CN104784680A - λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物中的应用，属于抗病毒药物领域。本发明发现λ干扰素能诱导多种抗病毒因子产生，其在体外和体内均能抑制汉滩病毒感染，且无毒副作用，λ干扰素在体外能保护细胞免受汉滩病毒的感染，在体内能提高汉滩病毒感染动物的生存率及延长平均生存天数，减轻组织病理损害，降低病毒核酸水平。上述发现表明λ干扰素可用于制备抗汉滩病毒的药物，也可用于制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物。

Description

λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及新型干扰素―λ干扰素(interferon lambda，IFN-λ)在制备抗汉滩病毒药物中的应用。

背景技术

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes，HFRS)临床主要特征表现为发热、出血以及肾损害，我国是受HFRS危害最为严重的国家，HFRS患者占世界的90％以上，其病原体主要是汉滩病毒(hantaan virus，HTNV)，人可通过气溶胶吸入、伤口、消化道等途径感染病毒。长久以来，人们一直致力于对抗体和细胞毒性T细胞的研究，希望开发出疫苗遏制HTNV的感染，但未见显著突破。目前临床对HFRS治疗仍是对症治疗为主，并结合抗病毒治疗。而抗病毒药物主要是利巴韦林，有两种治疗方案：(1)大剂量疗法，该法可将病死率降至2％以下，用药5天可清除患者体内的病毒，但患者有可逆性骨髓抑制，红细胞减少；(2)小剂量疗法，该方案可改善症状，降低病死率，无不良反应，但患者体内病毒是否清除尚未证实。因此，抗病毒药物研究具有重要的实际意义，寻找一种高效、安全、副作用少的抗病毒药物的研究势在必行。

干扰素(interferon，IFN)是脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质，主要包括双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKR)、2′-5′寡腺苷酸合成酶(OAS)和黏病毒抵抗蛋白A GTP酶(MxA)等，可影响细胞的运动和免疫过程，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可将干扰素分为Ⅰ型(IFN-α/β)和Ⅱ型(IFN-γ)。α干扰素已临床用于治疗HFRS，但治疗剂量报道不一，从早年应用白细胞干扰素20万单位/天到近年应用重组基因工程干扰素300万单位/天，总疗程3-7天不等。也有报道比较了干扰素联合利巴韦林与单用利巴韦林的疗效，认为联合治疗组干扰素对HFRS早期患者虽然能缩短充血与渗血症状和肾区叩击痛，越期率高，但并不能减少并发症、降低病死率，相反由于干扰素的毒副作用，联合治疗组患者的平均退热时间长，头痛、肾痛症状消失慢，血小板计数恢复正常慢，故联合使用干扰素和利巴韦林治疗HFRS的利弊仍需进一步实验研究。最近干扰素家族增添一位新成员：Ⅲ型干扰素即IFN-λ，已发现其与其他型干扰素一样具有抗病毒作用，如：乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等，而且IFN-λ抗HCV研究已进入Ⅱ期临床阶段，但IFN-λ抗HTNV作用经科技查新还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物以及λ干扰素在制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

1、IFN-λ对HTNV感染靶细胞－A549细胞的毒性：A549细胞加入不同浓度(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)的IFN-λ1、IFN-λ2，培养72h，通过MTT法检测IFN-λ1、IFN-λ2的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的IFN-λ1、IFN-λ2进行随后的抗HTNV作用研究。

2、IFN-λ抗HTNV活性的测定：

(1)IFN-λ抗HTNV在A549细胞中的感染作用效果：

1)IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)预处理A549细胞24h，HTNV 76-118株感染2h后用PBS洗三次，再加入含2％胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；分别于感染第1天、第4天、第7天和第10天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNVS基因的表达，来判断IFN-λ抗HTNV作用的时间效果。

2)不同浓度IFN-λ1、IFN-λ2(浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)预处理A549细胞24h，HTNV 76-118株感染2h后用PBS洗三次，再加入含2％胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；于感染第7天收集相应细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，来判断IFN-λ抗HTNV作用的剂量效果。

