CN102068482B - 紫景天总黄酮及其提取方法和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫景天总黄酮及其提取方法和药物用途，属于医药领域。紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇1～3倍，提取2～4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。紫景天总黄酮在制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物中的应用。具有清热解毒，收敛止血，消肿生肌的功能。用于治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡、牙周炎及相关口腔疾病。

Description

紫景天总黄酮及其提取方法和药物用途

技术领域

本发明属于医药领域。

背景技术

紫景天为景天科植物紫景天Hylotelephium purpureum(L.)Holub的全草入药。别名紫八宝《中国长白山药用植物彩色图志》，主产于长白山区，民间用于治疗口腔溃疡。本品含多种黄酮、山柰酚、山柰酚-7-葡萄糖甙、槲皮素-3，7-鼠李糖葡萄糖甙、槲皮素-3-β-D-葡萄吡喃糖甙、山柰酚-3，7-鼠李糖葡萄甙、槲皮素-3’-葡萄糖甙，根和地上部分含熊果甙。全草含有蒽甙类、鞣质、苹果酸钙和维生素C。全草浸膏能够减轻或消除再生障碍性贫血引起的蛋白代谢障碍，增加血清中白蛋白、球蛋白、纤维蛋白及总蛋白含量。据国外报道，用本植物汁液洗伤口，化脓性溃疡，黄癣，瘰疬，瘭疽等，有消炎及促进伤口愈合作用，本品还可做为感冒、风湿及痛风等病的镇痛药。曾有报道“紫景天膜剂治疗复发性口疮”、“紫景天溃疡膜的药理研究”。

中医认为紫景天有清热解毒、收敛止血、消肿生肌功效。现代医学研究亦表明，紫景天有抗炎、镇痛和调节免疫功能的作用，还能消除或减轻蛋白代谢障碍。

由此可见，采用紫景天做为药用资源，开发研制治疗口腔病的新型药物，解决广大口腔疾病患者的痛苦，满足目前市场的需求，将具有重要的现实意义，并将产生良好的社会效益和巨大的经济效益。

发明内容

本发明提供一种紫景天总黄酮及其提取方法和药物用途。

紫景天总黄酮提取方法，包括下列步骤：

紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇1～3倍，提取2～4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

本发明紫景天总黄酮在制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物中的应用。

功能主治：清热解毒，收敛止血，消肿生肌。用于治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡、牙周炎及相关口腔疾病。

当本发明用于制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物时，其口服或胃肠外给药，均是安全的。可以单方制成药剂，即制成膜剂、凝胶剂、原位凝胶剂、缓释剂、漱口剂、喷雾剂、气雾剂、经皮给药制剂。在口服情况下，其可以任何常规形式给药，如凝胶剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片等；当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如静脉内注射剂、软膏剂、栓剂、和吸入剂等。

本发明制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水、甘油、1，2-丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂腊、木腊、液体石腊、树脂、高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。

功能主治：清热解毒，收敛止血，消肿生肌。用于治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡、牙周炎及相关口腔疾病。

本发明的积极效果在于：本发明对已知的紫景天发掘了新的医疗用途；其具有资源丰富、价廉易得、疗效好、安全无毒、制备工艺简单、质量可控、适合工业化大生产等优点，具有良好的药用开发前景。并可做成膜剂、凝胶剂、原位凝胶剂、缓释剂、漱口剂、喷雾剂、气雾剂、经皮给药等制剂。由此可见，采用紫景天做为药用资源，开发研制治疗口腔病的新型药物，解决广大口腔疾病患者的痛苦，满足目前市场的需求，将具有重要的现实意义，并将产生良好的社会效益和巨大的经济效益。

用法用量：口腔用药或外用5～10g生药/d；口服10～20g生药/d。

具体实施方式

实施例1

紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇1倍，提取2次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

实施例2

紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇2倍，提取3次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

实施例3

紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇3倍，提取4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

