CN104798986A - 一种生料半固态发酵方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生料半固态发酵方法，包括在发酵容器内加入生料半固态培养基，并搅拌均匀，无需高温灭菌，接种耐酸乳酸菌液体种子，混合为生料半固态发酵基进行发酵；所述生料半固态培养基按重量比包括如下组分：小麦粉或木薯粉40~65，鱼粉或豆粕22~45，麸皮3~12，蔬菜汁2~10，碳酸钙6~24，葡萄糖8~22，自来水100-160，乳酸菌液体种子接种量为5～12%（V/W）。发酵结束将湿物料静置，待转变为固化状态时搅散成颗粒状，干燥后得发酵制品。所得发酵制品可制备成微生态制剂、酶制剂或酸化剂等。本发明提供的发酵方法原料易得，发酵基无需灭菌，产菌数大、产乳酸高，后处理简便，能耗低、低碳环保。

Description

一种生料半固态发酵方法及其应用

技术领域

本发明属于发酵技术领域。更具体地，涉及一种生料半固态发酵方法及其应用。

背景技术

饲料添加剂如酸化剂、微生态制剂或酶制剂等分别含有乳酸、益生菌细胞或酶。而目前发酵法生产乳酸、微生态制剂或酶制剂等多采用液体发酵或固态发酵。液体发酵通常用水量大，达80%或以上，需要对发酵基进行高温高压灭菌，并且在发酵过程保持无菌状态，防止杂菌污染。发酵结束的后处理过程还要对液体产物进行固液分离、蒸发浓缩、纯化精制等处理才能获得高浓度的纯乳酸、益生菌细胞或酶制剂。这一系列过程能耗高、用水量大、产生的废水多，需要进一步处理，因此已经成为了主要的成本组成，同时对环境造成严重冲击。而固态发酵尽管用水量少（40%～55%），但也需要对发酵基进行消毒或灭菌，另外，由于水份含量低，基料中氧含量高，不利于乳酸菌等厌氧或嫌性厌氧菌的生长繁殖。其实作为饲料添加剂，由于将同其他营养物质混合，因而无需提供高纯度的乳酸或益生菌细胞，以上所述精制过程是不必要的。

因此，为解决或减缓上述问题，开发一种环境友好、耗能低，生产水平高且发酵过程及后处理简便的新发酵工艺，以适应目前低碳环保生产的趋势很有必要。

发明内容

在本发明初期阶段，发明人基于现有的乳酸菌菌株进行液体发酵得到了高产的微生态制剂原料，鉴于此，本发明人想将其应用到半固态发酵的生产，利用农副产品或食品加工废弃物作为原料，开发生料原料与半固态发酵相结合方法。该方法不仅可以处理农副产品及加工废弃物，同时还能获得高产乳酸、益生菌细胞或酶应用于工业化生产中。

但是，上述结合存在阻碍，一方面，生料原料是否能够与农副产品或食品加工废弃物进行半固态发酵的有效结合，其效果尚未知，尤其是在目前未有相关技术研究的情况下；另一方面，生料半固态发酵技术并不成熟，本领域内未有成熟的理论指导，因此，上述结合缺乏指导性。而本发明最终在合理设置原料种类及调控各组分浓度等发酵条件下，获得了高产的乳酸及其他发酵制品的新方法，并利用该终产品生产饲料酸化剂。同时，此方法还可用于饲料酶制剂或微生态制剂的生产。

本发明根据目前发酵技术的不足，提供一种生料半固态发酵方法，根据本发明提供的生料半固态发酵方法，原料易得；用水量少；发酵基无需高温高压灭菌，可直接发酵；发酵过程控制简单，无需严格无菌条件；发酵后处理简便，无需精制；细胞数量大、产酸量高，产品质量稳定。因而此方法具有能耗低、污染小以及低碳环保等特点。

本发明另一目的是提供所述生料半固态发酵方法得到的发酵制品。

本发明的再一目的是提供所述发酵制品在制备饲料级酸化剂、微生态制剂和酶制剂等产品中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种生料半固态发酵方法，包括在发酵容器内加入生料半固态培养基，并搅拌均匀，无需高温灭菌，接种耐酸乳酸菌液体种子，混合为生料半固态发酵基进行发酵；

所述生料半固态培养基按重量比包括如下组分：小麦粉或木薯粉40~65，鱼粉或豆粕22~45，麸皮3~12，蔬菜汁2~10，碳酸钙6~24，葡萄糖8~22，自来水100-160；所述的蔬菜汁为白菜汁。