(2)IFN-λ处理A549后诱导产生的抗病毒因子：IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)处理A549细胞3h、6h、12h、24h，应用实时定量RT-PCR检测抗病毒因子OAS-1、ISG-56、MxA和MxB的表达，用以判断IFN-λ1、IFN-λ2预处理A549细胞以后可能发挥作用的细胞因子。

(4)用过表达MxB的慢病毒载体，包装成慢病毒后，感染A549细胞，用嘌呤霉素筛选出稳定细胞系A549-Ctrl(对照组)、A549-MxB(MxB过表达组)。HTNV 76-118株感染稳定细胞系2h，后用PBS洗三次，再加入含2％胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；分别于感染第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，判断抗病毒作用。

(5)用沉默MxB的shRNA的慢病毒质粒，包装成慢病毒后，感染A549细胞，用潮霉素B筛选出稳定细胞系A549-shCtrl(对照组)、A549-shMxB-1(MxB沉默组之一)、A549-shMxB-2(MxB沉默组之二)。IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)预处理稳定细胞系24h，HTNV 76-118株感染2h，后用PBS洗三次，再加入含2％胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；分别于感染第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，判断抗病毒作用。

(6)IFN-λ2对HTNV感染BALB/c乳鼠具有治疗作用。IFN-λ1、IFN-λ2均为水溶性药物且两者间氨基酸同源性达81％，因此动物实验只选取了IFN-λ2进行抗病毒实验。HTNV感染后24h给药，随着药物剂量的增加，感染乳鼠死亡率显著降低，平均生存时间明显延长。

(7)IFN-λ2在乳鼠体内能抑制HTNV复制。感染后24h给药，能显著减轻感染组织(肾、脑)病理改变，降低HTNV核酸表达水平。

通过上述研究，本发明发现λ干扰素能诱导多种抗病毒因子产生，其在体外和体内均能抑制汉滩病毒感染，且无毒副作用。λ干扰素在体外能保护细胞免受汉滩病毒的感染，在体内能提高汉滩病毒感染动物的生存率及延长平均生存天数，减轻组织病理损害，降低病毒核酸水平。基于此，λ干扰素可用于制备抗汉滩病毒的药物，同时也可用于制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物。

本发明与现有抗病毒干扰素相比，具有以下优点和效果：

1、抗病毒作用时间快，HTNV感染后第7天，IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)抑制病毒复制和感染的效果最佳；随着药物浓度的增加(从1ng/mL到1000ng/mL)，IFN-λ抑制病毒复制作用相应增加。

2、IFN-λ抗HTNV病毒作用具有多种途径，可诱导多种抗病毒因子的产生尤其是MxB蛋白对HTNV感染的A549细胞有明显抑制作用，表明IFN-λ可用于HTNV感染的治疗。

3、在体内IFN-λ对HTNV感染具有明显的治疗作用，且无明显毒副作用。

附图说明

图1是MTT法检测IFN-λ1、IFN-λ2的细胞毒性结果图。

图2是RT-PCR检测HTNV感染IFN-λ预处理的A549细胞后不同时间点的HTNV S基因的表达结果图，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

图3是RT-PCR检测HTNV感染不同浓度IFN-λ预处理的A549细胞后的HTNV S基因的表达结果图，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

图4是RT-PCR检测IFN-λ预处理的A549细胞后的抗病毒因子OAS-1、ISG-56、MxA和MxB的表达结果图，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

图5是RT-PCR检测HTNV感染MxB过表达A549细胞后的HTNV S基因的表达结果图，MxB过表达组(A549-MxB)与对照组(A549-Ctrl)比较，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

图6是RT-PCR检测HTNV感染MxB被沉默表达的A549细胞后HTNV S基因的表达结果图，MxB沉默组(shMxB-1、shMxB-2)与对照组(shCtrl)比较，**表示P<0.01。

图7是不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV 28天的存活率结果图。

图8是不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV 14天后脑、肾组织的病理切片。

图9是RT-PCR检测不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV后脑、肾组织HTNV S基因的表达结果图，*表示p<0.05vs安慰剂对照组(Pla)、**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