本发明紫景天还可分别采取下列方法制得：

紫景天干燥药材，加水煎煮，煎煮液用石油醚脱脂后，用正丁醇1～3倍，提取2～4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

紫景天干燥药材，用60％～80％乙醇1～3倍，回流提取2～4次，乙醇液回收乙醇，浓缩至无醇味，水液用石油醚脱脂后，用正丁醇1～3倍，提取2～4次，合并正丁醇液，回收正丁醇浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。

实验例：紫景天总黄酮的药效学研究

采用丝线结扎加感染牙龈卟啉单胞菌复合法制备“大鼠实验性牙周炎模型”，观察药物对牙周炎大鼠的影响；同时采用鼠耳肿胀法、足趾肿胀法、热板法、醋酸扭体法及玻片法观察该药抗炎、镇痛和止血作用；并进行了体外抑菌实验。结果表明本品可明显减少实验性牙周炎大鼠牙龈指数、龈沟出血指数，增加血液中SOD、GSH，降低MDA含量，减轻牙周组织病理改变；可明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀及大鼠角叉菜胶性足肿胀，显著延长小鼠热疼痛反应时间，减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，并可缩短小鼠断尾出血时间及凝血时间；对牙龈卟啉单胞菌、放线共生放线杆菌、产黑色素拟杆菌均有较好的抑菌效果。

试验目的按照中药新药研究指南要求，根据中医药理论和该药的功能主治，运用现代科学方法，选用或建立与中医“证”或“病”相符或相近似的动物模型和实验方法，研究紫景天总黄酮的主要药理作用，对该药的有效性作出科学的评价，为其临床应用提供科学依据。

实验材料

药物紫景天总黄酮：6、3、1.5g生药/ml，由吉林省中医药科学院制剂室提供，批号：20071220。阳性对照药复方牙痛酊，贵州同济堂制药有限公司生产，批号：20070509。三七片，沈阳中药制药有限公司，生产，批号：20071219。

实验菌株国际标准株：放线共生放线杆菌ATCC24523。临床分离株：放线共生放线杆菌16株，牙龈卜啉菌13株，变形链球菌26株，产黑色素拟杆菌11株。由吉林大学微生物研究室提供。

试剂SOD试剂盒，南京建成生物工程制品研究所，批号：20080223。MDA试剂盒，南京建成生物工程制品研究所，批号：20080213。GSH试剂盒，南京建成生物工程制品研究所，批号：20080213。二甲苯，中国人民解放军第九零六六工厂，批号：960525。冰醋酸，北京化工厂生产，批号：20041008。

仪器磨牙机，吉林大学中日联谊医院口腔科提供。GJ-8402型热板测痛仪。

动物昆明种小白鼠，体重19～21g或25～28g，雌雄均用；Wistar大鼠，体重180～280g，雌雄各半，均由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。合格证号：2003-0001。

