CN104800204A - 桑辛素抗肿瘤用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了桑辛素或药学上可接受的衍生物在制备抗恶性肿瘤药物中的用途。本发明还提供了桑辛素或其药学上可接受的盐在制备抗脑胶质瘤的药物中的用途。本发明研究发现，桑辛素在体外、体内都表现出了良好的抗恶性肿瘤活性(如胶质瘤)，且实验表明，桑辛素可以通过抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞和肿瘤干细胞横向分化和凋亡的良好效果，且对正常细胞毒副作用小，具有良好的应用前景。

Description

桑辛素抗肿瘤用途

技术领域

本发明涉及桑辛素的抗肿瘤新用途。

背景技术

恶性肿瘤，即癌症，是世界上第一或第二大致死性疾病，其发病率和死亡率的不断增高，严重威胁着人类健康和生命。恶性瘤肿瘤细胞呈弥漫性、侵袭性生长，外科手术切除了肿瘤病灶,术后放、化疗可缩小肿瘤体积,使病情得到明显缓解，但却不能获得长期疗效。

目前面对恶性肿瘤，多通过杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡等途径进行治疗，其中，诱导肿瘤细胞分化的药物目前还较为少见。近年来大量研究表明，所有肿瘤组织几乎都有其自己的干细胞，即肿瘤干细胞(Cancerstem cells,CSCs)，肿瘤干细胞与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、耐药、复发等生物学行为有关，它与正常干细胞相似，能够通过自我更新和分化能力产生新的CSC和各种肿瘤细胞来维持肿瘤的生存和发展。因此，若要提高对恶性肿瘤的治疗效果，研发靶向肿瘤干细胞并结合杀灭主体肿瘤细胞的治疗措施尤为重要。目前，世界各地实验室都在努力研究肿瘤干细胞的生物学特性，以期发现靶向肿瘤干细胞根治肿瘤的新措施。然而，目前对恶性肿瘤的防治措施却仍然十分有限。因此，急需发现疗效高、选择性强的抗癌剂，以期提高肿瘤防治疗效。

中草药对正常组织细胞毒性低，对肿瘤细胞具有选择性的细胞毒和凋亡诱导作用，可为研发高效低毒的抗癌剂提供新思路和新资源。桑辛素(Morusin,CASNo.：62596-29-6)为桑科植物桑根皮内的单一成分，可从桑科植物桑根皮或其他植物中提取或人工化学合成。已有研究表明桑辛素对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7)、肺癌细胞(A549)、结肠癌细胞细胞(HT-29)、宫颈癌细胞(HeLa)、肝癌细胞(Hep3B)、小鼠白血病细胞(P388)具有体外细胞毒作用，细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

目前的实验结果均为简单的体外MTT细胞毒实验研究，尚不足以证实桑辛素的抗癌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供桑辛素的抗癌新用途。

本发明提供了桑辛素或其药学上可接受的衍生物在制备抗恶性肿瘤药物中的用途。

其中，所述抗恶性肿瘤药物为细胞毒类药物或细胞诱导剂类药物。

本发明中所述恶性肿瘤细胞诱导剂类药物是指诱导恶性肿瘤细胞向着恶性程度、干性表型降低，分化更成熟、对药物敏感性增加等有利于肿瘤治疗的方向发展的药物，包括启动肿瘤细胞程序性死亡，降低肿瘤干细胞干性，诱导恶性肿瘤细胞或干细胞分化为正常细胞或横向分化为正常细胞的药物。

进一步地，所述细胞诱导剂类药物是细胞分化诱导剂类药物或细胞凋亡诱导剂类药物。

更进一步地，所述细胞分化诱导剂类药物是诱导肿瘤细胞或肿瘤干细胞分化为良性细胞或横向分化为正常细胞的药物；或者是降低肿瘤干细胞干性的药物。

更进一步地，细胞凋亡诱导剂类药物是肿瘤细胞凋亡诱导剂类药物或肿瘤干细胞凋亡诱导剂类药物。

所述凋亡，是动物细胞的程序性死亡的方式之一，它指细胞的死亡方式是自然的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。本发明所述的凋亡诱导剂即是诱导细胞启动内部的凋亡程序，引发细胞凋亡的药物。