所述发酵时间为3~5天，所述发酵温度为30~40℃；所述发酵基的初始pH控制在5.0~5.5；

所述耐酸乳酸菌液体种子的接种量为5~12%（V/W）；所述耐酸乳酸菌为唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌或双歧杆菌中的一种或几种。

所述生料中小麦粉和自来水先进行预处理，处理步骤为： 40~65重量份的小麦粉或木薯粉和100-160重量份的自来水，搅拌均匀，添加淀粉酶0.05份，于95℃糊化20min后，再于85℃液化40min，待液体冷却到60℃，加入糖化酶0.05份，在60℃糖化1h。待处理完毕，将其余生料成份加入上述产物内。

优选地，所述生料半固态培养基按重量比包括如下组分：小麦粉或木薯粉45~60，鱼粉或豆粕28~36，麸皮5~10，白菜汁4~8，碳酸钙10~20，葡萄糖12~20，自来水110-150。

优选地，将发酵结束后的湿物料静置，待转为固化状态时充分搅散物料，干燥后得发酵制品。

优选地，所述发酵制品中水分的含量低于10%（W/W）。

优选地，当发酵基pH值为3.5或以下，残糖（还原糖）少于3%时发酵结束。

优选地，所述耐酸乳酸菌液体种子的接种量为8~10%（V/W）。

优选地，所述发酵过程中进行搅拌，搅拌次数为2~3次/天。

利用上述方法制备得到的含发酵基质、乳酸、乳酸菌灭活细胞，以及其他代谢产物的发酵制品（简称“发酵制品”）也在本发明的保护范围之内。

本发明初期的研究目的在于资源化利用农副产品及食品加工废弃物，同时还能获得高产乳酸应用于工业化生产。而针对如何实现摸索出上述发酵方法，本发明做了大量的研究，初始利用市面上或现有的乳酸菌菌株作为出发菌，尝试与生料进行混合发酵，而在生料的选择上，由于选择较多，并且初始认为生料之间的差异并不会很明显，但经过试验后发现，不同种类的生料种类甚至种类的用量比，对发酵制备产品的性能存在较大影响，尤其是对细胞生长量以及产乳酸的量及发酵效率上差异明显。

由于生料在发酵前不经过高温高压灭菌，发酵过程中也无需控制严格无菌条件，在于乳酸菌进行混合发酵时，杂菌很容易会对发酵过程产生影响，杂菌与人工接种菌不仅竞争营养，同时影响发酵最终结果，因此，在选择的生料种类和发酵条件上会有较大的选择性，最终结果令我们意外，经过对比，根据本发明所述的发酵条件制备成的发酵制品不仅有高的细胞数目及乳酸含量，制备成的酸化剂及微生态制剂比市售的使用效果更好，同时还具有较好的工业应用前景。

通过本发明制备得到的发酵产物无需分离纯化，简单处理后即可用于生产饲料酸化剂、微生态制剂或酶制剂等发酵型产品中；利用本法制备得到发酵制品及相应饲料酸化剂进行对致病菌的抑菌性能检测，结果发现均具有抑菌效果。

通过将本发明制备得到的发酵制品再制成饲料酸化剂，进行动物养殖试验。结果发现，本发明提供的发酵制品制备的酸化剂饲喂断奶仔猪，其增重及采食量均有提高。其原因可能是本发明发酵产物还存在诸多益生菌及益生菌代谢产物或有益于肠道消化吸收的物质，并改善了饲料的适口性，从而改善其生长性能。

根据发酵制品对动物养殖的良好效果，本发明将发酵制品制备成微生态制剂中，进行饲喂后发现，本发明提供的发酵制品制备而成的微生态制剂对肉鸡的生长性能有较好的促进作用，进一步证明了发酵制品的效果。

与现有液体发酵以及固态发酵技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供的生料半固态发酵方法使用农副产品或食品加工废弃物作为原料，用水少，发酵基水份含量60%～70%左右，与液体发酵相比减少用水10～25%；与固态发酵相比，可提供稳定的缺氧生长环境，更有利于乳酸菌的生长繁殖，同时抑制好氧性杂菌的生长；接种量大，初始pH低，发酵主料无需高温高压灭菌，发酵过程也无需严格无菌条件；发酵结束后的后处理过程简单，无需将代谢产物、乳酸菌细胞等与发酵基原料分开，也无需浓缩和精制，只通过简单的高效蒸发干燥即可成为半成品或成品发酵制品。以上发酵制品可以制作成饲料酸化剂、饲料微生态制剂以及饲料酶制剂等饲料添加剂，使产品具有酸化肠道、抑制病原菌以及改善营养物质消化吸收等多重功效，可以作为抗生素的替代品用于畜禽的饲养，减少肠道疾病的发生，提高畜禽健康水平，改善生长性能。