实验方法与结果

一、对大鼠“实验性牙周炎”的治疗作用

参照文献方法并加以改进制备“实验性牙周炎”模型，取Wistar大鼠50只，雌雄均用。取出8只为正常对照组，剩余动物以3％水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，剥离上颌牙龈，将4号无菌丝线先加入到0.5个麦氏单位牙龈卟啉单胞菌的菌液中2h，使丝线上带有足够的细菌，双股穿过大鼠第一和第二磨牙间隙，在颊侧打结3次，再绕过第一磨牙，于腭侧第一磨牙和第二磨牙间结扎并打结3次，以使结头足够大，能够持续刺激牙龈。并分别将结头埋入两侧牙龈下，在实验的第3、5和7天3次将0.5个麦氏单位牙龈卟啉单胞菌的2μL盐水注射到颊腭侧埋有丝线结头的龈下，每日用30％蔗糖水喂养。从第3周开始观察牙龈红肿、糜烂、溢脓、探诊出血等症状，并按国际通用标准评价牙龈指数记录牙龈指数(判定标准分为4级，0为牙龈健康；1为牙龈轻度炎症，牙龈的色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2为牙龈中度炎症，牙龈红色，水肿光亮，探诋出血；3为压印严重炎症，牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向)及龈沟出血指数(判定标准共记6级，0为龈缘和龈乳头外观健康，轻探龈沟后不出血；1为龈缘和龈乳头呈轻度炎症，轻探龈沟后不出血；2为牙龈呈轻度炎症，有颜色改变，探诊后点状出血；3为牙龈呈中度炎症，有颜色改变和轻度水肿，探诊后出血，血在龈沟内扩延；4为牙龈呈中度炎症，探诊后出血，血溢出龈沟；5为牙龈有色的改变，明显肿胀，有时有溃疡，探诊后出血或自动出血)。第4周随机取动物两只，处死，取上颌磨牙及其牙周组织进行病理组织学检查，以确认模型成立。第5周开始按表1所示剂量牙龈涂擦给药，每日2次，次间隔8h，连续涂药14天，正常对照组和模型组均给予基质。于给药后第15天，以3％水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，观察并记录药后牙龈指数及龈沟出血指数，然后腹主动脉取血，测量血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、丙二醛含量(MDA)，同时取上颌磨牙及其牙周组织，进行X射线摄片及病理组织学检查。结果见表1～表3。

1、紫景天总黄酮治疗给药对实验性牙周炎大鼠牙龈指数、龈沟出血指数的影响

表1.紫景天总黄酮治疗给药对实验性牙周炎大鼠牙龈指数、龈沟出血指数的影响(n＝8，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表1结果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml和牙痛酊均可明显降低牙龈指数及龈沟出血指数，明显减轻牙周炎损伤程度，对大鼠“实验性牙周炎”有明显的治疗作用。紫景天总黄酮对实验性牙周炎保护作用略强于牙痛酊。

2、紫景天总黄酮治疗给药对实验性牙周炎大鼠血清中SOD、GSH、MDA的影响

表2.紫景天总黄酮治疗给药对实验性牙周炎大鼠血清中SOD、GSH、MDA的影响(n＝8，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表2结果可见，模型组血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶比对照组明显降低，丙二醛含量明显升高，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml和牙痛酊均可明显升高大鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，降低丙二醛含量。表明紫景天总黄酮及牙痛酊均可明显减轻对大鼠“实验性牙周炎”的损伤程度，对实验性牙周炎具有显著的治疗作用。紫景天总黄酮作用略强于牙痛酊。

3、外观行为观察及病理组织学检查

(1)外观行为正常对照组体重逐渐增加，毛泽光亮，饮食饮水正常，神态、活动正常；模型组动物造模后逐渐出现皮毛疏松不顺，食欲不振，体重下降；经过14天给药，给药组可见动物神态、活动逐渐恢复，食欲增加，体重亦有所增加。

(2)病理组织学检查

肉眼观察：正常对照组动物牙龈呈粉红色，龈缘菲薄且紧贴牙面；模型组动物牙龈肿胀暗红，牙周袋逐渐形成、加深，牙龈触之易出血，两周后牙周袋进一步加深，牙周袋有食物残渣，牙龈组织糜烂，溢脓。第4周处死两只动物，取牙及牙周组织进行病理组织学检查，确认“牙周炎模型”复制成功。第五周开始给药，模型组动物组牙龈组织出血、糜烂、溢脓等症状进一步加深；给药组动物牙龈颜色变浅，出血减少，牙周袋变浅。

病理组织学检查：正常大鼠牙周软组织、牙周膜附着正常，牙槽骨骨小梁排列紧密，未见骨吸收破坏。模型组大鼠牙周软组织有大量炎细胞浸润；上皮部分向根方向增生，形成深牙周袋；牙槽骨出现骨吸收陷窝，骨吸收破坏明显，模型组大鼠出现中重度牙周炎症状。与模型组相比，阳性药牙周组织有炎细胞浸润，但有所减轻。紫景天总黄酮中小剂量组病理变化与阳性药相似；高剂量组软组织炎细胞浸润明显减轻，牙周袋变浅或消失，牙槽骨破坏处于静止状态，牙槽骨周围有大量的成骨细胞增生，显示牙周组织正处于修复阶段。