本发明中，所述细胞诱导分化剂类药物，是指诱导恶性肿瘤细胞或肿瘤干细胞重新分化向正常方向逆转的药物，其基本特点在于诱导肿瘤细胞或肿瘤干细胞分化为良性细胞或横向分化为正常细胞。

在生物学领域中，细胞生成其他不相关组织类型的细胞，甚至是不同胚层的细胞，把这种跨系或跨胚层分化现象称为横向分化。

本发明提供的具体实施方式中表示，可以将恶性肿瘤细胞或干细胞横向分化为脂肪细胞或脂肪细胞样细胞等正常细胞。当然，在不同的癌症种类中，桑辛素或其衍生物亦可将恶性肿瘤细胞或干细胞横向分化为其他种类的正常细胞。

其中，所述恶性肿瘤为实体瘤或非实体瘤。

进一步地，所述非实体瘤为白血病；所述实体瘤为肝癌、肺癌、脑胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、喉癌或鼻咽癌等。

优选地，所述恶性肿瘤为脑胶质瘤、宫颈癌、乳腺癌或白血病。

所述白血病，为急性髓细胞白血病，如急性早幼粒细胞白血病。

其中，所述药学上可接受的衍生物为桑辛素的盐、酯、卤代物或其前体药物。

其中，所述桑辛素药学上可接受的盐为桑辛素与金属离子或酸形成的盐。其金属盐成盐形式多采用桑辛素与无机碱反应生成，如氢氧化物，所生成的盐可以是桑辛素的钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、锌盐等；桑辛素还可以与较其酸性更强的酸成盐，包括药学上常见的有机酸或无机酸，如桑辛素的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐等。

本发明所述桑辛素药学上可接受的酯是以桑辛素的羟基与其他有机酸的羧酸基团共同形成酯键后的产物。

本发明所桑辛素药学上可接受的卤代物是指通过在桑辛素的结构中，通过卤素取代C原子上的H而制备得到，目前对卤代化合物的研究表明，药物经卤代后可改善其药代动力性能，如氯代物。

本发明的一种实施方式中，还包括了同位素标记的桑辛素或其药学上可接受的盐，所述同位素标记化合物是指与桑辛素相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入桑辛素中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即2H,3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的化合物及其立体异构体，以及该化合物、立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。

本发明所桑辛素药学上可接受的前体药物，是指桑辛素经过化学结构修饰后得到的在体内经酶或非酶的转化释放出桑辛素而发挥药效的化合物。

其中，所述药物为经胃肠道吸收制剂、注射剂、植入制剂或透皮吸收剂。其中，胃肠道给药制剂是目前最为常见的用药形式，且实验操作方便，因此，本发明具体实施方式中采用灌胃给药进行桑辛素的药效试验，但这并不表示，桑辛素抗肿瘤干细胞的用药形式仅限于胃肠道给药，本领域技术人员可以根据桑辛素的物理化学性质，结合现代制剂技术和病患的实际需要，将其制备成注射剂、头皮吸收制剂、植入制剂等多种制剂，从而扩大其给药途径，并提高药物靶向性或有效避免不必要的毒副作用。

恶性胶质瘤，源自神经上皮的肿瘤统称为胶质瘤(胶质细胞瘤)，占颅脑肿瘤的40-50％，是最常见的颅内恶性肿瘤。根据病理又可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶母细胞瘤等。目前对胶质瘤的治疗以手术治疗为主，但由于肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，除早期肿瘤小且位于适当部位者外，难以作到全部切除，一般都主张综合治疗，即术后配合以放射治疗、化学治疗等，可延缓复发及延长生存期。并应争取作到早期确诊，及时治疗，以提高治疗效果。晚期不但手术困难，危险性大，并常遗有神经功能缺失。特别是恶性程度高的肿瘤，常于短期内复发。

