CN104784213B - 美洲大蠊在制备治疗支气管肺炎的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊在制备治疗支气管肺炎和支气管炎的药品中的应用。包括慢性支气管肺炎和克雷伯菌性支气管肺炎、不可分型流感嗜血杆菌支气管肺炎等，本发明实施可以采用超高压提取方法进行提取美洲大蠊的有效成分，收率高，操作简便，提取物可治疗支气管肺炎，临床应用前景良好。

Description

美洲大蠊在制备治疗支气管肺炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种美洲大蠊提取物在制备治疗支气管肺炎的药物中的应用。

背景技术

美洲大蠊（Periplaneta americana）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。近些年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者其进一步研究并取得了可喜的成就，以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面及消化道粘膜损伤性疾病的治疗上取得的良好疗效，其主要的药理作用体现在消除炎症水肿、促进创面愈合及调节免疫等。美洲大蠊的有效成分有氨基酸、肽类、蜚蠊酮以及微量元素等。

支气管肺炎（bronchopneumonia）又称小叶肺炎，为最常见的肺炎。发展中国家小儿肺炎的发病率明显高于发达国家，病死率和玹死亡率更高于发达国家，和其他发展中国家相似，小儿肺炎是威胁我国儿童健康的严重疾病，无论是发病率还是病死率均居首位。

慢性支气管炎是气管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床上以咳嗽、咳痰为主要症状，每年持续3个月，连续2年或2年以上。急性发作期主要是控制感染、镇咳祛痰和平喘。本病的病因尚不完全清楚，可能是多种因素共同作用的结果：1、有害气体和有害颗粒：香烟、烟雾、粉尘、刺激性气体。这些理化因素可损伤气道上皮细胞，导致气道净化功能下降。并刺激粘膜下感受器，副交感神经功能亢进，使气管平滑肌收缩，腺体分泌亢进，气道阻力增加；2、感染因素：病毒、支原体、细菌等感染是慢性支气管炎发生发展的重要原因之一。感染因素造成气道粘膜损伤和慢性炎症。病毒感染以流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒为多见。细菌常继发于病毒感染，常见病原体为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌。3、其他：免疫、年龄和气候等均与慢性支气管炎有关。主要病理表现为支气管上皮细胞变性、坏死、脱落，后期出现鳞状上皮化生，纤毛变短、粘连、倒伏、脱失。粘膜和粘膜下充血水肿，杯状细胞和粘液腺肥大和增生、分泌旺盛，大量粘液潴留。浆细胞、淋巴细胞浸润及轻度纤维增生。病情进展，炎症由支气管壁向周围组织扩散，粘膜下层平滑肌束断裂萎缩，粘膜下和支气管周围纤维组织增生，肺泡弹性纤维断裂，进一步发展为阻塞性肺病。

目前，未见美洲大蠊提取物治疗支气管肺炎和支气管炎的相关报道。

发明内容

本发明提供了美洲大蠊在制备治疗支气管肺炎的药物中的应用。

本发明还提供了美洲大蠊在制备治疗支气管炎的单味或者复方制剂药物中的应用。

本发明还提供了美洲大蠊在制备治疗慢性支气管肺炎的单味或者复方制剂药物中的应用。本发明还提供了美洲大蠊在制备治疗克雷伯菌性支气管肺炎单味或者复方制剂的药物中的应用。

本发明还提供了美洲大蠊在制备治疗不可分型流感嗜血杆菌支气管肺炎单味或者复方制剂的药物中的应用。

本发明美洲大蠊的提取采用浸提法、回流提取法、闪式提取法等方法，如专利号：ZL200610021993.6，发明名称：“美洲大蠊提取物、含该提取物的药物组合物及其制备方法”的专利中公开了一种美洲大蠊提取的制备方法，包括如下步骤：a、取美洲大蠊粉碎，加石油醚，在温度5～20℃下浸泡，过滤，滤渣挥干；b、取步骤a所得滤渣，采用水提醇沉或醇提水沉法提取，静置；静置后的药液，弃上层油脂，过滤，得下层药液；其中，水提醇沉法中醇沉时，加入的乙醇浓度为：75～95%w/w；或，醇提水沉法时，加入的乙醇浓度为：60～80%w/w；c、所得b步骤所得药液，浓缩至相对密度为1.20～1.25，得清膏；d、按每1000g美洲大蠊使用40～60ml甘油的用量取甘油，与c步骤所述的清膏混合，即得美洲大蠊提取物。然而，现有提取方法难以有效保留氨基酸和肽等有效成分。氨基酸含量最高仅为8.6%（专利申请号：201310030233.1）