同时对牙周组织炎症情况进行分级评分：0：无炎症反应；1：牙周膜血管轻度充血、出血，炎症细胞轻度浸润，破骨细胞偶见或无；2：牙周膜血管明显扩张充血、出血，炎症细胞中度浸润，膜增宽或部分消失，可见少量破骨细胞，牙槽骨轻度吸收；3：牙周膜炎症细胞重度浸润，有脓肿形成，破骨细胞大量浸润，牙骨质及牙槽骨吸收明显。

表3.紫景天总黄酮治疗给药对大鼠实验性牙周炎炎症分级病理评分的影响(n＝8，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表3结果可见，紫景天总黄酮及牙痛酊均可明显减轻“实验性牙周炎”大鼠牙周组织损伤程度。

4、X摄片结果：正常组动物牙齿排列紧密、牙槽骨致密、骨硬板清晰可见。模型组动物牙槽骨吸收明显，牙槽骨重度吸收，吸收边缘清晰，硬骨板消失，一二磨牙间隙变宽，有些牙槽骨吸收严重，深达牙根。阳性药组和给药各剂量组可见骨吸收，较模型组明显减轻，骨硬板可见，但较正常组模糊。

二、对大鼠“实验性牙周炎”预防保护作用

取Wistar大鼠48只，雌雄均用。取出8只为正常对照组，剩余动物同前方法制备大鼠“实验性牙周炎”模型，从第3周开始观察牙龈红肿、糜烂、溢脓、探诊出血等症状，记录牙龈指数及龈沟出血指数(判定标准同前)。第3周开始按表4所示剂量牙龈涂擦给药，每日2次，次间隔8h，连续给药14天，正常对照组和模型组均给予基质。于药后第15天以3％水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，。记录药后牙龈指数及龈沟出血指敱后，腹主动脉取血，测量血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、丙二醛含量(MDA)，取上颌磨牙及其牙周组织，进行X射线摄片及病理组织学检查。结果见表4～6。

1、紫景天总黄酮预防给药对实验性牙周炎大鼠牙龈指数、龈沟出血指数的影响

表4.紫景天总黄酮预防给药对实验性牙周炎大鼠牙龈指数、龈沟出血指数的影响(n＝8，)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表4结果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml和牙痛酊均可明显降低牙龈指数及龈沟出血指数，明显减轻牙周炎损伤程度，对大鼠“实验性牙周炎”有明显的预防作用。紫景天总黄酮对实验性牙周炎作用略强于牙痛酊。

2、紫景天总黄酮预防给药对实验性牙周炎大鼠血清中SOD、GSH、MDA的影响

表5.紫景天总黄酮对实验性牙周炎大鼠血清中SOD、GSH、MDA的影响(n＝8，)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表5结果可见，模型组血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶比对照组明显降低，丙二醛含量明显升高，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml和牙痛酊均可明显升高大鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，降低丙二醛含量，表明紫景天总黄酮及牙痛酊均可明显减轻大鼠“实验性牙周炎”的损伤程度，对实验性牙周炎具有显著的预防作用，且紫景天总黄酮作用略强于牙痛酊。

3、外观行为观察及病理组织学检查

(1)外观行为正常对照组体重逐渐增加，毛泽光亮，饮食饮水正常，神态、活动正常；模型组动物造模后逐渐出现皮毛疏松不顺，食欲不振，体重下降；给药组动物可见动物神态、活动很快恢复，食欲增加，体重亦增加，饮食饮水及行为活动均较快恢复正常。