附图说明

图1为本发明实施例2生产得到发酵制品的过程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

如无特别说明，本具体实施例中提及的“份”均以重量份数计。

乳酸纯度及含量测定参照GB/T23877—2009饲料酸化剂中乳酸的测定（高效液相色谱法）。

残糖的测定采用DNS比色法。

实施例1：乳酸菌液体种子制备

冷冻种活化：将乳酸菌冻干种取出，将其接入盛有10ml MRS液体培养基的试管中，密封，于37℃静止培养18小时。

挑单菌落：将上述活化液10倍稀释，取适当稀释度菌液0.5毫升置于灭菌的培养皿中；倒入45℃融化的、加有1.5%碳酸钙的MRS固体培养基（2%琼脂），轻摇匀，待凝固后，于37℃倒置培养（或厌氧培养）18小时。挑取培养基中或底部菌落大，有较大溶钙圈的单菌落作为制种用菌株。

菌种扩大：将以上挑取的单菌落细胞接入装有已灭菌（121℃灭菌30分钟）的80毫升液体MRS培养基的容量为100毫升的蓝盖瓶中，密封，培养18小时，作为一级种；将多个装有400毫升新鲜MRS培养基的500毫升容量蓝盖瓶，121℃灭菌30分钟，冷却后接入5%（v/v）的一级种；静止培养14小时后作为2级种，即可作为生料半固态发酵用种。所述MRS液体种子培养基为公开的资料。

合格的2级液体种子其pH为4.0以下，细胞数目为10⁹ CFU/ml或以上，革兰氏染色兰色即阳性菌，细胞形态观察正常。

实施例2：生料半固态发酵生产发酵制品

所用发酵原料全部从当地市场采购，无霉变、无结块，没有腐败变质的新鲜原料。生料发酵培养基配方1为：木薯粉54份，豆粕36份，麸皮10份，白菜汁8份，碳酸钙15份，葡萄糖20份，自来水140份。

先在发酵罐内加入54重量份的木薯粉和140重量份的自来水，搅拌均匀，然后添加淀粉酶（市售）0.05份，于95℃糊化20min后，再于85℃液化40min，待液体冷却到60℃左右，加入糖化酶（市售）0.05份，在60℃糖化1h；然后将其余生料半固态培养基直接加入发酵罐内，进行充分搅拌，按照实施例1的方法制备液体种子，实施例2中采用的乳酸菌为唾液杆菌L3，该菌株已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2013126。将培养得到的液体菌种（细胞数目为10⁹ CFU/ml）25份接种至发酵罐混合搅拌，混合后的发酵基无需灭菌。控制pH为5.0，将温度控制在30℃~40℃之间，每天搅拌2~3次，期间会产生大量气泡。当发酵中pH值为3.5或以下，残糖少于3%时发酵结束。发酵结束时，将湿物料取出置于烘盘上，此时的物料为可流动的状态，置于室内2~3h，物料将会变成固态，此时将物料搅散成颗粒状，进行烘干处理。干燥后对干物料进行粉碎，测定干物料中的乳酸含量，得到含发酵基质、乳酸、灭活的乳酸菌细胞等发酵制品（简称“发酵制品”）。

图1为按照本发明方法制备得到的发酵制品的发酵过程图。图1（1）~（8）中显示出了发酵基由半固态基转变为固态基的过程。

根据实施例2中各条件我们做了优化，其中将碳源种类作为变量，分别考察以下4种碳源对反应产酸的影响，4种碳源分别为：小麦粉、地瓜粉、木薯粉、荞麦粉。对发酵中产酸量影响如表1：

表1

碳源种类	乳酸含量(%)
		木薯粉	33.54
地瓜粉	22.62
		小麦粉	28.65
荞麦粉	21.50

同时将氮源种类作为变量，分别考察以下3种氮源对反应产酸的影响，3种氮源分别为：豆粕、绿豆粉、鱼粉。对发酵中产酸量影响如表2所示：

表2

氮源种类	乳酸含量(%)
		豆粕	33.54
绿豆粉	14.56
		鱼粉	26.78

同时将发酵基中含水量作为变量，对发酵中产酸量影响如表3所示：

表3

发酵基中含水量（%）	乳酸含量(%)
		55	21.35
60	30.54
		65	35.56
70	32.08
		75	19.65

同时将液体种子接种量作为变量，对发酵中产酸量影响如表4所示：

表4

接种量（%）	乳酸含量(%)
		5	18.22
8	33.56
		10	31.64
12	26.55

实施例3：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2基本相同，但发酵基配方2为：小麦粉54份，鱼粉36份，麸皮10份，白菜汁8份，碳酸钙15份，葡萄糖20份，自来水140份，液体菌种25份。