超高压提取(u ltrah igh-pressure ex traction,UHPE)，也称超高冷等静压提取，是指用100～1000MPa的流体静压力作用于提取溶剂和中药的混合液上，并在预定压力下保持一段时间，使植物细胞内外压力达到平衡后迅速卸压。由于细胞内外渗透压力忽然增大，细胞膜的结构发生变化，使得细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中，达到提取中药有效成分的目的。

本发明也提供美洲大蠊的超高压提取方法，包括如下步骤：

（1）取美洲大蠊粉末，以水或浓度为50%～90%乙醇溶液为溶剂，超高压提取1～5次，每次5～20min，即得提取液，其中，超高压提取的压强为100-800MPa，温度为20～80℃；

（2）过滤步骤（1）的提取液，得上清，浓缩，得浓缩液；

（3）将步骤（2）的浓缩液冷藏24～48h，去除上层油脂，离心，得上清，浓缩，干燥，粉碎，即可。

步骤（1）中，美洲大蠊粉末的粒度为20～80目。

步骤（1）中，所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～10倍（v/w）。优选地，所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～8倍（v/w）。

步骤（1）中，所述乙醇溶液的浓度为65%～75%。优选地，所述乙醇溶液的浓度为70%。

步骤（1）中，所述超高压提取的次数为2～3次，提取时间为15～20min。

步骤（1）中，所述超高压提取的压强为200～600MPa，优选为200～400MPa，进一步优选为400MPa。

步骤（1）中，所述超高压提取的温度为55～70℃。优选地，所述超高压提取的温度为60℃或70℃。

步骤（2）中，所述浓缩是浓缩至相对密度为1.05～1.25（50℃测）。

步骤（3）中，所述冷藏的温度为0～15℃。

步骤（3）中，所述离心的温度为5～15℃，转速10000r/min。

本发明还提供了前述方法制备的美洲大蠊提取物在制备治疗支气管肺炎药物中的用途。

另外,还可以采用浸提、回流提取、闪式提取方法，制得的美洲大蠊提取物有效成分含量低，其中，氨基酸含量最高仅为8.6%（专利申请号：201310030233.1）。

而采用超高压提取方法，可以高效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，制得的提取物中，氨基酸含量最高可达19.4%，显著高于现有方法制得的美洲大蠊提取物，低聚肽含量最高可达31.2%。

本发明制得的提取物，加入水制成浓度为1g/100ml(生药含量)，氨基酸含量为7-18%的药剂，给与雾化或口服给药，雾化治疗每日1-2次，每瓶8ml，通过消除炎症水肿，增强机体免疫力，治疗慢性支气管肺炎，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入6倍量（v/w）60%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至300MPa，循环加压5次，每次5min，温度为40℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于60℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于0℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心上清液于60℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物450g。

实施例2美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入7倍量（v/w）75%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次10min，温度为50℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.08（50℃测），浓缩液于5℃冷藏36小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物465g。

实施例3本发明美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入8倍量（v/w）70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次15min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于10℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为15℃，转速10000r/min。离心上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物491g。

实施例4本发明美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入10倍量（v/w）80%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至500MPa，循环加压2次，每次20min，温度为45℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于80℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.20（50℃测），浓缩液于15℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为8℃，转速10000r/min。离心上清液于80℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物432g。

实施例5本发明美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入6倍量（v/w）65%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至500MPa，循环加压3次，每次5min，温度为30℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.07（50℃测），浓缩液于12℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为12℃，转速10000r/min。离心上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物457g。

实施例7本发明美洲大蠊的超高压提取方法

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入8倍量（v/w）75%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至200MPa，循环加压3次，每次20min，温度为55℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于65℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.16（50℃测），浓缩液于6℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心上清液于65℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物481g。

实施例8

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入8倍量70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至900MPa，循环加压2次，每次60min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速510000r/min。离心上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物176g。

