CN106723056A - 一种多糖组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保健食品领域，特别涉及一种多糖组合物及其用途。本发明所述多糖组合物由枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组成。本发明中的枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组合物经免疫功能评价试验证实，可以显著增强免疫抑制小鼠细胞免疫、体液免疫和固有免疫功能；而且该多糖组合物增强免疫抑制小鼠免疫力的作用与每种多糖单独使用比较，作用更全面，效果更显著。因此本发明的多糖组合物应用于制备健康食品或保健食品，可以增强亚健人群等免疫力低下者的免疫功能。

Description

一种多糖组合物及其用途
技术领域
本发明涉及保健食品领域，特别涉及一种多糖组合物及其用途。
背景技术
免疫力是人体重要的抗病能力，由免疫系统通过免疫应答来执行。机体免疫应答根据系统进化、发育和免疫效应机制特征，通常分为固有免疫应答和适应性免疫应答两类。机体免疫力的正常发挥有赖于免疫系统中各成分(细胞、细胞因子等)及其功能维持在一定的稳定状态，其中免疫细胞是核心，各种细胞因子由细胞分泌并作用于免疫细胞自身、临近的免疫细胞和机体其他部位的细胞。参与固有免疫应答的免疫细胞有单核巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞等；其中单核吞噬细胞包括血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞。单核吞噬细胞是固有免疫的重要组成部分，具有吞噬作用、激活杀菌活性和抗原提呈的功能，参与维持机体内环境稳定、天然抗感染、抗肿瘤免疫。NK细胞是一群大颗粒淋巴细胞，不需要抗原激活，可以直接释放颗粒酶、穿孔素等裂解颗粒杀死病毒感染的细胞和肿瘤细胞，既参与组成机体固有免疫的第一道防线，又在免疫监视中发挥重要作用。适应性免疫应答是在固有免疫应答之后发挥效应的，在病原体的最终清除和预防再感染中起主导作用，其执行者主要是T、B淋巴细胞。根据应答成分和功能，适应性免疫应答可分为体液免疫应答和细胞免疫应答。体液免疫应答主要由B细胞介导，B细胞受抗原刺激分化为浆细胞(在T细胞辅助下)并分泌抗体(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。抗体主要通过中和作用、激活补体和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用等方式清楚胞外菌的感染以及中和细菌的外毒素。细胞免疫应答主要由T细胞介导，T细胞接收抗原提呈细胞传递的信息后会增殖、分化为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞又叫辅助性T细胞，主要辅助细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)功能和B细胞介导的体液免疫功能；而CD8+T细胞具有和NK细胞类似的分泌细胞毒性颗粒以杀死受病毒和胞内菌感染的细胞。
由此可见，维持机体免疫力正常是维护机体健康的必要手段。及时有效的免疫应答能保证机体不受病原体侵害，并及时清除突变的肿瘤细胞，维持机体处于健康状态。而一旦免疫系统的各成分(特别是细胞)受损，会导致免疫应答异常则造成感染、肿瘤等疾病。随着现代社会经济的发展，竞争日趋激烈，人们的生活、工作方式和环境发生巨大改变，亚健康状态人群所占的比例日趋升高，最新的调查显示其发生率在17.8-60.5％，而一项非体力劳动者亚健康状况调查结果显示其发生率高达70.33％。亚健康状态，即处于疾病与健康之间的健康低质状态，研究显示亚健康人群具有免疫力绝对低下(低于正常值)或相对低下(处于正常值下限附近)的特点：细胞免疫中CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞计数或百分率减少，CD4+T细胞/CD8+T细胞比值降低；体液免疫中，占血清大多数的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量绝对减少(低于正常值下限)或部分相对减少(处于正常值下限附近)；NK细胞杀伤活性相对降低；外周血白细胞计数偏低。亚健康状态与机体疾病易感性(例如肿瘤的易感性、多种慢性炎症的发生、普通感冒)密切相关，现有研究提示亚健康人群免疫力低下(绝对或相对低下)是造成疾病易感性风险增加的主要原因之一，因此增强机体免疫力功能以增强机体抗病能力具有必要性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多糖组合物及其用途。可以显著增强免疫抑制小鼠细胞免疫、体液免疫和固有免疫功能；而且该多糖组合物增强免疫抑制小鼠免疫力的作用与每种多糖单独使用比较，作用更全面，效果更显著。因此本发明的多糖组合物应用于制备健康食品或保健食品，可以增强亚健人群等免疫力低下者的免疫功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组合物，由枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组成。
在本发明的一些具体实施方法中，以质量份计，所述组合物由枸杞多糖10～30份、绞股蓝多糖10～30份和山药多糖10～30份组成。