本发明还提供了桑辛素或其药学上可接受的盐在制备抗脑胶质瘤的药物中的用途。

其中，所述抗脑胶质瘤药物为细胞毒类药物或细胞诱导剂类药物。

进一步地，所述细胞诱导剂类药物是细胞分化诱导剂类药物或细胞凋亡诱导剂类药物。

更进一步地，所述细胞分化诱导剂类药物是诱导脑胶质瘤细胞或脑胶质瘤干细胞分化为良性细胞或横向分化为正常细胞的药物；或者是降低脑胶质瘤干细胞干性的药物。

更进一步地，细胞凋亡诱导剂类药物是脑胶质瘤细胞凋亡诱导剂类药物或脑胶质瘤干细胞凋亡诱导剂类药物。

更进一步地，所述正常细胞为脂肪细胞或脂肪细胞样细胞。

本发明研究发现，桑辛素在体外、体内都表现出了良好的抗恶性肿瘤活性(如胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病等)，且实验表明，桑辛素可以通过抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞和肿瘤干细胞横向分化和凋亡的良好效果，且对正常细胞毒副作用小，具有良好的应用前景。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的其他药物联合给药。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.桑辛素对宫颈癌细胞和宫颈癌干细胞的增殖抑制作用

图2.桑辛素对恶性胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞和正常肝细胞的增殖抑制作用

图3桑辛素抑制GBM干细胞干性蛋白表达，呈剂量依赖关系。

图4.桑辛素诱导胶质瘤干细胞横向分化为脂肪细胞a,为对照；b、c、d分别为用0.5、1、2μg/mL桑辛素处理后胶质瘤干细胞横向分化为脂肪细胞

图5.桑辛素诱导人乳腺癌细胞及肿瘤干细胞横向分化为脂肪细胞a,为对照；b、c、d分别为用1μg/mL桑辛素处理后的MDA-MB-231乳腺癌细胞、MCF-7乳腺癌及乳腺癌干细胞(MCF-7M)横向分化为脂肪细胞。

图6桑辛素促进GBM干细胞成脂蛋白表达，呈剂量依赖关系。

图7.桑辛素诱导宫颈癌肿瘤干细胞凋亡，看见明显的凋亡性DNA片段。

图8.桑辛素诱导胶质瘤干细胞凋亡，看见明显的凋亡性DNA片段，对正常肝细胞无影响。

图9桑辛素促进宫颈癌干细胞凋亡蛋白表达，呈剂量依赖关系

图10.桑辛素促进GBM干细胞凋亡蛋白表达，呈剂量依赖关系

图11.桑辛素抑制人胶质瘤生长，从上到下分别为对照组、5、10和20mg/mL桑辛素处理组。

图12桑辛素体内抑制GBM干细胞干性相关蛋白表达，呈剂量依赖关系。

图13桑辛素体内促进GBM干细胞成脂蛋白表达，呈剂量依赖关系。

图14.桑辛素促进GBM干细胞成脂蛋白表达，呈剂量依赖关系。

图15桑辛素对白血病细胞的增殖抑制作用a,人正常肝细胞L02；b,人白血病细胞NB4；c,人白血病细胞HL60

图16桑辛素对白血病细胞NB4的诱导分化作用a,未处理细胞；b,0.5μg/ml桑辛素处理72h；c,1.0μg/ml桑辛素处理72h；d,2.0μg/ml桑辛素处理72h,白血病细胞分化为脂肪细胞样细胞，胞浆内可见大量脂滴，有一定剂量-效应关系。

图17桑辛素对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用a,正常乳腺上皮细胞MCF-10A；b,人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)；c,人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ER-)