实施例9

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入8倍量95%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压2次，每次60min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于8℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物169g。实施例10

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入8倍量70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次60min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.15（50℃测），浓缩液于12℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物143g，加入适量蒸馏水。

实施例11

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入70%的乙醇回流提取3次，每次分别加入8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇。回收纸无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于0℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物125g。

实施例12

称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入95%的乙醇回流提取3次，每次分别加入8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇。回收纸无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎。即为美洲大蠊提取物73g。

技术效果

实验例1丙烯醛对慢性支气管肺炎大鼠模型的实验研究

1材料和方法

1.1实验动物

清洁级SD大鼠60只，雌性各半，体重200±20g，由达硕科技生物有限公司提供。1.2实验试剂

丙烯醛，美洲大蠊提取物制备方法为实施例3的美洲大蠊提取物。

1.3实验器材

电动雾化器、自制雾化箱、离心机

1.4实验方法及分组

清洁剂SD大鼠60只，适应性饲养一周，按体重分层，随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只大鼠，共5组。①空白组，SD大鼠雾化吸入4mg/L生理盐水，每次3h，每天2次（间隔6h），持续6周。②模型组，SD大鼠雾化吸入4mg/L丙烯醇，每次3h，每天2次（间隔6h），持续6周，建立慢性支气管肺炎大鼠模型。③依那普利组，大鼠灌胃，1mg/kg.d，每天1次；丙烯醇雾化吸入方法同模型组。于丙烯醇处理后第6周末处死大鼠。④美洲大蠊低剂量组，大鼠雾化吸入0.1g/ml（生药浓度），每次30min，每天1次；丙烯醇雾化吸入方法同模型组。⑤美洲大蠊高剂量组，大鼠雾化吸入0.3g/ml（生药浓度），每次30min，每天1次；丙烯醇雾化吸入方法同模型组。

1.5取材

1.5.1大鼠一般情况观察

实验期间记录大鼠的一般情况：精神状态、饮食、皮毛、活动等。

1.5.2肺组织病理学检查

脱颈椎法处死实验大鼠，仰卧位固定于操作台上。做颈部正中切口，逐层分离，暴露气管。剪开两侧胸壁，打开胸腔，暴露两肺、止血钳夹闭右肺门并结扎，立即取下右肺，将右肺置于4%多聚甲醛缓冲液（PH7.4）中固定，按照常规固定、脱水、浸蜡、包埋、切片等过程，最终制成5μm厚的石蜡切片。HE染色。

1.5.3支气管肺泡灌洗液的采集

制备支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。留取右肺组织后，迅速于气管下段作一“T”形切口，插入内径约1mm的塑料管至左肺，丝绒固定，用注射器将2mL Hankle’s液经塑料管缓缓注入，见左肺充分，保留1min，然后缓慢回抽。如此反复进行3次，共注入Hank’s液6mL，灌洗液回收率约80%。BALF收集于离心管中暂置4℃冰箱。将采集的BALF在离心管中用吸管吹打混匀，取一滴于学细胞计数板上，在显微镜下进行细胞总数计数。剩余BALF于4℃1200rmp/mim离心10min，将上清液分装于EP管中，BALF沉渣用Wright-Gimosa染色进行细胞分类。

1.6统计学处理

所得数据资料以表示，应用SSPS10.0统计软件分析（采用one-way AN0VA方差分析），组间差别采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

造模前各组大鼠精神状态、食欲好。空白组在整个实验过程中一般情况无明显改变。丙烯醇雾化吸入后，大鼠精神萎靡，少活动，食欲差，毛发无光泽，踹息明显，呼吸急促。美洲大蠊低、高剂量组及依那普利组大鼠上述表现逐渐减轻。

2.2肺组织病理学改变

大体观察，空白组大鼠肺呈粉红色，有光泽，弹性好，无肿胀和出血。模型组大鼠肺组织外观灰白，表面不平整，肺膨胀明显，肺弹性明显减低，局部可见充血出血点；低、中、高剂量组大鼠上述情况有所改善。