在本发明的一些具体实施方法中，所述枸杞多糖、所述绞股蓝多糖和所述山药多糖的质量比为1:1:1、3:1:3、3:1:1或1:3:1。本发明还提供了所述组合物在制备增强动物胸腺指数和/或脾指数的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备增强动物T细胞介导的迟发型超敏反应的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备增强动物巨噬细胞吞噬功能和/或NK细胞杀伤活性的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备增强动物血清溶血素(抗体)和/或肠道sIgA生成水平的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备调节细胞因子分泌水平和/或增强T、B淋巴细胞增殖能力的药物和/或食品中的应用。具体的，本发明提供了所述组合物在制备调节细胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌水平的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备增强动物细胞免疫功能和/或体液免疫功能的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了所述组合物在制备增强动物机体免疫力的药物和/或食品中的应用。
抗体在机体免疫防御中扮演着重要角色，由B细胞分化而来的浆细胞产生。例如，分泌型IgA(即sIgA)在消化道和呼吸道粘膜抗感染中发挥关键作用，可以通过与病毒、病原菌结合等方式组织这类病原体侵入宿主。而在血循环中的抗体(即本实验中的血清溶血素)可以与外毒素结合，从而中和其毒性；或者通过激活补体，发挥溶菌和溶细胞效应；又或者通过介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)而杀死机体受感染或癌变的细胞。如果B细胞功能降低，抗体生成减少，体液免疫介导的防御功能下降，就会容易导致各种感染性疾病。本研究发现，使用枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组合物后，免疫抑制小鼠脾T、B淋巴细胞增殖能力得到恢复，血清溶血素(即血循环抗体)和肠道sIgA分泌水平显著恢复，表明该多糖组合具有改善免疫抑制小鼠体液免疫功能的作用。
机体免疫系统具有的免疫监视功能可以有效预防肿瘤的发生。NK细胞、巨噬细胞、T细胞(特别是CD8+CTL细胞)都是免疫系统发挥监视功能的主要细胞。NK细胞和CD8+CTL细胞可以通过细胞毒作用杀死癌变的细胞，而巨噬细胞既可以分泌NO、ROS等活性物质杀伤癌细胞，也可以通过吞噬作用杀死癌细胞。上述免疫细胞功能下降，免疫系统监视功能降低，容易导致肿瘤的发生。本研究发现，使用枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组合物后可以显著提高免疫抑制小鼠NK细胞杀伤活性，增强T细胞介导迟发型超敏反应(即增强了T细胞功能)，并且还可以增强巨噬细胞的吞噬功能。这些表明枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组合物可以有效增强机体免疫监视功能。
综合实验结果可以看出，由枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组成的多糖组合物能显著提高免疫抑制小鼠的免疫力：多糖组合物可以显著促进免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数恢复，增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应(即细胞免疫功能)，促进血清溶血素和sIgA生成(即体液免疫功能)，增强免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能和NK细胞杀伤活性，并且调节细胞因子分泌水平，促进免疫抑制小鼠T细胞、B细胞增殖能力恢复。而且多糖组合物对免疫抑制小鼠免疫力的调节作用与每种多糖单独使用比较，作用更全面，效果更显著。
具体实施方式
本发明公开了一种多糖组合物及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种具有增强免疫力功能的枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组合物。
本发明的另一目的是为枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖用于增强免疫力功能提供一种新的使用方法，即将枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖按一定比例组成组合物用于增强免疫力。
本发明所述多糖组合物的特殊之处在于它是采用枸杞多糖10-30份、绞股蓝多糖10-30份、山药多糖10-30份复配获得。
本发明提供的由枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖组成的组合物增强免疫力功能的作用主要体现在其可以促进免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数恢复，增强T细胞介导的迟发型超敏反应，提高机体血清溶血素(抗体)和肠道sIgA生成水平，并且增强NK细胞杀伤活性和巨噬细胞吞噬功能，调节细胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌水平，增强T、B淋巴细胞增殖能力。