图18桑辛素对人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)的诱导分化作用a,未处理细胞；b,2μg/ml桑辛素处理48h；c,4μg/ml桑辛素处理48h；6μg/ml桑辛素处理48h,乳腺癌细胞分化为脂肪细胞样细胞，胞浆内看见大量脂滴，有一定剂量-效应关系。图19桑辛素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ER-)的诱导分化作用a,未处理细胞；b,2μg/ml桑辛素处理48h；c,4μg/ml桑辛素处理48h；6μg/ml桑辛素处理48h,乳腺癌细胞分化为脂肪细胞样细胞，胞浆内看见大量脂滴，有一定剂量-效应关系。

具体实施方式

本发明具体实施方式中所使用的桑辛素购自市售商品，经测定，纯度在98％以上，结构鉴定结果与CAS No.：62596-29-6所示结构一致。

实验例1 本发明桑辛素对肿瘤增殖抑制作用

取对数生长期的贴壁肿瘤细胞及非贴壁悬浮培养肿瘤细胞(肿瘤干细胞)Hela(宫颈癌细胞)，GBM(胶质瘤细胞)及人正常肝细胞L02,消化后按2×10³个/孔接种于96孔板中，每孔100μl培养24h，分别用含有0.5、1、2、4、8、16μg/mL桑辛素的培养基200μl处理肿瘤细胞、肿瘤干细胞及人正常肝细胞，对照组不处理，每个剂量组3个复孔，放置96孔板于培养箱内培养72h或1、2、3、4、5天后，每孔加入10μl MTT，继续培养4h，再加入100μl 10％SDS/0.01N HCL，培养箱内过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定OD值，取其平均值。计算细胞存活率，细胞存活率＝处理组OD值÷对照组OD值×100％，实验重复3次。

结果：

(1)本发明桑辛素对人宫颈癌细胞及肿瘤干细胞具有增殖抑制作用，当剂量分别为8μg/mL、16μg/mL时，对宫颈癌细胞增殖的抑制率具有剂量效应关系，有显著性差异(P﹤0.05)；对宫颈癌细胞和宫颈癌干细胞的IC₅₀分别为1.97μg/mL和5.67μg/ml(图1)。

(2)桑辛素对人恶性胶质瘤细胞及肿瘤干细胞具有增殖抑制作用，当剂量为5μg/mL时，对恶性胶质瘤细胞增殖的抑制率达80％，对恶性胶质瘤干细胞增殖的抑制率达90％，具有时间-剂量-效应关系，有显著性差异(P﹤0.05)；对恶性胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞和正常肝细胞增殖抑制作用的IC₅₀分别为6.87、3.92和38.06μg/mL(图2)，结果可见，桑辛素对肿瘤细胞及肿瘤干细胞具有选择性显著抑制作用，对正常细胞影响极小。

实验例2 桑辛素对人恶性胶质瘤干细胞具有降低干性表型作用

Western blot检测桑辛素对肿瘤干细胞干性相关蛋白表达的影响,将人胶质瘤肿瘤干细胞按2×10⁶接种于用琼脂糖包被的培养皿内，培养24h后，分别用0.5、1、2μg桑辛素处理48h；收集细胞RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗CD133、nestin、Sox2、和Oct4一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

结果：

①用0.5、1、2μg/mL桑辛素处理人胶质瘤干细胞可降低GBM干细胞干性相关蛋白表达(图3)。

实验例3 桑辛素对人肿瘤细胞及肿瘤干细胞具有横向诱导分化作用

(1)Oil Red O染色检测细胞内脂滴

取对数生长期的贴壁肿瘤细胞及非贴壁悬浮培养肿瘤细胞(肿瘤干细胞)的恶性胶质瘤细胞)及GBM干细胞，人乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MCF-7)及干肿瘤(MCF-7M)消化后按2×10⁵个/孔接种于24孔板中，每孔200μl培养24h，分别用含有0.5、1、2μg/mL桑辛素的培养基500μl处理肿瘤细胞及肿瘤干细胞3天，再换含相同药物剂量的培养液培养3天。收集细胞用PBS(pH 7.6)洗3次，用100％methanol(-20℃)固定10分钟，DH₂O洗3次，Oil Red O室温染色30分钟水洗干净，Mayer’s苏木精衬染，显微镜观察细胞内红色脂滴。

