KR101574421B1

KR101574421B1 - Pref-1/EGF/insulin의 복합 처리를 이용한 췌장베타세포 분화 방법

Info

Publication number: KR101574421B1
Application number: KR1020140043140A
Authority: KR
Inventors: 윤건호; 이마리; 김지원; 이승환; 양혜경
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2015-12-11
Also published as: KR20150117532A

Abstract

본 발명은 Pref-1/EGF/insulin의 복합 처리를 이용한 새로운 췌장베타세포 분화 방법에 관한 것으로, Pref-1/EGF/insulin의 혼합 처치 기술을 이용하여 췌장줄기세포의 증식 및 분화의 효율을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명의 췌장베타세포 분화 방법을 이용해 줄기세포들을 베타세포로 전이시킬 경우, 당뇨병의 발생과 진행의 주 병인인 베타세포 소실과 기능 부전을 개선시킬 수 있는 이식원을 개발할 수 있는 장점을 가지게 된다.

Description

Pref-1/EGF/insulin의 복합 처리를 이용한 췌장베타세포 분화 방법 {Method for differentiation into pancreatic beta-cells based on combination of Pref-1/EGF/insulin}

본 발명은 췌장베타세포 분화 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Pref-1/EGF/insulin의 복합 처리를 이용한 췌장베타세포 분화 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린 분비 장애 및 저항성에 의해 발생하는 만성질환으로 전 세계적으로 발병 정도가 꾸준히 증가하고 있으며 우리나라의 경우 이미 당뇨 환자 수가 300만명 이상으로 (2007년 통계 기준) 2025년에는 400만명에 육박할 것으로 추정되고 있다. 그러나 당뇨병은 만성 질환으로서 단기 치료로 효과를 기대하기 어려우며 현재 사용되고 있는 여러 약제만으로 이상적인 혈당 조절 상태를 장기간 유지하는 것은 불가능한 상태이다.

당뇨병 치료를 위한 방법 중 가장 좋은 것은 췌장 이식방법이 있다. 췌장 이식은 혈당 조절이 인슐린 주사제와 달리 인위적으로 진행되지 않으므로, 인슐린 주사제가 가지고 있던 환자에게 저혈당 문제를 야기시키는 안정성 문제 등을 극복한 당뇨병 치료 방법으로 주목받고 있다. 그리고 이에 상응하는 방법은 췌장에서 불필요한 외분비 소화샘 세포를 제외한 베타세포가 포함된 췌도를 이식하는 방법이 있다. 췌도를 이식하는 방법은 췌장 이식과 달리 반복적인 이식과 수술 후유증이 낮은 장점이 있다.

그러나, 췌도 이식 또한 췌장 이식과 마찬가지로 공여자의 부족은 심각한 문제가 된다. 따라서 당뇨병을 근본적으로 치유할 수 있는 새로운 치료법에 대한 연구가 진행 중이며 그 중 부족한 이식원을 대체할 수 있는 방법인 기능강화 베타세포 개발 및 줄기세포 관련 치료 기술이 중요한 연구 분야로 대두되고 있다.

다양한 조직으로부터 얻어진 줄기세포들의 베타세포 전이 분화 방법은 부족한 췌도 이식원을 극복하기 위한 중요한 기술로, 췌관세포 (pancreatic ductal cells)의 베타세포 전이 분화 방법에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 신생돼지 췌관세포 및 성체 췌관이 인슐린을 분비할 수 있는 베타세포로 전이 분화되는 것이 확인된바 있다.

Pref-1/Dlk1은 EGF (epidermal growth factor)-like motif의 세포외영역 (extracellular domain)에 존재하는 EGF-like protein 계열의 인자로, 일반적으로 태생 조직에서 광범위하게 발현되나 태생 후 혹은 성체 조직에서는 그 발현이 제한적이고, 췌장의 경우, 신생 췌장 조직과 임신 중인 쥐의 조직에서 Pref-1/Dlk1이 높게 발현됨이 알려져 있다. 또한 간 전구세포에 존재하는 Pref-1/Dlk1이 hepatoblast를 높게 증식시키는데 중요한 표지자로 알려져 있고, 손상된 근육 조직에서 Pref-1/Dlk1 발현 myotuble이 근육 세포 재생에 관여하는 등, Pref-1/Dlk1이 여러 가지 조직에서 공통적으로 증식과 재생을 조절함이 확인되었으나 아직까지 췌장에서의 역할 및 당뇨에 대한 Pref-1/Dlk1의 능력은 밝혀진 바 없다.