实施例4：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的基本相同，但发酵基配方3为：小麦粉45份，鱼粉28份，麸皮5份，白菜汁4份，碳酸钙10份，葡萄糖12份，自来水110份，液体菌种19份。

实施例5：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的基本相同，但发酵基配方4为：小麦粉60份，鱼粉36份，麸皮10份，白菜汁8份，碳酸钙20份，葡萄糖20份，自来水150份，液体菌种34份。

实施例6：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的相同，菌株采用嗜酸乳杆菌（购于中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

实施例7：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的相同，菌株采用鼠李糖乳杆菌（购于中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

实施例8：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的相同，菌株采用保加利亚乳杆菌（购于广东省微生物菌种保藏中心）。

实施例9：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的相同，菌株采用双歧杆菌（购于广东省微生物菌种保藏中心）。

实施例10：生料半固态发酵生产发酵制品

其余发酵条件与实施例2的相同，但发酵基配方5为：小麦粉54份，鱼粉36份，麸皮10份，白菜汁8份，碳酸钙15份，葡萄糖20份，自来水140份，液体菌种25份。菌株采用双歧杆菌（购于广东省微生物菌种保藏中心）。

表5为实施例2~10所制备得到的发酵制品的乳酸含量：

表5

组别	乳酸含量(%)
		实施例2	33.54
实施例3	36.88
		实施例4	31.36
实施例5	28.54
		实施例6	26.66
实施例7	28.30
		实施例8	27.01
实施例9	34.65
		实施例10	29.04

实施例3中小麦粉和鱼粉的混合发酵对最后的产酸量影响较大，而这在实施例2中并未体现，同样，实施例9和实施例2的比较发现，不同乳酸菌种类对于产酸量也产生了较大的影响。

同样地，我们基于实施例3中的液体种子接种量和发酵基中含水量进行了优化，发现其趋势同实施例2中一致，在本发明提供的范围其产酸量增加显著。

最后我们也对本发明实施例3提供的培养基经过高温高压灭菌处理和不处理的产酸量进行了比较，如表6所示。

表6

对发酵培养基的处理	乳酸含量(%)	细胞数（CFU/g）
			本发明	36.88	2.1×109
高温高压灭菌培养基	21.02	2.5×107

经过高温高压灭菌处理的结果令我们意外，通常对于液体发酵来说，培养基的高温高压灭菌对于杀灭杂菌有着决定性的作用，而本发明也尝试将发酵基进行高温高压灭菌处理，结果发现在最终发酵制品中，乳酸含量及细胞数均不及本发明生料直接发酵，多次反复试验后结果仍是本发明未经高温高压灭菌处理的产酸量和细菌数高，其中在本发明提供的发酵条件下是否产生有其他因素或物质影响发酵进程，进一步研究仍在进行。

实施例11：发酵抑菌试验

将实施例2~5和9制备得到发酵制品进行抑菌效果实验，处理方法为将发酵制品未烘干前的原液取100uL进行曲霉抑菌试验，原液稀释3倍后，取100uL进行沙门氏杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌试验，原液稀释10倍后，取100uL进行青霉抑菌试验，原液稀释100倍，取100uL进行大肠杆菌抑菌圈试验；结果如表7所示：

表7

组别	沙门氏杆菌	金黄色葡萄球菌	大肠杆菌	青霉	曲霉
						实施例2	34.30	34.00	14.75	12.82	25.92
实施例3	35.28	34.69	16.20	14.28	28.47
						实施例4	32.39	31.69	13.24	11.98	22.39
实施例5	27.24	24.32	11.28	10.96	19.98
						实施例9	34.54	34.25	15.52	13.65	26.84

养殖试验：

酸化剂养殖试验：先根据实施例3制备得到的发酵制品控制水分在8%（W/W），按照常用的酸化剂配方添加柠檬酸和富马酸，使酸化剂中的乳酸含量22%、柠檬酸28%以及富马酸10%，得复合酸化剂饲料。