(2)病理组织学检查

肉眼观察：正常对照组动物牙龈呈粉红色，龈缘菲薄且紧贴牙面；模型组动物牙龈肿胀暗红，牙周袋逐渐形成、加深，牙龈触之易出血，两周后牙周袋进一步加深，牙周袋有食物残渣，牙龈组织糜烂，溢脓。第三周开始给药。模型组动物组牙龈组织出血、糜烂、溢脓等症状进一步加深；给药组动物牙龈颜色变浅，出血减少，牙周袋变浅，逐渐恢复正常。

病理切片观察：病理检查结果：正常大鼠牙周软组织、牙周膜附着正常，牙槽骨骨小梁排列紧密，未见骨吸收破坏。模型组大鼠牙周软组织有大量炎细胞浸润；上皮部分向根方向增生，形成深牙周袋；固有层血管扩张，部分胶原变性溶解，牙槽嵴顶及深部固有牙槽骨表面出现较多破骨细胞牙槽骨出现，骨吸收陷窝，骨吸收破坏明显，模型组大鼠出现中重度牙周炎症状。与模型组相比，阳性药牙周组织有炎细胞浸润，但有所减轻。紫景天总黄酮中小剂量组病理变化与阳性药相似；高剂量组软组织炎细胞浸润明显减轻，牙周袋变浅或消失，牙槽骨破坏处于静止状态，牙槽骨周围有大量的成骨细胞增生，未见骨吸收陷窝，骨吸收破坏不明显。同样按上法对牙周组织炎症情况进行分级评分(评分标准略)。

表6紫景天总黄酮预防给药对大鼠实验性牙周炎炎症分级病理评分(n＝8，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表3结果可见，紫景天总黄酮及牙痛酊均可明显减轻“实验性牙周炎”大鼠牙周组织损伤程度。

4、X摄片结果：正常组动物牙槽骨无骨吸收，硬骨板可见。模型组动物牙槽骨吸收明显，牙槽骨重度吸收，吸收边缘清晰，硬骨板消失。阳性药组和给药各剂量组可见骨吸收，但较模型组明显减轻。

三、抗炎作用

1、紫景天总黄酮对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

取昆明种小鼠50只，雄性，随机等分为五组，按表7所示剂量均匀涂抹左耳前后两面，模型对照组给予基质，每日2次，次间隔8h，连续5日，于末次给药后1小时，将0.05ml二甲苯均匀涂于小鼠左耳前后两面，并于0.5h后致炎部位加强给药1次，4小时后脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳片，用直径为9mm打孔器，分别在同一部位打下圆耳片，于电子天平上称重，以左耳重与右耳重之差为肿胀程度。结果见表7。

表7紫景天总黄酮对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表7果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml及牙痛酊均可明显减轻小鼠耳肿胀程度，对二甲苯所致小鼠耳肿胀有显著的抑制作用，并有一定的量效关系。

2、紫景天总黄酮对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

取Wistar大鼠50只，雄性，随机等分为五组，按表8所示剂量均匀涂抹足部，模型对照组给予基质，每日2次，次间隔8h，连续5日，于末次给药后1小时，于每只大鼠右后足跖部皮下注射1％生理盐水角叉菜胶混悬液0.1ml，同时注射部位涂抹给药一次。在给致炎剂后1、2、3、4、5、6h分别测量大鼠右后足踝关节及足跖周长一次，左后足作对照，并以左、右足踝关节和足跖周长和之差为肿胀程度^[3]。结果见表8。

表8.紫景天总黄酮对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表8结果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml及牙痛酊于致炎后1～6h均可明显抑制角叉菜胶引起的大鼠足肿胀，并随给药剂量的增加，其作用强度明显增强、持续时间明显延长。在致炎后5～6h紫景天总黄酮1.5g生药/ml给药组与模型组比较无显著差异。