한편 EGF는 상피세포를 증식시키는 단백질로 상피세포에 처리하였을 때 세포핵에 작용하여 상피세포의 분열과 증식 속도를 촉진시키는 인자로 알려져 있다. 특히 세포 증식에 영향을 주는 ERK (extracellular signal-regulated kinases) 단백질을 인산화/활성화시키는 것이 조골세포 (osteoblast) 및 돼지 과립막세포 (porcine granulosa cells) 등에서 발견된 바 있으며, 베타세포 내 인슐린 분비에 영향을 미치는 survivin 단백질의 안정화에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Insulin은 IRS 및 Akt의 인산화를 촉진시켜 인슐린 분비에 영향을 주는 AS160 및 GLUT4 등의 인자를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 즉 EGF, insulin과의 혼합 처리는 Pref-1에 의한 췌장줄기세포의 증식 및 재생 효율을 더욱 증가시킬 것으로 예상된다.

이에 본 발명자들은 당뇨병의 발생과 진행의 주 병인인 베타세포 소실과 기능 부전을 개선시킬 수 있는 이식원 개발을 위해 연구하던 중, Pref-1, EGF, 및 insulin의 복합 처리를 통해 췌장줄기세포의 증식 및 분화의 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 췌관세포에서의 Pref-1/EGF/insulin의 작용 기전 원리를 이용하여, 세포의 소실이 없는 효율성 높은 췌장줄기세포 증식/분화 기술을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 췌장베타세포로의 분화 유도 방법을 제공한다:

1) 배지에서 췌장줄기세포를 배양하는 단계; 및

2) 상기 배양된 췌장줄기세포에 Preadipocyte factor-1(이하 Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 처리하는 단계.

본 발명의 다른 실시예로, 상기 Pref-1, EGF 및 인슐린의 처리는 별도로(separate), 순차적으로(sequential), 또는 동시에(simultaneous) 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 분화유도된 세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 췌장베타세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 조성물의 당뇨병 치료 용도를 제공한다.

본 발명을 통하여 당뇨 발생과 진행의 주 병인인 베타세포의 소실과 기능부전을 예방, 개선시킬 수 있는 생물학적 제제로서 Pref-1/Dlk1의 세포 내 작용기전을 규명하고 그 효과를 증명할 수 있었다. 또한 EGF 및 insulin과의 혼합 처리를 이용하여 세포의 소실 없이 증식 및 분화 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

또한 본 발명은 췌장줄기세포의 증식과 분화에 관여하는 새로운 신호전달 기전을 규명하며 시험관 내에서 베타세포로의 전이 분화 유도 효율 증가를 통한 새로운 췌도이식원 개발을 가능하게 할 수 있다.

종래 췌도쉐포로의 전이 분화를 위한 방법으로, 흔히 세포주의 형질전환을 유도하는 방법이 사용되어 왔다. 이때, 주로 바이러스를 이용하여 세포를 감염시키는 방법이 이용되었으며, 바이러스 벡터(virus vector)는 유전자가 세포의 염색체로 삽입될 뿐 아니라, 삽입된 유전자의 발현이 오랜 시간 지속되는 장점이 있어 질환 치료에 널리 사용되고 있으나, 형질전환을 위해 주입해준 바이러스의 안전성, 감염된 세포의 변이 및 바이러스 독성에 의한 세포의 소실 등의 단점을 가지고 있다.

따라서 본 발명은 바이러스를 사용하지 않은 방법으로, 바이러스 벡터를 사용했을 때의 단점을 극복할 수 있는 장점을 가진다.