由实验结果可以看出，由枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组成的多糖组合物能显著提高免疫抑制小鼠的免疫力：多糖组合物可以显著促进免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数恢复，增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应(即细胞免疫功能)，促进血清溶血素和sIgA生成(即体液免疫功能)，增强免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能和NK细胞杀伤活性，并且调节细胞因子分泌水平，促进免疫抑制小鼠T细胞、B细胞增殖能力恢复。而且多糖组合物对免疫抑制小鼠免疫力的调节作用与每种多糖单独使用比较，作用更全面，效果更显著。
本发明提供的多糖组合物及其用途中所用原料及试剂均可由市场购得。
实验动物：
SPF级Balb/c小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2013-0002。动物饲养和给予供试品皆在广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房实施，许可证号:SYXK(粤)2013-0085。
供试样品：
枸杞多糖(生产日期：2014年8月15日)、绞股蓝多糖(生产日期：2014年8月15日)、山药多糖(生产日期：2014年8月15日)均由无限极(中国)有限公司提供，水提醇沉法制备(干燥药材加入14倍蒸馏水在100℃煮沸1.5h，重复两次，合并水提液；在80℃条件下减压浓缩水提液，然后边搅拌边加入4倍体积95％乙醇，静置12h；分离沉淀，95％乙醇洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥获得多糖样品)；多糖组合I组(即实施例1，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为1：1：1的配比获得)、多糖组合II组(即实施例2，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为3：1：3的配比获得)、多糖组合III组(即实施例3，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为3：1：1的配比获得)、多糖组合IV组(即实施例4，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为1：3：1的配比获得)。将上述七种多糖样品用生理盐水配制成多糖溶液，4℃保存备用。
主要试剂及仪器：
二硝基氟苯溶液(2,4-Dinitrofluorobenzene，DNFB)：日本东京化成工业株式会社生产。
环磷酰胺注射液：山西普德药业股份有限公司生产。
荧光微球：由Life Technologies公司出品。
牛血清白蛋白(BSA)：Roche公司产品，以PBS配成1％的浓度，以0.22μm滤膜过滤后置4℃保存。
绵羊红细胞(SRBC)：浙江玉环县南方试剂厂出品。
胎牛血清、RPMI1640培养基：美国GIBICO公司产品。
碘化丙啶(Propidium iodide，PI)：美国Introvigen公司产品。
羟基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidylester，CFSE)：eBioscience公司生产。
刀豆蛋白(ConA)：Sigma公司产品。
MTT：Sigma公司产品。
二甲基亚砜(DMSO)：广州化学试剂厂产品生产。
脂多糖(LPS)：Sigma公司产品。
小鼠IL-2、IFN-γ、TGF-β1、IgA ELISA试剂盒：联科生物公司产品。
打孔器(直径8mm)：北京粤申科学仪器厂。
电子分析天平：德国Sartorius产品，d＝0.1mg。
微量加样器：法国GILSON公司产品。
MCO-20AIC型二氧化碳培养箱：日本SANYO公司生产。
WP-UP-UV-20型超纯水器：四川沃特浦科技有限公司生产。
倒置显微镜：重庆奥特光学仪器有限责任公司生产。
SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司生产。
L535-R台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司生产。
FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪：美国BD公司生产。
酶标仪：美国THERMO公司产品。
脱毛剂：由硫化钡：肥皂粉：淀粉＝3∶1∶7配比，加约15-20ml水研磨呈糊状。
YAC-1细胞：购自中山大学细胞中心。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
称取枸杞多糖10g，绞股蓝多糖10g，山药多糖10g，混合制得多糖组合物。
实施例2
称取枸杞多糖30g，绞股蓝多糖10g，山药多糖30g，混合制得多糖组合物。
实施例3
称取枸杞多糖30g，绞股蓝多糖10g，山药多糖10g，混合制得多糖组合物。
实施例4
称取枸杞多糖10g，绞股蓝多糖30g，山药多糖30g，混合制得多糖组合物。
实施例5
动物分组及处理：