结果：

①用0.5、1、2μg/mL桑辛素处理人胶质瘤干细胞可诱导肿瘤细胞横向分化为脂肪细胞(图4)。

②用0.5、1、2μg/mL桑辛素处理人乳腺癌细胞及肿瘤干细胞可诱导肿瘤细胞横向分化为脂肪细胞(图5)

(2)Western blot检测桑辛素对成脂相关蛋白表达的影响

将人胶质瘤肿瘤干细胞按2×10⁶接种于用琼脂糖包被的培养皿内，培养24h后，分别用0.5、1、2μg桑辛素处理48h；收集细胞RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗PPARγ,adipsin D,ap2(Adipocyte lipid bindingprotein),和perilipin一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

结果：

桑辛素具有促进GBM干细胞成脂蛋白表达的作用(图6)

实验例4 桑辛素对人宫颈癌肿瘤干细胞及恶性胶质瘤肿瘤干细胞具有凋亡诱导作用

(1)DNA片段化检测

将人宫颈癌肿瘤干细胞及恶性胶质瘤肿瘤干细胞按2×10⁶接种于用琼脂糖包被的培养皿内，培养24h后，分别用3、4、5μg桑辛素处理48h；收集细胞，PBS洗2次，1500rmp离心，去上清，加入细胞裂解液(1％NP40，20mM EDTA，50mM Tris-Hcl)50μl，并轻轻吹打使其充分裂解；1600g离心5min，吸取上清转移至EP管中，重新加裂解液裂解沉淀50μl，离心，收集上清，加入等体积1.0％的SDS，RNase A(终浓度5μg/μl)，56℃水浴处理2h；加入蛋白酶K(终浓度2.5μg/μl)，37℃处理至少2h，4℃，10000rmp离心10min，静置30min，吸取上清，加入1/3体积3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃静置过夜；12000rmp、4℃离心30min，75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心30min；弃去上清，空气中自然干燥10min，沉淀重悬于TE中，定量；1.5％的琼脂糖凝胶，35V电泳3h。

结果：

①桑辛素诱导宫颈癌肿瘤干细胞凋亡，看见明显的凋亡性DNA片段。(图7)

②桑辛素诱导人胶质瘤干细胞凋亡，看见明显的凋亡性DNA片段，对正常肝细胞无影响。(图8)

(2)Western blot检测桑辛素对凋亡相关蛋白表达的影响

将人宫颈癌肿瘤干细胞及恶性胶质瘤肿瘤干细胞按2×10⁶接种于用琼脂糖包被的培养皿内，培养24h后，分别用3、4、5μg桑辛素处理48h；收集细胞RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗Bcl-2、Bax、caspase-3一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

①桑辛素处理对宫颈癌干细胞凋亡相关蛋白表达的影响(图9)，结果可见，桑辛素促进宫颈癌干细胞凋亡蛋白表达，呈剂量依赖关系

②桑辛素处理对恶性胶质瘤干细胞凋亡相关蛋白表达的影响(图10)，结果可见，桑辛素促进GBM干细胞凋亡蛋白表达，呈剂量依赖关系

实验例5 桑辛素的体内抗癌活性研究

一、肿瘤抑制效果

(1)实验材料

①恶性胶质瘤干细胞，本实验室非贴壁悬浮培养富集、鉴定、保种传代。

②实验动物，BALB/C-nu/nu裸鼠小鼠32只，雄性，体重18-22g,购自成都达硕生物技术有限公司(合格证号：No 00014698)。

③试验药物，桑辛素(Morusin,CAS No.：62596-29-6)购自成都普瑞科技有限公司(纯度：≥98％,HPLC)。

(2)实验方法

①消化收获非贴壁悬浮培养富集的恶性胶质瘤干细胞，显微镜下计数。

②接种动物，将上述肿瘤细胞悬液用等量的PBS和基质胶稀释为1×10⁷/ml,每鼠接种0.1ml,相当于1.0×10⁶/鼠，右腋皮下接种，喂养观察其肿瘤生长，备用。