3、紫景天总黄酮对小鼠毛细血管通透性的影响

取昆明种小鼠60只，雌雄各半，腹部脱毛后随机等分为六组，按表9所示剂量皮肤涂抹给药，正常对照组、模型对照组均给予基质，每日2次，次间隔8h，连续5日，末次给药后1小时后各鼠均尾静脉注射0.5％伊文思兰生理盐水溶液0.1ml/10g体重，随即腹腔注射0.7％醋酸0.1ml/10g体重，正常对照组注射生理盐水，20分钟后脱颈椎处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6ml生理盐水分数次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液，合并后加入生理盐水至10ml，3000r/min离心15分钟，取上清液于590nm处比色测定。结果见表9。

表9.对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表9结果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml及牙痛酊均可明显降低小鼠腹腔毛细血管通透性，减少致炎后伊文思兰渗出，并随给药剂量的增加，其作用强度增强。表明本品具有明显的抗炎作用。

四、镇痛作用

1、紫景天总黄酮对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

采用“醋酸扭体法”，取昆明种小鼠50只，雌雄各半，腹部脱毛后随机等分为五组，按表10所示剂量皮肤涂抹给药，模型对照组给予基质，每日2次，次间隔8h，连续5日。于末次给药后1小时，每只鼠腹腔注射0.7％冰醋酸溶液0.1ml/10g，记录注射后5～15分钟内的扭体反应次数。结果见表10。

表10.紫景天总黄酮对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(

，n＝10)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表10结果可见，紫景天总黄酮6、3g生药/ml及牙痛酊均可明显减少小鼠扭体次数，对醋酸引起的小鼠扭体反应有显著的抑制作用。1.5g生药/ml虽有一定的抑制作用，但与模型对照组比较无明显统计学意义。

2、紫景天总黄酮对热刺激所致小鼠疼痛反应的影响

采用“热板法”，选取合格(痛域值<5s或>30s者剔除)雌性小鼠50只，随机等分为五组，按表11所示剂量皮肤涂抹给药，正常对照组给予基质，每日2次，次间隔8h，连续5日。于末次给药后1、2、4h各测痛阈值一次。以动物投入热板至出现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，超过60秒以60秒计算。结果见表11。

表11.紫景天总黄酮对热板法测小鼠痛阈值的影响(

，n＝10)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表11结果可见，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml于药后1h即可明显延长小鼠热刺激引起的疼痛反应时间，并可持续4h以上。而牙痛酊于药后2h才有明显作用，其起效时间较紫景天总黄酮慢。

五、止血作用

1、对出血时间的影响

采用“小鼠断尾法”，取小鼠50只，雌雄各半，腹部脱毛后随机等分为五组，按表12所示剂量腹部涂抹给药，正常对照组给予基质，每日2次，次间隔8h；三七片灌胃给药20ml/kg，每日1次，连续5日。末次给药后1h，各鼠分别在距尾尖3mm处剪断，血液自然溢出开始计时，用滤纸每隔30s轻吸流出的血液，直至出血自然停止，记录出血时间，结果见表12。

表12.紫景天总黄酮对小鼠断尾出血时间的影响(

，n＝10)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表12结果可见，紫景天总黄酮和三七片均可明显缩短小鼠断尾出血时间，且随剂量增加作用增强，表明本品对小鼠断尾出血有良好的止血作用。

2、对凝血时间的影响

采用“玻片法”，取小鼠50只，雌雄各半，腹部脱毛后随机等分为五组，按表13所示剂量腹部涂抹给药，正常对照组给予基质，每日2次，次间隔8h；三七片灌胃给药0.78g/kg，每日1次，连续5日。末次给药后1h，将各鼠右眼球摘除，弃去第一滴血，滴2滴血于载玻片上(直径5mm)，自血液滴出开始计时，每隔30s用清洁的大头针自血滴边缘向里挑动1次，并观察有无血丝挑起，另一滴作复检，记录自血滴出至血丝出现的时间即为“凝血时间”。

表13.对凝血时间的影响(

，n＝10)