도 1은 췌관세포주인 PANC1 세포주에 Pref-1, EGF 그리고 insulin의 처리 방법을 나타난 도면이다. 처리 후 해당 날짜에 세포주를 얻어 각 단계의 표지자를 확인하였다.
도 2는 췌장 줄기세포 역할을 하는 것으로 알려진 췌관세포주의 증식에 영향을 미치는 Pref-1, EGF 및 insulin의 역할을 확인하기 위하여 각 인자들을 처리한 후 세포 증식 정도를 확인한 결과이다. 각 인자의 효과를 확인하기 위한 방법으로 처리하기 하루 전 세포주를 부착 (seeding)시키고, 4시간 동안 혈청을 제한시킨 뒤 세포주를 50 ng/ml의 마우스 Pref-1 재조합 단백질 (mouse Pref-1-Fc), 20 ng/ml의 EGF, 그리고 100 nM의 insulin에 노출시켰다. 또한 단독 처리와 복합 처리 효과의 차이를 확인하기 위하여 각 인자들을 단독, 2중 그리고 3중으로 혼합 처리 하였다.
도 3은 췌도 세포 증식 및 인슐린 분비능 강화에 영향을 주는 것으로 알려진 ERK1/2, Akt 및 FOXO1의 인산화를 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독, 2중 그리고 3중으로 혼합처리한 후 각 단백질의 인산화 정도의 차이를 western blot으로 확인한 결과이다. 각 인자의 효과를 확인하기 위하여 하루 동안 배양한 세포주를 4시간 동안 혈청 제한시킨 뒤 50 ng/ml의 마우스 Pref-1 재조합 단백질 (mouse Pref-1-Fc), 20 ng/ml의 EGF, 그리고 100 nM의 insulin을 처리하였다.
도 4는 췌도 세포 강화 및 사멸에 영향을 주는 인자인 PDX1과 FOXO1 단백질의 변화를 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독 혹은 혼합 처리한 후 PDX1과 FOXO1 단백질의 전이 과정 (translocation)을 확인한 결과이다. 세포주에 Pref-1 형질 전환을 위하여 6 ug Pref-1 DNA (pSPORT6-hDlk1)/100mm dish의 비율로 Pref-1을 도입 시키고, 20 ng/ml의 EGF와 100 nM의 insulin을 단독, 혹은 복합 처리하였다.
도 5는 췌관세포주인 PANC1 세포주가 베타세포로 전이 분화되었음을 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독 혹은 혼합 처리한 후 인슐린의 mRNA 발현 여부를 확인한 결과이다. 24시간 동안 배양한 세포주에 6 ug Pref-1 DNA (pSPORT6-hDlk1)/100mm dish의 비율로 Pref-1을 도입 시키고, 20 ng/ml의 EGF와 100 nM의 insulin을 단독, 혹은 복합 처리하였다.

본 발명은 당뇨병의 발생과 진행의 주 병인인 베타세포 소실과 기능 부전을 개선시킬 수 있는 이식원 개발을 위한 방법에 관한 것으로, 췌장줄기세포의 증식 및 분화의 효율을 증가시키는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자는 췌장줄기세포로 알려진 췌관세포주 (PANC1)에서 Pref-1 처리 후 췌관세포가 베타세포로 전이 분화됨을 확인하고, EGF, insulin 인자들과의 단독, 혹은 혼합 처리를 통하여 세포의 소실 없이 간단한 처리 과정을 통해 분화 유도 효율이 증가함을 입증하는 것으로 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌관세포주 배양 방법을 제공한다. 또한 췌관세포주를 이용한 Pref-1/Dlk1 단백질 (Pref-1-Fc) 처리 및 플라스미드 DNA (pSPORT6-hDlk1) 도입 방법을 제공한다. 세포 내에서 Pref-1/Dlk1 처치 후 베타세포 증식 및 분화와 관련된 단백질들의 발현 정도를 확인할 수 있는 실험법 및 베타세포로의 분화 확인을 위한 인슐린 mRNA 발현 감지 방법을 제공한다.

즉, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 췌장베타세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것에 있다.

1) 췌장줄기세포를 배양하는 단계; 및

상기 췌장베타세포로의 분화 유도 방법은, 췌장줄기세포를 배양하고, Pref-1, EGF, insulin을 다중처리하는 것을 특징으로 한다.

상기 Pref-1의 처리 방법은 췌장줄기세포를 배양한 후, Pref-1, EGF, insulin을 단순처리하는 방법을 이용할 수 있고, 췌장줄기세포를 배양한 후 세포주가 배양용기에서 50~80%정도 성장했을 때 Pref-1 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 형질전환하는 시키는 방법이 이용될 수 있으나, Pref-1의 처리 방법은 본 발명에 기재된 방법들에 제한되는 것이 아니고, 췌장줄기세포에 Pref-1을 처리하는 방법을 모두 포함할 수 있다.