IFN-λ1、IFN-λ2均为含178个氨基酸、分子量19.8kDa的蛋白质，其制备参见文献(KotenkoSV,Gallagher G,Baurin VV,et al.Nat Immunol,2003,4(1):69-77)，且其已商品化，下述实施例中所用IFN-λ1、IFN-λ2购于PeproTech公司，SDS-PAGE和HPLC分析其纯度达98％以上。

实施例1MTT法检测IFN-λ1/λ2的细胞毒性作用

DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔100μL接种于96孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM(含2％胎牛血清，V/V)稀释的不同浓度(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)的IFN-λ1、IFN-λ2，培养72h，通过MTT法检测IFN-λ1、IFN-λ2的细胞毒性作用，结果显示，IFN-λ1、IFN-λ2浓度从1ng/mL到1000ng/mL对A549细胞毒性均小于10％，统计分析无显著差异，因此可认为IFN-λ1、IFN-λ2对A549细胞无毒性(图1)。

实施例2IFN-λ体外抗HTNV感染具有时间效应和剂量效应

(1)IFN-λ体外抗HTNV感染具有时间效应

DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400μL接种于24孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM(含2％胎牛血清，V/V)稀释的IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)预处理A549细胞24h，HTNV 76-118株感染2h(MOI＝5)，后用PBS洗三次，再加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；分别于感染第1天、第4天、第7天和第10天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，GAPDH为内参，未加IFN-λ处理的作为对照组。引物如下：

HTNV S基因上游引物：5’-GCATCATCGTCTATCTTACATC-3’，

HTNV S基因下游引物：5’-ATTGTTCGATACGATCACTCC-3’；

GAPDH上游引物：5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，

GAPDH下游引物：5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’。

具体过程为：取1μL样品总RNA用RT system(Promega)进行逆转录，实验采用随机引物37℃反应1h，然后94℃5min终止反应，产物4℃保存。逆转录产物cDNA作为实时定量RT-PCR的反应模板，取1.5μL RNA逆转录产物cDNA、0.3μL上下游引物(20pmol)、7.5μL SYBR green混合液，补水至总体积15μL，在实时定量PCR仪(BioRad)上进行检测。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。结果显示，感染后第7天IFN-λ抑制HTNV感染效果仍旧明显(图2，P＜0.001)。说明IFN-λ抑制HTNV在A549细胞中的复制和感染并呈现有时间关系。

(2)IFN-λ体外抗HTNV感染具有剂量效应

按照(1)中方法加入不同浓度的IFN-λ1、IFN-λ2(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)预处理A549细胞，HTNV 76-118株感染A549细胞后第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达。结果显示，1ng/mL即可明显抑制HTNV的复制和感染(图3，P＜0.01)。说明IFN-λ能抑制HTNV在A549细胞中的复制和感染，呈现有剂量效应。

实施例3IFN-λ诱导产生的抗病毒因子

DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400μL接种于24孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM(含2％胎牛血清，V/V)稀释的IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)预处理A549细胞，分别于处理后3h、6h、12h和24h收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测抗病毒因子OAS-1、ISG-56、MxA和MxB的表达，GAPDH为内参，未加干扰素处理的作为对照组。引物如下：

OAS-1上游引物：5’-AGAAGGCAGCTCACGAAACC-3’，

OAS-1下游引物：5’-CCACCACCCAAGTTTCCTGTA-3’；

ISG-56上游引物：5’-GCTGAAGTGTGGAGGAAAGA-3’，

ISG-56下游引物：5’-AGCAAAGAAAATGGCTTGTG-3’；

MxA上游引物：5’-ACCTACAGCTGGCTCCTGAA-3’，

MxA下游引物：5’-GCACTCAAGTCGTCAGTCCA-3’；

MxB上游引物：5’-AGCAGTATCGAGGCAAGGAGC-3’，

MxB下游引物：5’-TGGCGAGACGTTTGCTGGTTTC-3’。

GAPDH上下游引物同实施例2。

RT-PCR具体过程同实施例2。结果显示，IFN-λ1、IFN-λ2预处理A549细胞以后，可诱导多种抗病毒因子的表达，而其中MxB的表达最明显(图4，P＜0.01)。