注：与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表13结果可见，紫景天总黄酮和三七片均可明显缩短小鼠凝血时间，且随剂量增加作用增强，表明本品对小鼠有良好的促进凝血作用。

六、体外抑菌试验

1、最低抑菌浓度(MIC)的测定(采用平皿稀释法)

1)将替硝唑配制成不同浓度分别加入血液琼脂培养基中，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25mg/ml。

2)复方牙痛町采用体积浓度(v/v)，将不同体积的药品分别加入血液琼脂培养基中，使其终浓度体积比为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125％。

3)紫景天总黄酮呈棕色胶状物，溶于水除菌过滤后，配制80mg/ml的原始浓度，经倍比稀释后，分别加入血液琼脂培养基中，使其终浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062mg/ml。上述细菌用PY肉汤稀释至0.5麦氏管浓度，用接种环取菌液一环接种于含药物的培养基上，37℃厌氧培养48小时观察结果。以无细菌生长的平皿中所含药物的最小浓度为最低抑菌浓度，并分别计算MIC₅₀和MIC₉₀，结果见表14。

表14紫景天总黄酮对牙周炎易感菌的影响

由表14结果可见，紫景天总黄酮对放线共生放线杆菌最低抑菌浓度为4mg/ml，对牙龈卜啉菌最低抑菌浓度为4mg/ml，对产黑色素拟杆菌最低抑菌浓度可达2mg/ml，对变形链球菌最低抑菌浓度为8mg/ml，说明对牙龈卜啉菌、放线共生放线杆菌、产黑色素拟杆菌均有较好的抑菌疗效。

3结论

实验结果表明，紫景天总黄酮6、3、1.5g生药/ml预防性给药和治疗性给药均可明显减轻“实验性牙周炎”大鼠牙龈指数、龈沟出血指数，提高SOD、GSH活性，明显降低血MDA含量，减轻牙周病理损伤，减少牙槽骨吸收，对大鼠“实验性牙周炎”有明显的预防和治疗作用。本品尚可明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀和角叉菜胶引起的大鼠足肿胀，显著延长热刺激所致小鼠疼痛反应时间，减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，显著缩短出血和凝血时间，表明该药兼有抗炎、镇痛和止血作用。体外抑菌实验结果表明，紫景天总黄酮对牙龈卜啉菌、放线共生放线杆菌、产黑色素拟杆菌均有较好的抑菌效果，即对牙周炎易感菌具有明显的抑制作用。可见，紫景天总黄酮对牙周炎具有“标本兼治”的治疗作用，同时未见明显的毒副作用。

4讨论

牙周病的主要特征为牙周袋形成，牙龈红肿出血，牙齿松动甚至脱落，X线检查可见不同程度的牙槽骨吸收影像。牙周病的病因尚未完全阐明，现代医学认为牙周病是多因素导致疾病，菌斑细菌及其产物是引发牙周病的始动因子，年龄、遗传因素、内分泌失调、精神压力、吸烟、牙结石、食物嵌塞等均是牙周病的相关因素。细菌及其毒性产物如细菌内毒素和细菌酶可直接损伤牙周上皮及结缔组织，同时又可激活宿主的防御细胞，释放多种炎症介质、细胞因子，这些产物又导致了牙周组织的继发性损伤。此外，宿主的免疫状态、遗传因素等对牙周炎的发生、发展也有重要作用，宿主对细菌微生物的易感性和宿主的应答反应都与牙周炎发生、发展密切相关。牙周病的细菌学研究证明该病是由细菌感染的一组疾病，特别是牙龈卟啉单胞菌、中间型普氏菌和具核梭形杆菌在牙周病中起到重要作用。