普通酸化剂按照乳酸（市售）含量22%、柠檬酸28%以及富马酸10%混合制成，其余制备条件与实施例2制备成酸化剂条件一致。

选用28日龄断奶仔猪（杜×长×大三元杂）120头作为试验动物，公母各半；共分为三组：对照组饲喂基础日粮，没有添加酸化剂；第1组饲喂每吨添加3kg本发明实施例2制备的复合酸化剂饲料；第2组饲喂相同添加量的普通酸化剂的饲料。试验为期28天。试验结果表明：1、2组仔猪的平均增重分别比对照组提高25.22%、18.23%，差异极显著（P<0.01）。日采食量比对照组分别提高了19.36%、11.86%，差异显著（P<0.05），从断奶仔猪的腹泻率观察上看，本发明提供的复合酸化剂饲料较普通酸化剂效果更好。

微生态制剂养殖试验：

选择120只体重为50+5g的健康白羽雏鸡，随机均分成3组，按照对照组、普通组和微生态制剂组进行饲喂。对照组饲喂基础日粮，不添加微生态制剂，普通组（市售）采用通用的微生态制剂配方（主要含有植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌），微生态制剂组采用实施例2制备得到的发酵制品控制水分在8%（W/W），然后与枯草芽孢杆菌菌粉进行混合，其余配方与普通组类似，普通组和微生态制剂组中的混合菌体菌数基本一致，并按照普通日粮质量的0.005~0.01%进行饲喂肉鸡。

白羽雏鸡在出栏时3组配方进行饲喂的出栏均重和料肉比进行对比，在出栏时，微生态制剂组出栏均重为2.68，比普通组高出0.19kg，显著高于对照组（P＜0.05），而料肉比对照组为1.84，微生态制剂组仅为1.73，显著低于对照组（P＜0.05），跟普通组进行比较，出栏均重高出0.11kg，料肉比低0.08，说明使用本发明的微生态制剂不仅能够降低料肉比，而且对增重有明显的提高的作用，综合前期断仔乳猪饲喂效果，本发明提供的发酵制品对改善禽畜肠道吸收及抑制病原菌上起到较好的功效，能够提高禽畜健康水平，显著改善生长性能。

生料半固态发酵中试放大试验

按照实施例3的配方进行中试放大试验：中试发酵基配方量：小麦粉32.4kg、鱼粉21.6kg、葡萄糖12kg、麸皮6kg、碳酸钙9kg、白菜汁4.8kg、接种量15L、水84L，其余发酵条件同实施例2。

发酵结束湿物料活菌数1.7×10⁹ CFU/g，发酵制品烘干后水分含量9.70%，乳酸含量36.72%。中试获得了很好的效果，表明了本发明提供的发酵方法生产乳酸及相应发酵制品的工业化大生产是可行的。

Claims (10)

1.一种生料半固态发酵方法，其特征在于，包括在发酵容器内加入生料半固态培养基，并搅拌均匀，无需高温灭菌，接种耐酸乳酸菌液体种子，混合为生料半固态发酵基进行发酵；

所述生料半固态培养基按重量比包括如下组分：小麦粉或木薯粉40~65，鱼粉或豆粕22~45，麸皮3~12，蔬菜汁2~10，碳酸钙6~24，葡萄糖8~22，自来水100-160；

所述发酵时间为3~5天，所述发酵温度为30~40℃；所述发酵基的初始pH为5.0~5.5；

所述耐酸乳酸菌液体种子的接种量为5～12%（V/W）；所述耐酸乳酸菌为唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌或双歧杆菌中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，所述生料半固态培养基按重量比包括如下组分：小麦粉或木薯粉45~60，鱼粉或豆粕28~36，麸皮5~10，白菜汁4~8，碳酸钙10~20，葡萄糖12~20，自来水110-150。

3.根据权利要求1所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，将发酵结束后的湿物料静置，待转为固化状态时充分搅散物料，干燥后得发酵制品。

4.根据权利要求3所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，所述发酵制品中水分的含量低于10%（W/W）。

5.根据权利要求1所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，当发酵基pH值为3.5或以下，残糖（还原糖）少于3%时发酵结束。

6.根据权利要求1所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，所述耐酸乳酸菌液体种子的接种量为8～10%（V/W）。

7.根据权利要求1所述的生料半固态发酵方法，其特征在于，所述发酵过程中进行搅拌，搅拌次数为2~3次/天。

8.一种权利要求1至7任一项所述的方法制备得到的发酵制品。

9.一种权利要求8所述的发酵制品在制备饲料级酸化剂的应用。

10.一种权利要求8所述的发酵制品在制备饲料级微生态制剂和酶制剂类产品中的应用。