空白组大鼠支气管肺组织病理切片HE染色光镜下观察见支气管管壁及其周围结构完整、清晰，未见或遇见少量炎性细胞，肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔内及间隔无黏液和血液瘀滞，未见炎性细胞浸润，官腔内无明显渗出。模型组大鼠吸入丙烯醇后支气管肺组织病理切片HE染色光镜下观察见气道壁充血，炎症细胞浸润，支气管粘膜上皮细胞部分脱落至气道腔内，气道发生不完全阻塞；肺泡管、肺泡囊和肺泡扩张，肺泡间隔破坏，部分肺泡上皮细胞增生变厚，多个肺泡融合成气肿，部分管周肺组织纤维化，增生分隔。肺野内亦可见大量炎性细胞聚集，肺泡上皮细胞增生。说明造模成功。美洲大蠊提取物低、高剂量组及依那普利组大鼠支气管肺组织病理切片HE染色光镜下观察到的上述病理改变逐渐减轻。

2.2.3BALF细胞总数和细胞分类的变化

丙烯醇刺激后，模型组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞及巨噬细胞数于正常组比较明显增加（P＜0.05）；美洲大蠊低、高剂量组及阳性组中细胞总数、中性粒细胞数及巨噬细胞数逐渐减少（P＜0.05），美洲大蠊高剂量组作用优于依那普利组。

表1各组大鼠BALF中细胞总数的变化

注：与空白组比较，#表示P＜0.05；与模型组比较，*表示P＜0.05。

表2各组大鼠BALF中中性粒细胞计数的变化

注：与空白组比较，#表示P＜0.05；与模型组比较，*表示P＜0.05。

表3各组大鼠BALF中巨噬细胞计数的变化

注：与空白组比较，#表示P＜0.05；与模型组比较，*表示P＜0.05。

实验例2本发明提取物对克雷伯菌性支气管肺炎的影响

1材料与方法

1.1实验动物：清洁级BALB/C小鼠，雌性各半，20±2g。

1.2实验药品：氢化可的松注射液，注射用环磷酰胺，盐酸左氧氟沙星片，以无菌生理盐水稀释至2.5g/L。美洲大蠊提取物为实施例1制备方法制备的。

1.3菌液：将分离自临床标本并经严格鉴定的肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）划线接种于血平板，37℃过夜培养后挑取4～5个典型菌落种入肉汤中，4～6h培养后以无菌生理盐水调节去浊度，使之相当于0.5号McFarland比浊度。

1.4实验方法：受试小鼠每天上午腹腔注射0.1ml（0.5mg）氢化可的松，下午腹腔注射0.2ml（0.5mg）环磷酰胺。在氢化可的松和环磷酰胺各完成3次注射后1～2h，于小鼠前背右上部，距右耳根1cm左右处（消毒后）以小儿头皮针垂直刺入约0.5cm，注入菌液0.1ml。注射后5h内死亡者为非感染性死亡，予以弃用。分为模型组、盐酸左氧氟沙星组和美洲大蠊提取物组，美洲大蠊提取物组给药方式为雾化吸入，给药结束后观察小鼠7天，记录死亡率。对刚死的小鼠进行无菌解剖，观察各脏器的改变，取肺脏进行细菌培养及病理检查。

2结果

2.1小鼠细菌性支气管肺炎模型的建立

所有死亡小鼠的肺脏色泽均有改变，呈深红至浅红色，与正常肺脏（白而带淡红色纹理）明显不同。其他脏器与正常小鼠间未见有何差异。所有小鼠粉肺脏中均培养出肺炎克雷伯菌。病理检查皆表现为程度不同的支气管肺炎，即小支气管和细支气管周围及肺泡内有渗出和炎细胞浸润，间质毛细管充血或出血，依严重程度不同，病变可呈灶性或片状。

2.2美洲大蠊提取物与对小鼠支气管肺炎的治疗作用

各实验组小鼠死亡数见表。美洲大蠊提取物组的死亡率显著低于对照组。病理结果显示美洲大蠊提取物组可减轻肺泡内渗出及炎细胞浸润。

附表4美洲大蠊提取物对支气管肺炎小鼠的疗效

实验例3本发明提取物对不可分型流感嗜血杆菌支气管肺炎的影响

1材料与方法

1.1实验动物：SPF级5～6周龄雌性C57BL/6小鼠55只，体重15～20g。到动物室后，在新环境中适应3d，普通敞式小鼠笼中颗粒饲料喂养，饮用蒸馏水。

1.2.1菌液：流感嗜血杆菌标（Nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi）准菌株ATCC49247，本试验室保存标准菌株，为不可分型菌株，自肺炎患者痰标本分离。