实施例4人MxB蛋白抑制HTNV复制

人类MxB(NM_002463.1)过表达慢病毒质粒及对照载体购于Fitgene公司。在293T细胞包装成慢病毒后，用lipo2000(Invitrogen)转染至A549细胞，用嘌呤霉素(2μg/mL)筛选5～7次后获得稳定细胞系A549-Ctrl和A549-MxB(A549-Ctrl为转入对照载体的对照组，A549-MxB为转入MxB过表达慢病毒质粒的MxB过表达组)。DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的稳定细胞系A549-Ctrl和A549-MxB用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400μL接种于24孔板。细胞长成单层后，HTNV 76-118株分别感染稳定细胞系A549-Ctrl和A549-MxB 2h(MOI＝5)，PBS洗三次，再加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；感染后第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，GAPDH为内参。所用引物及RT-PCR具体过程同实施例2，结果如图5所示，人MxB蛋白能抑制HTNV在A549细胞中的复制和感染。

实施例5沉默MxB表达后IFN-λ对HTNV 76-118复制的影响

参照文献(Goujon C,MoncorgéO,Bauby H,Doyle T,Ward CC,Schaller T,HuéS,BarclayWS,Schulz R,Malim MH.Human MX2is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1infection.Nature,2013；502(7472):559-62.)构建稳定细胞系A549-shCtrl、A549-shMxB-1和A549-shMxB-2(A549-shCtrl为对照组，插入其中的是一个无序的shRNA序列，A549-shMxB-1和A549-shMxB-2均为MxB沉默组，分别插入不同的沉默MxB的shRNA序列)。DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的稳定细胞系A549-shCtrl、A549-shMxB-1和A549-shMxB-2用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400μL接种于24孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM(含2％胎牛血清，V/V)稀释的IFN-λ1、IFN-λ2(100ng/mL)分别处理稳定细胞系A549-shCtrl、A549-shMxB-1和A549-shMxB-2细胞24h，感染HTNV 76-118株2h(MOI＝5)，PBS洗三次，再加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)培养基，37℃5％CO₂(V/V)培养；分别在感染后第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，GAPDH为内参。所用引物及RT-PCR具体过程同实施例2，结果如图6所示，MxB被干扰后，HTNV的复制明显增加，说明IFN-λ诱导产生的MxB蛋白能显著抑制HTNV在A549细胞中的复制与感染。

上述所有实施例试验均重复三次以上。

实施例6IFN-λ2对乳鼠的毒性作用

首先进行最大给药量试验，即采用最大给药量法进行药物的急性毒性试验。指在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24h内多次给药，观察14天，记录动物出现的反应。观察期内如动物不出现死亡或中毒症状，则认为该药对某种动物某种给药途径的最大给药量为某一数值。

IFN-λ2经背部皮肤皮下给药。IFN-λ2药物溶液(溶于生理盐水)组，各组剂量分别为1.25、2.5、5、10、20mg/kg(即每kg乳鼠体重分别注射1.25、2.5、5、10、20mg IFN-λ2)，对照组为生理盐水。取60只1日龄BALB/c乳鼠，将乳鼠随机分为6小组，每小组10只，IFN-λ2药物溶液组分别按上述6个剂量以0.01mL/g(即每g乳鼠体重注射溶有IFN-λ2的生理盐水0.01mL)一次性皮下注射。结果如下表所示，经计算IFN-λ2对1日龄BALB/c乳鼠的半数致死率(LD₅₀)为4.65mg/kg。