상기 EGF의 농도는 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL일 수 있고, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 40 ng/mL일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 내지 30 ng/mL일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인슐린의 농도는 50 nM 내지 150 nM일 수 있고, 바람직하게는 80 nM 내지 120 nM일 수 있으며, 보다 바람직하게는 90 nM 내지 110 nM 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일구현예로, 상기 배양은 DMEM, HEPES, bicarbonate, fetal bovine serum(FBS), 또는 항생제를 포함하는 군으로부터 하나 이상 선택되는 배양배지에서 수행될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Pref-1, EGF 및 인슐린의 처리는 별도로(separate), 순차적으로(sequential), 또는 동시에(simultaneous) 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에서 췌장줄기세포에 Pref-1, EGF, insulin을 복합처리한 결과, 세포의 사멸 없이 세포 증식이 우수하게 잘 이루어졌음을 확인하였고(실시예 1 참조), 췌장베타세포로 전이 분화되었음을 확인하였으며(실시예 3 참조), 인슐린의 mRNA가 발현되었음을 확인하였다(실시예 4 참조).

즉, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 분화유도된 세포를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 300 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/체중kg으로 투여한다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

즉, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 분화유도된 세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

아울러, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 췌장베타세포로의 분화유도용 조성물을 제공할 수 있다.

Pref-1/Dlk1은 EGF (epidermal growth factor)-like motif의 세포외영역 (extracellular domain)에 존재하는 EGF-like protein 계열의 인자이다. 신생 및 임신 중인 쥐의 췌장 조직에서 높게 발현되며, 간세포 및 근육 세포의 재생에 관여하는 등 여러 조직에서 공통적으로 증식과 재생을 조절하는 것으로 알려져 있으나 췌장 재생 및 당뇨와 연관된 Pref-1/Dlk1의 구체적인 역할은 밝혀진 바 없다.

본 발명은 Pref-1/Dlk1의 전임상 검증 및 임상실험 도입을 위하여, Pref-1/Dlk1의 ectodomain을 인간항체 IgG constant region에 융합시킨 Pref-1-Fc를 제작했다. 이를 동물세포에 transient & stable tranfection 시킨 후 Protein A column (transient transfection), 또는 몇 개의 ion-exchange column (stable transfection) chromatography를 통해 정제한다. Fc portion의 융합은 stability의 증가 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공할 수 있다.

아울러, 본 발명은 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, 이하 EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 조성물의 당뇨병 치료 용도를 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란 당뇨병이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 세포주 배양

인간 췌장 상피세포주인 PANC 1 세포주를 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입하여 사용하였다. 배양액에는 DMEM (8 mM glucose), HEPES (4700 ㎎/L), bicarbonate (3700 ㎎/L), fetal bovine serum (FBS ; 100 ㎖/L), 그리고 항생제 (Ciprofloxacin ; 20 ㎎/L ; Bayer Vital GmbH & Co. KG, Germany)를 첨가했다.

실시예 2. Pref -1, EGF , 및 insulin 복합처리

1) Pref -1 처리

① 단백질 treatment

Pref-1 과발현 조건 조성을 위하여 실시예 1을 통해 배양된 PANC-1 세포주를 배양 후 1일 째에 4시간 동안 혈청 제한을 시킨 뒤, 정상 배양액에 50ng/ml의 Pref-1-hFc를 첨가하여 배양하였다. 또한 20 ng/ml의 EGF, 그리고 100 nM의 insulin을 단독, 혹은 동시에 처리하였다.

② 시험관내 형질전환 ( in vitro transfection )

PANC-1 세포주가 배양용기에서 70% 정도 자랐을 때 형질전환을 수행하였다. Pref-1 형질 전환을 위해서는, 인간 Pref-1/Dlk1 유전자를 포함하는 플라스미드인 pSPORT6-hDlk1 (open biosystems, Huntscille, AL)를 사용하였다. Lipofectamin (Invitrogen) 및 pSPORT6-hDlk1 DNA를 각각 DMEM과 섞어 5분간 반응시킨 뒤, DNA 용액과 Lipofectamin을 섞어 실온에서 15분 동안 반응시켜 형질전환 복합물을 형성시켰다. 무혈청 배양액 (serum free medium)에 복합물을 섞어 무혈청 배양액으로 세척한 세포에 처리하였다. 세포는 5% CO2, 37℃에서 4시간 배양한 후에, 2%의 FBS가 첨가된 혈청 배양액 (complete medium)으로 대체하였다. 상기 혈청 배양액에 20 ng/ml의 EGF, 그리고 100 nM의 insulin을 단독, 혹은 동시에 처리해주었다.

