维素,暴露出木质素。
其中,所述的酶解过程为:向步骤(2)所述的底物中加水,并加入纤维素酶进行酶解,酶解温度为45~55℃,酶解时间为48~72h,其中酶解温度优选为50℃,酶解时间优选为72h,酶解pH为4.8~6.0。
其中,控制水的加入量,使物料中绝干纤维素的浓度为3~9%g/mL;
其中,控制纤维素酶的加入量,使的纤维素酶用量为5~30FPIU/g绝干纤维素,其中纤维素酶用量优选为15FPIU/g绝干纤维素。
其中,向所述的酶解过程加入磷酸盐缓冲溶液,控制酶解体系的pH值为6.0;其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0。
其中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L。
其中,所述纤维素酶是以木霉、曲霉或细菌为原料产生纤维素酶的一种或多种酶的复合物,其能将纤维素降解成葡萄糖。
其中,所述纤维素酶优选诺维信二代纤维素酶,其滤纸酶活215.8FPIU/mL。其中一个滤纸酶活的国际单位(FPIU)等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖的酶量。
本发明的方法,提供了一种稀酸结合亚氯酸钠两段式预处理针叶材制取可发酵性糖的方法,即通过稀酸高温处理及亚氯酸钠预处理,以脱除针叶材中的木质素,经过滤水洗干燥得到底物,最后通过酶水解的工艺制备可发酵性糖。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优势:
(1)本方法操作简单,避免了针叶材等顽固植物纤维原料预处理常用的蒸汽爆破手段,具有安全和相对节能的优点;
(2)本方法采用价格低廉的稀硫酸结合温和条件下的亚氯酸钠预处理,能有效的克服了针叶木材的高顽固性,大量溶出断裂的木质素,并完全洗涤,同时最大限度的回收了木质纤维中纤维素组分,回收率高达87%以上;
(3)本方法所获得底物具有优异的酶水解能力,在较低纤维素加酶量的情况下,可以得到接近理论葡萄糖的产率,植物纤维的生物转化率可以达到最大理论值;
(4)本方法可满足工业化的要求。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中,葡萄糖浓度、木糖浓度、纤维二糖浓度及乙醇浓度均采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下:(1)色谱仪:Agillent1260高效液相色谱仪;(2)色谱柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H;(3)流动相:0.005mol/L硫酸;(4)流速:0.6mL/min;(5)柱温:55℃;(6)检测器:示差折光检测器;(7)进样量:10μL。定量方法:外标法测定。
实施例1:稀硫酸结合亚氯酸钠两段式处理水杉木屑
收集木材加工厂水杉木屑,并粉碎至20-80目,将其放入到稀硫酸水溶液中进行高温预处理,稀硫酸溶液质量百分比浓度为0.4%,固液比为1:8g/mL,在160℃下保温预处理60min。冷却后进行过滤进行固液分离,水洗残渣至自然pH,干燥。对干燥后的物料进行亚氯酸钠处理,将其放置于亚氯酸钠水溶液中,亚氯酸钠溶液质量百分比浓度为7.5%,pH为4.5,固液比1:20g/mL。物料与亚氯酸钠溶液混合均匀后,将反应液置于75℃条件下保温处预理40min。处理结束后,进行固液分离,将收集到的固体使用自来水洗涤至物料呈自来水的自然pH。将经过洗涤、干燥后的物料,进行物料组分分析,作为后续酶水解的底物。
表1两段式预处理物料组分分析
表2两段式预处理物料组分回收率
样品 | 纤维素(g) | 半纤维素(g) | 固体质量(g) |
未处理水杉木屑 | 40.9±0.9 | 14.4±0.2 | 100±0.0 |
处理后水杉木屑 | 35.6±0.7 | 9.7±0.4 | 44.6±2.3 |
回收率(%) | 87.1±0.3 | 67.4±0.1 | 44.6±1.8 |
如表1所示,水杉木屑经过稀硫酸结合亚氯酸钠两段式预处理后,所得的物料中,纤维素含量显著增加到79.78%,半纤维素含量由14.36%降低至1.21%,木质素含量由原始的36.49%下降至仅含有5.32%。表2所示,使用两段预处理,固体的得率偏低,仅为44.6%,但是纤维素的回收率达到87.1%,能回收绝大部分木屑物料中的六碳糖组分。
实施例2:水杉木屑的纤维素酶水解