1.2.2药物美洲大蠊提取物为实施例1制备方法制备的。

1.3实验方法：受试小鼠称重后随机分为正常对照组、感染组、阿奇霉素和美洲大蠊提取物组共4组。正常对照组3只小鼠不作任何处理，感染组、阿奇霉素组和美洲大蠊提取物组各48只分为6个亚组，每亚组8只，气管内注射细菌琼脂珠悬液，在气管注射后0、3、5、7、10及14天分批处死。感染组、阿奇霉素组和美洲大蠊提取物组小鼠3%戊巴比妥钠溶液（30mg/kg），小鼠腹腔麻醉；颈部适度过伸，在无菌操作下，作颈部正中切口暴露气管，用0.1ml注射器刺入气管软骨环间隙，朝向心端进针约0.5cm，回抽无力后，将NTHi琼脂珠悬液或单纯琼脂珠悬液30μl注入气管（细菌攻击量为10⁶CFU/肺），随后注入100ul空气，直立动物10秒，使其流入肺内，缝合伤口，腹侧平躺至苏醒。麻醉和手术操作造成的死亡为非感染性死亡，均在术后1小时内发生，不纳入。术后1小时未死亡小鼠纳入实验，保证样本数量，置于23℃恒温动物房饲养。阿奇霉素组和美洲大蠊组每天进行药物吸入治疗。

1.3.1观察动物大体状况、疾病程度和死亡率：观察各组动物大体情况和疾病程度变化，记录小鼠生态改变（精神、食欲、活动情况）及死亡数，计算死亡率。死亡率由死亡动物数除以动物总数算出。

1.3.2肺部大体观病理：实验结束后于腹腔注射麻醉，常规消毒，行腹腔主动脉放血处死小鼠，在无菌条件下开胸完整取出肺脏，称重，观察肺脏表面色泽、有无充血、脓肿、出血、粘连、不张、实变及水肿等病理改变。向右肺注入10%中性福尔马林磷酸盐缓冲溶液2～3ml，见胸膜展平，浸入10%福尔马林液中固定。于右下肺矢状面，右中叶冠状面最大周径处横贯各取材一块，常规脱水，石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察各组织病理形态学的改变。HE染色方法观察支气管组织中的炎性浸润程度，胞核呈蓝色，胞浆及其它结构呈红色。肺组织病理学炎症评价参考Martin肺炎组织病理学评分系统，由病理医生盲法评分。

表5肺炎组织病理学评分系统

评分=A+3(B+C)+D+E分值范围：0～26

2结果

2.1细菌琼脂珠的成功制备

本实验所制备NTHi琼脂珠悬液的细菌浓度为108CFU/ml，所产生的琼脂珠染色后，

光镜观察，直径均在30×50～200μm。

2.2攻击后各组动物大体状况

各组动物苏醒后，出现神差、活动少、食欲减退、毛发竖立、反应迟钝、呼吸急促和增粗。3小时后活动增加，但精神稍差。小鼠均于24h后进食正常，活动自如并长期存活，无并发症出现，实验期间无死亡。

2.3大体及镜下病理学观察结果

2.3.1大体病变：正常对照组之肺脏基本为白色至浅红色，其纹理清晰均匀。感染组肺脏色泽为红色和深红色，胸膜光滑，表面颜色不均匀，可见较多深红斑块浸润；阿奇霉素组肺脏组织以浅红色为主，胸膜光滑几乎没有斑块浸润；美洲大蠊提取物组多为浅红色，胸膜光滑，表面少许深红斑块浸润。

2.3.2镜下观察

本肺炎模型的病理改变以支气管和细支气管周围及肺泡的白细胞浸润为主，炎症反应包括气管支气管周围以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，气管支气管官腔内以中性粒细胞为主的炎性细胞渗出，血管周围以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润和实质性肺炎。