分组：小鼠随机分为正常对照组(简称正常组)、免疫抑制模型组(简称模型组)、枸杞多糖组、绞股蓝多糖组、山药多糖组、多糖组合I组、多糖组合II组、多糖组合III组、多糖组合IV组。其中，多糖组合I组(即实施例1，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为1：1：1的配比获得)、多糖组合II组(即实施例2，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为3：1：3的配比获得)、多糖组合III组(即实施例3，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为3：1：1的配比获得)、多糖组合IV组(即实施例4，按照枸杞多糖、绞股蓝多糖、山药多糖比例为1：3：1的配比获得)。每组动物10只。
处理：按体重灌胃给药，每组给药剂量为200mg/kg，每日给药1次，连续给药30天，正常组和模型组给予等量生理盐水。制备免疫抑制模型时，除正常组腹腔注射生理盐水外，其余小鼠均腹腔注射环磷酰胺(40mg/kg)，每天1次，连续2天，末次注射给药后第5天检测指标。
数据分析：
所有数据应用SPSS 17.0软件进行统计分析，多个组间比较采用单因素分差分析，两组间差异比较采用t检验，P<0.05为有统计学意义，数据均以Mean±SD表示。
实施例6对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数的影响
免疫器官指数测定：
摘取小鼠胸腺和脾脏称重，按以下公式计算小鼠胸腺指数和脾指数：免疫器官指数(mg/10g)＝免疫器官质量/体重×100。
结果如表1所示，与正常组比较，模型组胸腺指数和脾指数显著降低(P<0.01)。各多糖组与模型组相比，胸腺指数及脾脏指数趋于恢复正常(P<0.05或P<0.01)，但是绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组小鼠胸腺指数与脾指数与正常组的比较仍有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；4个多糖组合对胸腺指数和脾指数的恢复作用明显强于多糖单独使用，且4个多糖组合组的胸腺指数和脾指数与正常组比较无统计学差异。
表1多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例7对小鼠迟发型超敏反应的影响
迟发型超敏反应实验：
试验第25天，在小鼠右侧背中部涂擦脱毛剂脱毛。试验第26天，用微量加样器在脱毛部位滴涂5％DNFB溶液20μl致敏。试验第30天，以1％DNFB溶液20μl滴涂小鼠左耳壳(两面)作为攻击；右耳滴涂丙酮液20μl作为对照。试验第31天(攻击后24h)，称体重，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，立即称重。以左右耳片重量之差为耳廓肿胀度反映迟发型超敏反应的强度。
与正常组比较，模型组耳肿胀度明显降低(P＜0.01)。模型组比较，各多糖组耳肿胀度均升高，趋于恢复正常，与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01.)，但是绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组小鼠耳肿胀度与正常组的比较仍有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)，而4个组合多糖组耳肿胀度恢复最明显，与正常组比较均无统计学差异。多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。结果见表2。
表2多糖对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例8对巨噬细胞吞噬功能的影响
腹腔巨噬细胞吞噬功能评价实验：
(1)激活巨噬细胞：实验第26天给每只小鼠腹腔注射2％绵羊血红细胞0.2ml以激活小鼠巨噬细胞。
(2)制备腹腔巨噬细胞：试验第31天，脱臼处死小鼠，置于70％酒精中浸泡1min，小心剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔壁，用一次性注射器吸取5mlDMEM培养液，注入腹腔，按摩约20次后，用毛细吸管吸出腹腔液体，300g离心10min，加入1ml DMEM重悬细胞，加入六孔板中。
(3)荧光微球预调理：取荧光微球溶液210μl(约1×109个微球)，与10ml1％BSA37℃孵育30min，超声波处理5min后，加入六孔板中，每孔100μl，微球约为个1×107个。
(4)吞噬试验：巨噬细胞及荧光微球于37℃孵育1.5h，加2ml PBS冲洗后，加500μlPBS，用细胞刮收集细胞至5ml离心管中，上流式细胞仪进行检测。
(5)流式细胞仪检测：收集的细胞经FSC和SSC在二维Dot-plot图中圈出巨噬细胞区，然后对巨噬细胞作FITC荧光强度检测。每份样本获取10000个巨噬细胞，Dioa软件分析吞噬荧光微球的巨噬细胞的比例，根据下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率(％)＝吞噬荧光微球的细胞数/计数的总细胞数×100％
吞噬指数＝被吞噬荧光微球总数/计数的总细胞数×100％