分别称取绝干纤维素含量为重为0.9g、1.5g、2.1g、2.7g的实施例1的处理后水洗的水杉木屑于100mL三角烧瓶中,在每个三角烧瓶中加入0.05mol/L pH为4.8~6.0的磷酸盐缓冲液15mL、按纤维素酶用量为15FPIU/g绝干纤维素分别在每个三角烧瓶中加入诺维信二代纤维素酶(滤纸酶活215.8FPIU/mL。其中一个滤纸酶活的国际单位(FPIU)等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖的酶量),在每个三角烧瓶中加入适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为30mL,用玻棒将反应体系充分混匀后加上盖子,于150转/分、50℃的恒温摇床中酶解72h。水解结束后,分别将水解物用离心机于8000转/分条件下离心5分钟,取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度,并计算酶水解得率。其中葡萄糖酶水解得率(%)=(水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9+水解液中纤维二糖浓度g/L×0.95)0.03÷(底物绝干重量g×葡聚糖含量)×100%。式中:0.9为葡萄糖与葡聚糖的转化系数;0.95为纤维二糖与葡聚糖的转化系数;0.03为水解液体积,L。结果如表3所示。
表3不同底物浓度对酶水解的影响
由表3可知,经过两段法预处理后的水杉木屑,在底物浓度3%~7%,纤维素酶用量15FPIU/g绝干纤维素,pH 6.0条件下经纤维素酶水解48h,葡萄糖酶水解得率高于90%;在底物浓度为9%时,72h葡萄糖酶水解得率也高于90%。随着底物浓度的增加,酶水解初始速率略有下降,但是在酶水解时间72h,物料都表现出了非常高的酶水解得率。说明经过两段法预处理的水杉木屑具有较好的酶水解能力,底物浓度对其酶水解抑制作用较小。
实施例3:不同预处理方法处理水杉木屑的纤维素酶水解实验
收集木材加工厂水杉木屑,并粉碎至20-80目,分别使用稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理法及亚氯酸钠预处理法作为对照处理水杉木屑,经过处理后的木屑分别进行纤维素酶水解实验。
稀硫酸预处理法(对照1):以稀硫酸溶液质量百分比浓度2.0%为反应液进行高温处理,固液比为1:8g/mL,在160℃下保温处理60min。冷却后进行过滤进行固液分离,收集处理后的水杉木屑固体;
氢氧化钠预处理法(对照2):以质量百分比浓度2.0%的氢氧化钠溶液为反应液,固液比为1:8g/mL,在80℃下保温处理60min。冷却后进行过滤进行固液分离,收集处理后的水杉木屑固体;
亚氯酸钠预处理法(对照3):以pH4.5的质量百分比为7.5%的亚氯酸钠溶液为反应液,固液比g/mL 1:20,在75℃条件下保温处理40min。处理结束后,冷却后进行过滤进行固液分离,收集处理后的水杉木屑固体。
将经过三种不同方法处理后的木屑分别洗涤至呈自来水的自然pH,并收集用于后续纤维素酶水解实验。
分别称取纤维素绝干重为0.9g的实施例1的处理后水洗的水杉木屑及上述三种对照方法处理后的水杉木屑于100mL三角烧瓶中,在每个三角烧瓶中加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液15mL、按纤维素酶用量为15FPIU/g绝干纤维素分别在每个三角烧瓶中加入诺维信二代纤维素酶(酶活为215.8FPIU/mL),在每个三角烧瓶中加入适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为30mL,用玻棒将反应体系充分混匀后加上盖子,于150转/分、50℃的恒温摇床中酶解72h。水解结束后,分别将水解物用离心机于8000转/分条件下离心5分钟,取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度,并计算酶水解得率。其中葡萄糖酶水解得率(%)=(水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9+水解液中纤维二糖浓度g/L×0.95)0.03÷(底物绝干重量g×葡聚糖含量)×100%。式中:0.9为葡萄糖与葡聚糖的转化系数;0.95为纤维二糖与葡聚糖的转化系数;0.03为水解液体积,L。
表4不同预处理方法对水杉木屑纤维素酶水解实验的影响
由表4可知,使用目前最广泛使用的木质纤维原料预处理方法(酸处理法及碱处理法)处理水杉木屑,处理后的木屑其纤维素酶酶水解性能都较差,在72h时葡萄糖酶水解得率分别为28.1%和26.7%。使用稀硫酸结合亚氯酸钠的两段式预处理方法,处理后的水杉木屑葡萄糖酶水解得率在48h达到99.9%。结果证实了,针对高顽固性的软木类木质纤维原料,常规的预处理方法效果较差,而两段式预处理法则具有很好的预处理效果。
实施例4:稀硫酸结合亚氯酸钠预处理不同木质纤维原料
分别收集杉木、松木、杨木及桉木木屑。将四种不同木材木屑分别粉碎至20-80目,先放置于稀硫酸水溶液中,硫酸溶液质量百分比浓度为0.4%,固液比为1:8g/mL,在160℃下保温处理60min。冷却后进行过滤进行固液分离,水洗残渣至自然pH,干燥。对第干燥后的物料进行亚氯酸钠处理,将其放置于亚氯酸钠水溶液中,亚氯酸钠质量百分比浓度为7.5%,pH4.5,固液比1:20g/mL。物料与亚氯酸钠溶液混合均匀后,将反应液置于75℃条件下保温处理40min。处理结束后,进行固液分离,将收集到的固体使用自来水洗涤至物料呈自来水的自然pH。将经过洗涤后的物料,进行物料组分分析,作为后续酶水解的底物。