阿奇霉素组肺组织炎症反应减轻，支气管上皮细胞排列整齐，腔内无渗出，肺组织结构完整，各级支气管规则，粘膜上皮完整。

美洲大蠊提取物组肺组织的炎症反应减轻，支气管上皮细胞脱落少，排列较整齐，腔内渗出物少于模型组，肺组织结构较完整，各级支气管腔规则，粘膜上皮较完整。

2.3.3肺组织炎症积分

在感染后第1天，开始出现轻微炎症反应，组织病理学评分平均为5.42分，第5天炎症反应最重，组织病理学平均评分为23.4分，最高分为26分，7至第14天评分逐渐降低接近空白对照组。美洲大蠊提取物组评分为7～14分。分别见表。

表6肺组织炎症评分

注：与0d比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.05。

综上实验表明，可以有效消除炎症水肿，治疗急慢性支气管肺炎，应用前景良好。本发明超高压提取方法可以有效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，制得的提取物氨基酸和低聚肽含量高。可以通过雾化给药方式在临床使用中可以更好的达到患处，起到良好的治疗作用。

实验例4本发明提取物对慢性支气管炎的影响

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重200g±20gg。由成都中医药大学实验动物研究中心提供，生物生产许可证号：SCXK（川）2008-11，实验动物使用许可证证号：SYXK（川）2008-049，检疫后备用。

1.1.2实验药物：药物美洲大蠊提取物为实施例1制备方法制备的。醋酸地塞米松片：天津药业集团新郑股份有限公司生产：生产批号：090225。

1.1.3实验试剂：天下秀牌香烟，川渝中烟工业公司生产，焦油量12mg，烟气烟碱量1.0mg，烟气一氧化碳量13mg。

1.1.3实验仪器：自制烟熏箱；HB-2型Olympus显微镜（日本Olympus公司）；BL-2000医用图像分析系统（成都泰蒙科技有限公司）；

1.2实验方法

1.2.1造模方法：SPF级SD大鼠60只按体重分层，随机分为空白组（n=12）和造模组（n=48）。空白组置常温无烟室内饲养（室温25～26℃，相对湿度50%～60%）。造模组大鼠饲养于自制烟熏箱中，每次用20支香烟加锯末面10g，每次混合烟熏50min，每天2次，2次之间间隔5～10min。造模第20天时，取造模组大鼠2只，断颈处死，取右肺中部组织在中性福尔马林中固定，再经过脱水、浸蜡、包埋等处理，切片，常规HE染色做病理切片光镜下观察，证明慢性支气管炎已经形成。慢性支气管炎模型成功建立的形态学标准：支气管黏膜上皮细胞肿胀，纤毛细胞变性、脱落或萎缩，杯状细胞增生，浆液渗出，炎症细胞浸润。造模第40天时造模组开始分组及给药。

1.2.2实验分组及给药：造模第40天时造模组按体重分层，随机分为5组，每组12只，雌雄各半，分别为：模型组、对照组、美洲大蠊提取物高剂量组、美洲大蠊中剂量组和美洲大蠊低剂量组。对照组按0.02mg/kg，10mL/kg灌服醋酸地塞米松溶液；美洲大蠊提取物高剂量组（高剂量组）按2.0mL，10mL/kg灌服美洲大蠊提取物；美洲大蠊提取物中剂量组（中剂量组）按1.0mL，10mL/kg灌服美洲大蠊提取物，容积不足用蒸馏水补齐；美洲大蠊提取物低剂量组（低剂量组）按0.5mL，10mL/kg灌服美洲大蠊提取物，容积不足用蒸馏水补齐；空白组和模型组按给予等体积蒸馏水。除正常组外，各组给药后将各组大鼠置于自制烟熏箱中继续造模，连续20天。

1.2.3观察指标

1.2.3.1病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量检测：实验期间观察大鼠一般情况。末次给药后1小时，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。仰卧固定于操作台，开胸后大鼠呼吸、心跳停止，分离气管和双肺。在气管下部作横行切口，夹闭右侧肺门主支气管。在气管下部作横行切口，夹闭右侧肺门主支气管；通过硅胶管用注射器从气管注入无菌生理盐水3mL x3进行左肺支气管肺泡灌洗，回收率80%～90%；取气管及右肺中叶置入10%中性缓冲福尔马林固定12～24小时，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜下分辨气道组织结构，并使用BL-200医用图像分析对病理切片全视野下所有支气管进行炎细胞浸润定量测定，测定结果使用积分光密度和目标面积表示，对支气管的超微结构改变采用透射电镜观察。