与正常组比较，模型组巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数显著下降(P＜0.01)。与模型组比较，各多糖组腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的能力增强，所有多糖组与模型组相比，吞噬百分率均明显升高(P<0.05或P<0.01)，但绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组的吞噬百分率与正常组比较仍然有统计学差异(P<0.05)，而4个多糖组合组巨噬细胞吞噬百分率已恢复到正常水平。多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。在吞噬指数方面，绞股蓝多糖未见显著提高巨噬细胞吞噬指数，而枸杞多糖、山药多糖虽均能显著提高巨噬细胞吞噬指数，却与正常组比较仍然具有统计学意义(P<0.05)；4个多糖组合均显著进巨噬细胞吞噬指数恢复，与正常组比较没有统计学差异。
表3多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例9对溶血素和sIgA生成的影响
溶血素生成实验：
试验第26天，各组小鼠腹腔注射2％(v/v)的SRBC悬液0.2mL进行免疫刺激。试验第31天，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
血清凝集程度一般分为5级(0-Ⅳ)记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对模型组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)，式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
ELISA检测sIgA分泌水平：
sIgA检测：实验第31天，脱颈椎处死小鼠。取出全小肠段，用带有小鼠灌胃针头的5ml注射器向小肠内注射3ml生理盐水，使生理盐水在小肠内保留3min，轻轻晃动使肠腔内容物充分混匀溶解，收集小肠冲洗液，3000rpm，离心5min，收集上清液，采用ELISA检测试剂盒检测小肠冲洗液中sIgA的含量。
与正常组比较，模型组溶血素和肠道sIgA生成水平显著降低(P<0.01)。各多糖均有提高小鼠溶血素生成(抗体生成)的作用，并均能提高小鼠肠道sIgA分泌水平，但绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组的抗体生成水平、sIgA分泌水平与正常组的比较仍然有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。4个多糖组合组作用最显著，抗体生成水平、sIgA分泌水平与正常组的比较没有统计学差异，结果见表4。
表4多糖对免疫抑制小鼠溶血素和sIgA生成的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例10对NK细胞杀伤活性的影响
NK细胞杀伤活性实验：
(1)制备效应细胞：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000rpm)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌超纯水20s，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm，10min离心，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，计数脾细胞；用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后台酚兰染色计数活细胞数(95％以上为活细胞)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。
(2)靶细胞培养：将传代1天后生长的YAC-1细胞，用PBS调细胞浓度至2×106个/ml，加入终浓度为2mol/L的荧光染料CFSE，混匀后染色10min，离心弃上清，以含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞数为1×105个/ml。
(3)NK细胞活性检测：取效应细胞及靶细胞各100μl，加入96孔U型板内(效靶比例为50∶1)，200g离心3min，37℃孵育2h，收集细胞至5ml离心管中，加1ml PBS，1200rpm离心10min。弃上清后，用400μl PBS重悬细胞，加15μlPI溶液，染色5min后上流式细胞仪分析。以CFSE和PI双阳性细胞为死亡的靶细胞，计算NK细胞杀伤活性。
NK活性(％)＝(试验组死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)×100
结果如表5所示，与正常组比较，模型组NK细胞杀伤活性显著降低(P<0.01)。各多糖均能提高小鼠NK细胞杀伤活性(P<0.01或P<0.05)，但绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组的NK细胞活性与正常组的比较仍然有统计学差异(P<0.05)，而4个多糖组合组与正常组比较无统计学差异。且多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。
表5多糖对小鼠NK细胞杀伤活性的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例11对细胞因子分泌水平的影响
ELISA检测细胞因子和sIgA分泌水平：