③实验分组32只荷瘤小鼠随机分为4组，每组8只，即对照1组，实验3组，空白对照组，每日灌胃DH₂O 0.1ml；高、中、低剂量组，每日分别灌胃桑辛素5、10、20mg/kg，共处理周，处死各组动物，称体重，解剖剥离肿瘤，称瘤重，计算肿瘤抑制率。

结果：

本发明桑辛素对人胶质瘤干细胞体内成瘤生长有明显的抑制作用用5、10、20mg/mL桑辛素处理人荷胶质瘤裸鼠、处理组动物肿瘤生长速度、肿瘤体积、肿瘤重量明显低于对照组，其抑瘤率分别为64.1％(p<0.05)、67.0％(p<0.05)和79.4％(p<0.01)，其用药量和抑瘤效果与某些化疗药物^[1]相当(图11)，而对动物体重变化及一般情况无明显影响。

二、Western blot检测桑辛素在体内对肿瘤组织干性相关蛋白表达的影响

取对照组和实验组肿瘤组织用RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗CD133、nestin、Sox2、和Oct4一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

结果：

桑辛素体内处理可下调肿瘤干细胞干性相关蛋白表达，呈剂量依赖关系。(图12)

三、Western blot检测桑辛素在体内对肿瘤组织成脂蛋白表达的影响

取对照组和实验组肿瘤组织用RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗PPARγ,adipsin D,ap2(Adipocyte lipid binding protein),和perilipin一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

结果：

桑辛素体内具有促进GBM干细胞成脂蛋白表达的作用，呈剂量依赖关系。(图13)

四、Western blot检测桑辛素体内对肿瘤组织凋亡蛋白表达的影响

取对照组和实验组肿瘤组织用RIPA裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，加抗Bcl-2、Bax、caspase-3一抗孵育，加二抗孵育(HRP标记的山羊抗兔Ig),用化学发光底物显影，用Quantity One 4.5.0软件进行图像分析：蛋白的相对表达量＝目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值；实验重复3次。

结果：

桑辛素体内具有促进GBM干细胞凋亡蛋白表达的作用，呈剂量依赖关系(图14)

实验例6 桑辛素对白血病细胞的增殖抑制作用和诱导分化作用

(1)桑辛素对人白血病细胞的增殖抑制作用

取对数生长期的急性白血病细胞NB4、HL60及人正常肝细胞L02,消化后按2×10³个/孔接种于96孔板中，每孔100μl，培养24h，分别用含有0.25、0.5、1、2、4μg/ml桑辛素的培养基200μl处理白血病细胞及人正常肝细胞，对照组不处理，每个剂量组3个复孔，放置96孔板于培养箱内培养1、2、3、4、5天后，每孔加入10μl MTT，继续培养4h，再加入100μl 10％SDS/0.01N HCL，培养箱内过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定OD值，取其平均值。计算细胞存活率，细胞存活率＝处理组OD值÷对照组OD值×100％，实验重复3次。

结果：

桑辛素对人急性白血病细胞NB4、HL60具有增殖抑制作用，当剂量为4μg/mL时，对急性白血病细胞NB4、HL60增殖的抑制率达90％，具有时间-剂量-效应关系，有显著性差异(P﹤0.05),对正常肝细胞影响极小；对白血病NB4、HL60细胞及人正常肝细胞L02的IC₅₀分别为1.18μg/ml、1.03μg/ml和44.50μg/ml(图15)。

(2)桑辛素对人白血病细胞的诱导分化作用

取对数生长期的急性白血病细胞NB4按4×10⁵个/孔接种于24孔板中，每孔200μl，培养24h，分别用含有0.5、1、2μg/ml桑辛素的培养基500μl处理肿瘤细胞3天，收集细胞用PBS(pH 7.6)洗3次，用100％methanol(-20℃)固定10分钟，DH₂O洗3次，Oil Red O室温染色30分钟水洗干净，Mayer’s苏木精衬染，显微镜观察细胞内红色脂滴。