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석( Western blot analysis )

100 mm dish에서 배양하여, 시기별로 얻어낸 PANC1 세포주를 RIPA 용액 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0)에서 pipetting을 이용, 세포막을 파괴하고 BSA를 표준시료로 사용하여 각각의 단백질을 Bradford 법으로 정량했다. 이를 12% SDS-PAGE에서 lane당 50 ㎍씩 전기영동하고 nitrocellulose membrane (Miilipore, Billerica, MA)에 전이시켰다. Membrane은 5% skim milk/T-TBS (0.1% Tween 20, 20 mM Tris/HCl, 137 mM NaCl, pH 7.5)으로 실온에서 1시간 동안 차단시킨 다음, p-AKT, p-ERK1/2, p-FOXO1 (희석비율 1:1000), 및 β-actin 일차 항체 용액 (희석비율 1:5000)과 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 T-TBS로 세 번 세척한 뒤 HRP-conjugated anti-rabbit 이차 항체 용액 (희석비율 1:2000)과 상온에서 40분 동안 반응시키고 TBS로 3회 세척한 후 ECL (Amersham Co., Buckinghamshire, England)을 사용하여 발색한 뒤 Medical X-Ray film Blue (AGFA, Belgium)에 노출시켰다.

도 2은 실시예 2의 ①과 같이 Pref-1 단백질 자체에 EGF, insulin을 처리한 방법을 사용할 경우의 세포증식 및 생존 능력을 확인하기 위해서 CCK8 assay를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 그 결과, Pref-1, EGF 그리고 insulin을 3중으로 혼합처리한 경우의 세포 증식정도가 가장 우수한 것을 확인하였다.

도 3은 실시예 2의 ①과 같이 Pref-1 단백질 자체에 EGF, insulin을 처리한 방법을 사용할 경우의 인산화 정도 차이를 분석한 결과로서, 췌도 세포 증식 및 인슐린 분비능 강화에 영향을 주는 것으로 알려진 ERK1/2, Akt 및 FOXO1의 인산화를 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독, 2중 그리고 3중으로 혼합처리한 후 각 단백질의 인산화 정도의 차이를 western blot으로 확인한 결과이다. 그 결과, 3중으로 혼합처리한 경우의 인산화 정도가 가장 우수한 것을 확인하였다.

도 4는 실시예 2의 ②와 같이 Pref-1으로 형질전환한 경우의 췌도 세포 강화 및 사멸에 영향을 주는 인자인 PDX1과 FOXO1 단백질의 변화를 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독 혹은 혼합 처리한 후 PDX1과 FOXO1 단백질의 전이 과정 (translocation)을 확인한 결과이다.

실시예 4. RNA 분리와 cDNA 합성

실시예 2에서 시기별로 얻어낸 세포주의 총 RNA를 Trizol 용액을 이용하여 분리하였다. 각 시기의 시료들에서 분리한 RNA 1 ㎍을 Oligo(dT)12-18 Primer, dNTP Mix (10 mM each)와 혼합하여 65℃에서 5분간 반응시킨 후, 5× strand buffer, 100 mM dithiothreitol (DTT), RNase OUTTM (40 units/㎕), 그리고 SuperScriptTM II RT(200 units; 이상 모두 Invotrogen, Carlsbad, CA)를 차례로 넣어 잘 섞은 후 42℃에서 1시간 동안 반응 시키며 역전사 효소를 불활성화 시키기 위하여 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성했다.

도 5에 췌관세포주인 PANC1 세포주가 베타세포로 전이 분화되었음을 확인하기 위하여 Pref-1, EGF 그리고 insulin을 단독 혹은 혼합 처리한 후 인슐린의 mRNA 발현 여부를 확인한 결과를 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 것과 같이, Pref-1, EGF, 및 insulin을 사용할 경우 PANC1 세포주가 베타세포로 잘 변이되었음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는 췌장베타세포로의 분화 유도 방법:
1) 배지에서 췌장줄기세포를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양된 췌장줄기세포에 Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 인슐린(insulin)을 처리하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 EGF의 농도는 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL인 것을 특징으로 하는, 췌장베타세포로의 분화 유도 방법.
제 1항에 있어서,
상기 인슐린의 농도는 50 nM 내지 150 nM의 농도인 것을 특징으로 하는, 췌장베타세포로의 분화 유도 방법.
제 1항에 있어서,
상기 Pref-1, EGF 및 인슐린의 처리는 별도로(separate), 순차적으로(sequential), 또는 동시에(simultaneous) 수행되는 것을 특징으로 하는, 췌장베타세포로의 분화 유도 방법.
삭제
Preadipocyte factor-1(Pref-1), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 인슐린(insulin)을 포함하는 췌장베타세포로의 분화유도용 조성물.