1.2.3BALF细胞计数：取0.1mL BALF于血细胞计数板中测定细胞总数，余BALF于4℃4000r/min离心10min，上清液分装后-20℃冰箱保存待测。用沉渣制备细胞涂片作wright-giemsa染色，显微镜下细胞分类（至少计数200个细胞），计算肺泡巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞的百分比及数量。

2结果

2.1一般情况观察

正常组大鼠毛色光泽，精神状态、活动度良好，无异常表现。模型组大鼠随着造模实验延长逐渐出现毛色萎黄、不同程度地脱毛、精神不振、活动减少、进食减量、鼻腔分泌物增多、咳嗽、鼻涕等频繁症状。对照组大鼠毛色、精神状态、进食量等情况较模型组大鼠情况好转，几乎无咳嗽和鼻涕等症状出现。美洲大蠊提取物随着剂量的增加，大鼠精神状态、禁食情况、活动度增加，咳嗽、鼻涕等症状皆好转。

2.2病理组织学观察与支气管炎细胞浸润病理定量测定

光镜下可见空白组大鼠正常气管上皮细胞纤毛丰富，排列整齐，在纤毛细胞间杂有少数杯状细胞，管壁内有少数散在的淋巴细胞。模型组大鼠气管及各级支气管可见明显支气管黏膜上皮纤毛倒伏、粘连或脱落，官腔分泌物增多，杯状细胞增生，支气管、肺间质有不同程度的慢性炎症细胞浸润，支气管平滑肌增厚，周边肺组织肺泡结构紊乱。对照组大鼠支气管很少见炎症细胞的聚集、上皮细胞及浆液渗出。美洲大蠊提取物高、中和低剂量支气管炎症细胞的聚集、上皮细胞肿胀及浆液渗出均减轻。

透射电镜超微结构观察，与空白组比较可见模型组大鼠支气管纤毛上皮线粒体肿胀；与模型组比较，对照组和美洲大蠊提取物高、中剂量组只去管纤毛上皮线粒体正常，美洲大蠊提取物低剂量纤毛上皮线粒体轻度肿胀。大鼠支气管炎细胞浸润病理定量测定见表7。

表7大鼠支气管炎细胞浸润病理定量测定

注：与空白组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#p＜0.05。

2.3BALF细胞学

模型组大鼠BALF中细胞总数和肺泡巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞百分比显著增多，明显高于空白组。经美洲大蠊提取物干预后炎症细胞均减少。大鼠BALF中细胞总数和分类计数结果见表8。

表8大鼠BALF中细胞总数和分类计数

注：与空白组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#p＜0.05。

综上实验表明，美洲大蠊可以有效消除炎症水肿，治疗支气管炎，急慢性支气管肺炎，应用前景良好。本发明超高压提取方法可以有效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，制得的提取物氨基酸和低聚肽含量高。可以通过雾化给药方式在临床使用中可以更好的达到患处，起到良好的治疗作用。

Claims (3)

1.美洲大蠊提取物在制备治疗支气管肺炎的单味或者复方制剂药物中的应用，其特征在于，所述支气管肺炎为慢性支气管肺炎、克雷伯菌性支气管肺炎或不可分型流感嗜血杆菌支气管肺炎；所述美洲大蠊提取物用包括如下步骤的方法制备得到：

（1）取美洲大蠊粉末，以用量为美洲大蠊的6~10倍（v/w）的水或浓度为50%~90%的乙醇溶液为溶剂，在温度为20~80℃，压强为100-800MPa条件下，超高压提取1~5次，每次5~20min，即得提取液；

（2）过滤步骤（1）的提取液，得上清，浓缩，得浓缩液；

（3）将步骤（2）的浓缩液冷藏24~48h，去除上层油脂后，离心，得上清，浓缩，干燥，粉碎，即可。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、微囊剂、注射剂、吸入剂或散剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为吸入剂，采用雾化的浓度为每100ml含有1g生药，每瓶剂量为8ml。