结果：

用0.5、1、2μg/ml桑辛素处理人白血病细胞NB472h,白血病细胞分化为脂肪细胞样细胞，胞浆内可见大量脂滴，有一定剂量-效应关系。(图16)。

实验例7 桑辛素对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用和诱导分化作用

(1)桑辛素对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用

取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,消化后按2×10²个/孔接种于96孔板中，每孔100μl，培养24h，分别用含有1、2、4、6、8μg/ml桑辛素的培养基200μl处理乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，对照组不处理，每个剂量组3个复孔，放置96孔板于培养箱内培养1、2、3、4、5天后，每孔加入10μl MTT，继续培养4h，再加入100μl 10％SDS/0.01N HCL，培养箱内过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定OD值，取其平均值。计算细胞存活率，细胞存活率＝处理组OD值÷对照组OD值×100％，实验重复3次。

结果：

桑辛素对人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)具有增殖抑制作用，当剂量为8μg/mL时，对人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)增殖的抑制率约90％，具有时间-剂量-效应关系，有显著性差异(P﹤0.05),对正常乳腺上皮细胞MCF-10A影响极小；对人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A的IC₅₀分别为2.70μg/ml、3.80μg/ml和6.96μg/ml(图17)。

(2)桑辛素对人乳腺癌细胞的诱导分化作用

取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)消化后按2×10⁵个/孔接种于24孔板中，每孔200μl培养24h，分别用含有2、4、6μg/ml桑辛素的培养基500μl处理48h。收集细胞用PBS(pH 7.6)洗3次，用100％methanol(-20℃)固定10分钟，DH₂O洗3次，Oil Red O室温染色30分钟水洗干净，Mayer’s苏木精衬染，显微镜观察细胞内红色脂滴。

结果：

①用1、2、4、6μg/ml桑辛素处理人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)可诱导分化为脂肪细胞样细胞(图18)。

②用1、2、4、6μg/ml桑辛素处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ER-)可诱导分化为脂肪细胞样细胞(图19)

综上所述，本发明研究发现，桑辛素在体外、体内都表现出了良好的抗恶性肿瘤活性(如宫颈癌、胶质瘤、白血病、乳腺癌)，且实验表明，桑辛素可以通过抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞和肿瘤干细胞横向分化和凋亡的良好效果，且对正常细胞毒副作用小，具有良好的应用前景。

文献引用：

[1]栗敏等；复方阿胶浆对H22肝癌荷瘤小鼠5-FU化疗的增效减毒作用；中国实验方剂学杂志，2012；20:92.

Claims (13)

1.桑辛素或其药学上可接受的衍生物在制备抗恶性肿瘤药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗恶性肿瘤药物为细胞毒类药物或细胞诱导剂类药物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述细胞诱导剂类药物是细胞分化诱导剂类药物或细胞凋亡诱导剂类药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述细胞分化诱导剂类药物是诱导肿瘤细胞或肿瘤干细胞分化为良性细胞或横向分化为正常细胞的药物；或者是降低肿瘤干细胞干性的药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述正常细胞为脂肪细胞或脂肪细胞样细胞。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：细胞凋亡诱导剂类药物是肿瘤细胞凋亡诱导剂类药物或肿瘤干细胞凋亡诱导剂类药物。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为实体瘤或非实体瘤。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述非实体瘤为白血病；所述实体瘤为肝癌、肺癌、脑胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、喉癌或鼻咽癌。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为脑胶质瘤、宫颈癌、乳腺癌或白血病。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药学上可接受的衍生物为桑辛素的盐、酯、卤代物或其前体药物。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述桑辛素药学上可接受的盐为桑辛素与金属离子或酸形成的盐。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述金属离子为钾、钠、镁、铁或锌离子；所述酸为盐酸、硫酸、枸橼酸、苯磺酸、氢溴酸、氢氟酸、磷酸、乙酸、丙酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸或酒石酸。

13.桑辛素或其药学上可接受的盐在制备抗脑胶质瘤的药物中的用途。