CN104805058A - 一种稳定表达外源性glp-1基因的人脐带源间充质干细胞株 - Google Patents
一种稳定表达外源性glp-1基因的人脐带源间充质干细胞株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因制备与细胞培养技术领域，具体涉及一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株，包括从人脐带中分离克隆出人脐带源间充质干细胞，采用pCDNA3.1真核表达质粒为载体，将外源性GLP-1基因转入人脐带源间充质干细胞，并经过G418加压筛选培养获得。本发明的稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株，解决了目前GLP-1蛋白在治疗II型糖尿病时存在的GLP-1蛋白易被降解和其自身半衰期短，必须持续给药才能用于治疗II型糖尿病不足。
Description
技术领域：
本发明涉及基因制备与细胞培养技术领域，具体涉及一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株及其制备方法。
背景技术：
糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一种由胰岛素分泌不足和／或胰岛素作用受损引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，是目前继心脑血管疾病、癌症之后严重威胁人类健康的第三大疾病。糖尿病可分为胰岛素依赖型(IDDM，即I型)，非胰岛素依赖型(NIDDM，即II型)和妊娠糖尿病等几种类型，其中II型患者占糖尿病病例的80％以上。目前全球II型糖尿病(2Diabetes Mellitus，2DM)患者已经超过1.5亿，预计到2025年II型糖尿病患者将达到3亿。II型糖尿病不仅能引起微血管并发症，如眼部病变、周围神经病变、糖尿病肾病等；而且还能引起严重的大血管并发症，如中风、心肌梗死、下肢血管阻塞性病变等。这些并发症是导致患者致死、致残的重要因素。因此治疗糖尿病、控制糖尿病并发症的发生和发展至关重要。
目前，II型糖尿病的治疗是采用饮食控制、口服降糖药物和注射外源性胰岛素替代性治疗。但上述方法均不能理想地控制血糖水平，而且还存在一定的副作用和限制，并最终导致糖尿病患者因出现胰岛β细胞功能的严重衰退而致死或致残。
GLP-1作为人体内功能性多肽，是迄今能诱导胰岛素分泌的最强物质，其最显著的作用是促进胰岛β细胞功能再生，防止胰岛β细胞凋亡，其增加胰岛β细胞数量的作用尤为显著，对II型糖尿病的治疗显示了非常好的前景。但是，GLP-1因易被人体内的二肽基肽IV(DPP-IV)降解；且其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了GLP-1的临床应用。
脐带源间充质干细胞具有自我更新、多向分化等生物学特性，是目前公认的多种药物运输载体。因此，通过基因转导技术将GLP-1基因导入脐带源间充质干细胞内，并将脐带源间充质干细胞输注到人体内，使GLP-1蛋白在受损伤的胰岛局部分泌并发挥治疗作用。解决了GLP-1自身血浆半衰期短(不足2分钟)，难以长时间持续发挥作用的问题。
因此，制备一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞，是目前进一步提高II型糖尿病疗效亟待解决的问题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株，解决目前GLP-1蛋白在治疗II型糖尿病时存在的GLP-1蛋白易被降解和其自身半衰期短等不足。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株，从人脐带中分离克隆出人脐带源间充质干细胞，采用pCDNA3.1真核表达质粒为载体，将外源性GLP-1基因转入人脐带源间充质干细胞，并经过G418加压筛选培养获得。
一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脐带源间充质干细胞的分离和培养：取正常分娩的人脐带组织，无菌收集、分离，将脐带组织剪成1cm3的组织块，加入含有终浓度为20ng／ml的FGFb的a-MEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养，3天后，人脐带源间充质干细胞从脐带组织中爬出，待细胞达到80％融合率时，收集细胞，备用；
(2)pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的构建：根据GeneBank上提供的GLP-1序列信息选取序列中的编码基因部分，采用Overlap-PCR的方法获得GLP-1基因全长，并通过T4DNA连接酶将GLP-1基因与pcDNA3.1mychis载体相连接，并转化到DH5a大肠埃希菌中，通过克隆筛选与鉴定获得pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体；
(3)将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转导至人脐带源间充质干细胞：采用Lipofectamine2000方法，将10μl Lipofectamine2000与10μl pCDNA3.1-GLP-1质粒DNA以及200μl无血清的DMEM／F12培养基混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养20分钟，再加入到人脐带源间充质干细胞培养瓶内，培养4小时；再加入含有10％FCS的DMEM／F12培养基培养48小时，将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转入到人脐带源间充质干细胞内；
(4)筛选获得稳定表达GLP-1蛋白的人脐带源间充质干细胞株：向步骤(3)中所述的细胞培养瓶中加入含有G418的选择培养基，经过72小时的筛选培养，筛选出存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞；通过亚克隆方法将存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞接种到96孔培养板内继续培养，待含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞形成克隆后扩大培养，并经蛋白印迹方法检测证实后，确定获得稳定表达GLP-1的人脐带源间充质干细胞株。
进一步地，所述选择培养基为含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基。
进一步地，所述G418的浓度为200μg／ml。
进一步地，所述含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞的培养采用贴壁培养的方法。
所述人脐带源间充质干细胞，还可采用其它人间充质干细胞，如人骨髓间充质干细胞，人脐血中存在的血液间充质干细胞等。