表5两段式预处理不同来源木材物料组分分析
表6两段式预处理不同木材物料组分回收率
纤维素回收率(%) | 半纤维素回收率(%) | 固体回收率(%) | |
杉木木屑 | 85.7±0.3 | 60.4±0.1 | 44.1±0.5 |
松木木屑 | 83.2±0.3 | 70.4±0.1 | 44.8±1.0 |
杨木木屑 | 80.4±0.3 | 77.4±0.1 | 46.2±0.4 |
桉木木屑 | 87.8±0.3 | 63.4±0.1 | 47.2±0.5 |
由表5可以看出,使用稀硫酸结合亚氯酸钠的两段式预处理法处理不同来源的包括杉木、松木、杨木及桉木等不同木材,都可以获得含有高纤维素含量的预处理物料。通过表6中的物料组分回收率的比较,证实两段式预处理对不同木材均具有很好的纤维素回收率,预处理后物料中葡聚糖回收率均大于80%。
实施例5:不同木材的纤维素酶水解实验
分别称取绝干纤维素重为0.9g的实施例4的预处理后的杉木木屑、松木、杨木木屑、桉木木屑于100mL三角烧瓶中,在每个三角烧瓶中加入pH6.0 0.05mol/L磷酸盐缓冲液15mL、按纤维素酶用量为15FPIU/g绝干纤维素分别在每个三角烧瓶中加入诺维信二代纤维素酶(酶活力215.8FPIU/mL),在每个三角烧瓶中加入适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为30mL,用玻棒将反应体系充分混匀后加上盖子,于150转/分、50℃的恒温摇床中酶解48h。水解结束后,分别将水解物用离心机于8000转/分条件下离心5分钟,取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度,并计算酶水解得率。其中葡萄糖酶水解得率(%)=(水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9+水解液中纤维二糖浓度g/L×0.95)0.03÷(底物绝干重量g×葡聚糖含量)×100%。式中:0.9为葡萄糖与葡聚糖的转化系数;0.95为纤维二糖与葡聚糖的转化系数;0.03为水解液体积,L。结果如表7所示。
表7不同来源木材两段式预处理后酶水解实验
如表7所示,使用稀硫酸结合亚氯酸钠的两段式预处理法处理不同来源的包括杉木、松木、杨木及桉木等木材木屑,并对预处理后的物料分别进行了纤维素酶酶水解实验。在以绝干纤维素含量计的底物浓度为3%条件下,以15FPU/g绝干纤维素的量加入的诺维信二代纤维素酶(酶活力215.8FPIU/mL),酶水解48h后,四种物料的酶水解得率都大于93%。预示着稀酸结合亚氯酸钠的两段式预处理法对不同木材均具有较广的适用性,可获得良好具有酶水解性能的原料。
Claims (7)
1.一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,包括针叶材的预处理和酶解,其特征在于,所述的预处理包含以下步骤:
(1)稀酸预处理,将针叶材原料放置于稀酸水溶液中,其技术条件为:稀酸溶液质量百分比为0.2~1%,固液比为1:3~1:10g/mL,预处理温度为130~180℃,预处理时间为30~80min,反应结束后,过滤,水洗残渣至自然pH,干燥,得到残渣;
(2)亚氯酸钠预处理,将步骤(1)所制备的残渣置于亚氯酸钠水溶液中,其技术条件为:亚氯酸钠溶液质量百分比为2.5~15%,pH为3.0~6.0,固液比为1:5~1:50g/mL,预处理温度为60~85℃,预处理时间为30~90min,反应结束后,过滤,水洗残渣至自然pH,干燥,得到底物。
2.根据权利要求1所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,所述的针叶材,其含有20~34%的木质素。
3.根据权利要求1所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的酸为硫酸、盐酸、乙酸和柠檬酸中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,所述酶解的过程为:向步骤(2)所述的底物中加水,并加入纤维素酶进行酶解,酶解温度为45~55℃,酶解时间为48~72h,酶解pH为4.8~6.0。
5.根据权利要求4所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,控制水的加入量,使绝干纤维素的浓度为3~9%g/mL。
6.根据权利要求4所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,控制纤维素酶的加入量,使的纤维素酶用量为5~30FPIU/g纤维素。
7.根据权利要求4所述的一种从针叶材中制备可发酵性糖的方法,其特征在于,所述纤维素酶是以木霉、曲霉或细菌为原料产生纤维素酶中的一种或多种酶的复合物。
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