剂量(mg/kg)	动物总数	死亡数
			1.25	10	1
2.50	10	3
			5.00	10	6
10.00	10	7
			20.00	10	9

实施例7乳鼠体内IFN-λ2抗HTNV作用

随机将1日龄BALB/c乳鼠分成5组，即正常对照组、安慰剂对照组(Pla，即病毒感染阳性对照组)、高剂量组(HD，2mg/kg)、中剂量组(MD，0.2mg/kg)、低剂量组(LD，0.02mg/kg)，每组20只饲养于独立通气笼盒(individual ventilated cages，IVC)系统中。正常对照组：颅内注射20μL含2％胎牛血清的MEM培养基+每天注射20μL生理盐水；安慰剂对照组：颅内接种20μL 1×10³PFU的HTNV 76-118病毒液+每天注射20μL生理盐水；高剂量组：颅内接种20μL1×10³PFU的HTNV 76-118病毒液+每天注射20μL的2mg/kg的IFN-λ2；中剂量组：颅内接种20μL1×10³PFU的HTNV 76-118病毒液+每天注射20μL的0.2mg/kg的IFN-λ2；低剂量组：颅内接种20μL1×10³PFU的HTNV 76-118病毒液+每天注射20μL的0.02mg/kg的IFN-λ2。注射药物起始时间为病毒接种后24h，连续注射7天。各组乳鼠每日称重，28天内连续观察乳鼠症状、体征的变化及记录死亡率。在接种病毒第14天以及第28天分别脱颈处死各组乳鼠，并将乳鼠浸泡在酒精中5min，然后收集脑、肾。各组样本的1/2部分经4％多聚甲醛固定，作为病理切片标本；1/2部分贮存于液氮中，以备提取总RNA。

实验结果为：

1)症状和体征

在接种HTNV76-118毒株后24h给药组中：LD组与安慰剂对照组间比较在症状和体征的出现时间及程度上均无差异；MD组和HD组动物出现症状和体征的时间较安慰剂对照组晚，且轻微。正常对照组无任何症状和体征出现。

2)体重

在接种HTNV 76-118毒株后24h给药组中：MD组和HD组乳鼠开始出现体重减轻的时间比安慰剂对照组延后，且HD组存活鼠发病后10天左右症状逐渐消失，体重于感染病毒后第22d恢复正常并逐渐增加。

3)IFN-λ2对HTNV感染乳鼠存活时间的影响

结果见图7，在接种HTNV 76-118毒株后24h给药组中：LD组平均生存天数(11.6±2.82)与安慰剂对照组(11.35±2.48)比较，无统计学差异(P>0.05)；MD组和HD组开始出现死亡的时间比安慰剂对照组延后，且平均生存天数延长，平均生存天数分别为为16.95±5.59和20.6±5.66，均与安慰剂对照组比较，显示统计学差异(P<0.05)，表明注射IFN-λ2可明显提高乳鼠的生存率及平均天数。

4)IFN-λ2对感染HTNV乳鼠部分内脏器官病变的影响

在以上实验结果基础上，选择接种HTNV 76-118毒株后24h给药组乳鼠，所收集的内脏器官进行病理切片观察。结果显示，接种病毒第14天，HD组和MD组乳鼠肾、脑组织病变轻于安慰剂对照组；接种病毒第28天存活鼠，HD组和MD组脑、肾组织病变明显减轻甚至消失。但LD组脑、肾组织的病变较接种病毒第14天时明显，脑组织可见神经细胞变性、坏死，呈核偏位、深染，甚至核溶解消失；肾脏可见肾小球固缩、肾间质出血，红细胞浸润，肾小管上皮细胞坏死脱落(图8)。表明注射IFN-λ2可显著降低感染乳鼠肾、脑组织的病变程度。

5)IFN-λ2对各内脏器官中HTNV核酸的影响

在以上实验结果基础上，选择接种HTNV 76-118毒株后24h给药组乳鼠，所收集的内脏器官应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，所用引物及具体过程同实施例2。接种病毒第14天和28天，HD组和MD组乳鼠脑组织、肾脏病毒核酸表达量下降，与安慰剂对照组相比变化有明显差异，LD组与安慰剂对照组病毒核酸的表达水平无明显差异，存在显著的量效关系，结果见图9。

Claims (2)

1.λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物中的应用。

2.λ干扰素在制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用。