本发明将GLP-1基因通过与pCDNA3.1载体相连接，并通过Lipofectamine2000辅助转导入脐带源间充质干细胞内，再经过200μg／ml的G418筛选，获得稳定表达GLP-1蛋白的人脐带源间充质干细胞株，解决了目前GLP-1蛋白在治疗II型糖尿病时存在的GLP-1蛋白易被降解和其自身半衰期短，必须持续给药才能用于治疗II型糖尿病不足。
附图说明：
图1是采用蛋白印迹方法检测本发明的表达GLP-1蛋白的图片。
具体实施方式：
以下所述仅为本发明的较佳实施例，并不因此而限定本发明的保护范围。
实施例一，见图1所示：
一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脐带源间充质干细胞的分离和培养：取正常分娩的人脐带组织，无菌收集、分离，将脐带组织剪成1cm3的组织块，加入含有终浓度为20ng／ml的FGFb的a-MEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养，3天后，人脐带源间充质干细胞从脐带组织中爬出，待细胞达到80％融合率时，收集细胞，备用；
(2)pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的构建：根据GeneBank上提供的GLP-1序列信息选取序列中的编码基因部分，采用Overlap-PCR的方法获得GLP-1基因全长，并通过T4DNA连接酶将GLP-1基因与pcDNA3.1mychis载体相连接，并转化到DH5a大肠埃希菌中，通过克隆筛选与鉴定获得pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体；
(3)将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转导至人脐带源间充质干细胞：采用Lipofectamine2000方法，将10μl Lipofectamine2000与10μl pCDNA3.1-GLP-1质粒DNA以及200μl无血清的DMEM／F12培养基混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养20分钟，再加入到人脐带源间充质干细胞培养瓶内，培养4小时；再加入含有10％FCS的DMEM／F12培养基培养48小时，将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转入到人脐带源间充质干细胞内；
(4)筛选获得稳定表达GLP-1蛋白的人脐带源间充质干细胞株：向步骤(3)中所述的细胞培养瓶中加入含有浓度为200μg／ml的G418的10％胎牛血清的DMEM／F12选择培养基，经过72小时的筛选培养，筛选出存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞；通过亚克隆方法将存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞接种到96孔培养板内采用贴壁培养的方法继续培养，待含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞形成克隆后扩大培养，并经蛋白印迹方法检测证实后，确定获得稳定表达GLP-1的人脐带源间充质干细胞株。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的基本原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
Claims (4)
1.一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株，其特征在于从人脐带中分离克隆出人脐带源间充质干细胞，采用pCDNA3.1真核表达质粒为载体，将外源性GLP-1基因转入人脐带源间充质干细胞，并经过G418加压筛选培养获得。
2.一种稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脐带源间充质干细胞的分离和培养：取正常分娩的人脐带组织，无菌收集、分离，将脐带组织剪成1cm3的组织块，加入含有终浓度为20ng／ml的FGFb的a-MEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养，3天后，人脐带源间充质干细胞从脐带组织中爬出，待细胞达到80％融合率时，收集细胞，备用；
(2)pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的构建：根据GeneBank上提供的GLP-1序列信息选取序列中的编码基因部分，采用Overlap-PCR的方法获得GLP-1基因全长，并通过T4DNA连接酶将GLP-1基因与pcDNA3.1mychis载体相连接，并转化到DH5a大肠埃希菌中，通过克隆筛选与鉴定获得pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体；
(3)将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转导至人脐带源间充质干细胞：采用Lipofectamine2000方法，将10μl Lipofectamine2000与10μl pCDNA3.1-GLP-1质粒DNA以及200μl无血清的DMEM／F12培养基混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养20分钟，再加入到人脐带源间充质干细胞培养瓶内，培养4小时；再加入含有10％FCS的DMEM／F12培养基培养48小时，将pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体转入到人脐带源间充质干细胞内；
(4)筛选获得稳定表达GLP-1蛋白的人脐带源间充质干细胞株：向步骤(3)中所述的细胞培养瓶中加入含有G418的选择培养基，经过72小时的筛选培养，筛选出存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞；通过亚克隆方法将存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞接种到96孔培养板内继续培养，待含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞形成克隆后扩大培养，并经蛋白印迹方法检测证实后，确定获得稳定表达GLP-1的人脐带源间充质干细胞株。
2、根据权利要求2所述的稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，其特征在于：所述选择培养基为含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基。
3.根据权利要求2所述的稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，其特征在于：所述G418的浓度为200μg／ml。
4.根据权利要求2所述的稳定表达外源性GLP-1基因的人脐带源间充质干细胞株的制备方法，其特征在于：所述含pCDNA3.1-GLP-1真核表达载体的人脐带源间充质干细胞的培养采用贴壁培养的方法。
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