细胞因子检测：实验第31天，以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装1.5ml离心管(或商品化的抗凝管)中。静止30min后，离心取血清。采用ELISA检测试剂盒检测血清中TGF-β1、IL-2和IFN-γ的含量。
与正常组比较，模型组IL-2分泌显著减少(P<0.05)，IFN-γ和TGF-β1分泌显著增加(P<0.05)。各多糖均有促进IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌趋向正常的作用，但绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组的上述三个指标与正常组的比较仍然有统计学差异(P<0.05)，而4个多糖组合作用最显著，与正常组比较无统计学差异，且多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。结果见表6所示(P<0.05)。
表6多糖对免疫抑制小鼠细胞因子分泌的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例12对淋巴细胞增殖能力的影响
淋巴细胞增殖实验：
(1)制备脾细胞：试验第31天，脱颈椎处死小鼠，无菌取其脾脏，常规制备脾细胞悬液，1200rpm，离心10min，收集细胞，用消毒超纯水2ml裂解红细胞，以2ml 1.8％高渗盐水使之恢复等渗状态。裂解红细胞后，用PBS4ml离心洗涤淋巴细胞两次，用1ml 10％胎牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，并用尼龙膜过滤细胞悬液，并计数。计数后，将细胞悬液吸出0.3ml待用。调整细胞数为2×106/ml后，将细胞悬液加入细胞培养板，每孔190μl。
(2)ConA诱导的T细胞增殖实验：每孔细胞加入ConA使其终浓度为5μg/ml(每孔10μl)，以未加ConA孔作对照孔，并设RPMI 1640培养液空白对照，各样品加板均采用3个复孔。检测淋巴细胞增殖：细胞置5％CO2、37℃，饱和湿度下培养72h，于培养结束前4h左右，每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃，饱和湿度下培养4h，吸弃上清，加入150μl DMSO溶解10min。用酶标仪以570nm波长测定每孔OD值，计算时取复孔平均值。
(3)LPS诱导的B细胞增殖实验：加入LPS使其终浓度为20μg/ml(每孔10μl)，以未加LPS孔作对照孔，并设RPMI 1640培养液空白对照，各样品加板均采用3个复孔。
刺激指数＝刺激孔OD值-空白孔OD值/对照孔OD值-空白孔OD值。
结果如表7所示，与正常组比较，模型组T细胞和B细胞增殖指数均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各多糖均有促进T、细胞增殖的作用，但绞股蓝多糖组、枸杞多糖组和山药多糖组的T、细胞增殖与正常组的比较仍然有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，多糖组与单糖组相比具有显著差异(P＜0.05)。4个多糖组合作用效果最明显，T、B细胞增殖指数与正常组比较均无统计学差异。
表7多糖对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖能力的影响(mean±SD，n＝10)
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，由枸杞多糖、绞股蓝多糖和山药多糖组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以质量份计，由枸杞多糖10～30份、绞股蓝多糖10～30份和山药多糖10～30份组成。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述枸杞多糖、所述绞股蓝多糖和所述山药多糖的质量比为1:1:1、3:1:3、3:1:1或1:3:1。
4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物胸腺指数和/或脾指数的药物和/或食品中的应用。
5.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物T细胞介导的迟发型超敏反应的药物和/或食品中的应用。
6.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物巨噬细胞吞噬功能和/或NK细胞杀伤活性的药物和/或食品中的应用。
7.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物血清溶血素和/或肠道sIgA生成水平的药物和/或食品中的应用。
8.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备调节细胞因子分泌水平和/或增强T、B淋巴细胞增殖能力的药物和/或食品中的应用。
9.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物细胞免疫功能和/或体液免疫功能的药物和/或食品中的应用。
10.根据权利要求1至3任一项所述的组合物在制备增强动物机体免疫力的药物和/或食品中的应用。
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