本实验采用局部结扎法引起局部菌斑堆积，用牙龈卟啉单胞菌为致病始动因子，利用双股丝线多次打结固定，并高糖水喂养。用带菌丝线既可减少对牙龈的损害，又有利于牙龈对细菌的吸收，再用高糖水喂养，能够建立一种稳定、重复率高、可用于各种牙周病实验研究的牙周炎动物模型。为了防止带菌丝线脱落，由以往的双侧各打一结，改为双侧各打三结，还作为异物嵌塞对牙周组织有损伤作用，将几种牙周炎的致病因素结合一起成功地建立了“大鼠实验性牙周炎模型”。

目前西医常采用抗生素治疗，但疗效不显著，且易产生副作用，紫景天总黄酮为纯中药制剂，具有明显的抗炎、止血、抑菌作用，兼有“标本兼治”的作用，同时其毒性较小，无不良反应和毒副作用。古代中医认为胃热、肾虚是牙周病发病的主要因素；现代中医药对牙周病的研究认为牙周病的发生除与局部因素作用有关外，还与全身因素密切相关，这与西医的观点是一致的。紫景天具有清热解毒，收敛止血，消肿生肌功效。现代医学研究亦表明紫景天有抗炎镇痛和调节免疫功能的作用，还能消除或减轻蛋白代谢障碍，敛疮生肌，促进溃疡愈合。

SOD、GSH是体内天然自由基清除剂，其水平标志着自由基清除能力；MDA通过反映体内过氧化程度即氧自由基水平来间接反映细胞损伤程度。在牙周炎活动期，局部毛细血管通透性升高，导致牙龈出血、肿痛，同时有大量吞噬细胞进入局部组织，在吞噬细胞的膜结构中存在产生氧自由基的酶系统，该酶可被细菌及骨毒素、抗原抗体复合物等激活，产生吞噬作用，使耗氧量激增。其增加的耗氧量基本上都用于生成超氧阴离子。通过自由基链反应又生成其他自由基，引起脂质过氧化，形成过多脂质过氧化物，损伤生物膜。脂质过氧化物分解产物MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。SOD能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤。在牙周炎活动期，局部组织产生大量自由基，由于强氧化作用损伤SOD活力或由于超氧阴离子生成增多，使SOD消耗增加，因而SOD活力下降。GSH-Px的主要功能是清除各种生物大分子的过氧化物，因此，在牙周炎症期GSH-Px活力明显下降。紫景天总黄酮可显著提高SOD、GSH活性，明显降低血MDA含量，提示其同时具有清除氧自由基的抗氧化作用。

本实验结果表明，紫景天总黄酮可明显减轻“实验性牙周炎”大鼠牙龈指数、龈沟出血指数，提高SOD、GSH活性，明显降低血MDA含量，减轻牙周病理损伤，减少牙槽骨吸收，对大鼠“实验性牙周炎”有明显的预防和治疗作用。本品尚可明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀和角叉菜胶引起的大鼠足肿胀，显著延长热刺激所致小鼠疼痛反应时间，减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，显著缩短出血和凝血时间，表明该药兼有抗炎、镇痛和止血作用。体外抑菌实验结果表明，紫景天总黄酮对牙龈卜啉菌、放线共生放线杆菌、产黑色素拟杆菌均有较好的抑菌效果。

上述药理作用为紫景天总黄酮止血止痛，抗炎消肿抑菌，临床上用于治疗牙周炎提供了药理学依据。

经紫景天总黄酮急性毒性实验结果表明，给小鼠灌胃46.7％紫景天总黄酮40ml/kg，1日1次或1日2次，剂量分别为18.7g/kg和37.4g/kg(折合生药量为1400g/kg或2800g/kg)，观察7日。小鼠饮食、活动、体重、粪便、皮毛光泽度均正常，鼻、眼、口腔无异常分泌物，无毒性反应，无死亡。处死，解剖肉眼观察心、肝、脾、肺、肾均无明显改变。按公斤体重计算分别相当临床(成年人按70公斤计算)剂量的12250倍或24500倍均无明显毒性反应。表明紫景天总黄酮毒性很低。

Claims (1)

1.紫景天总黄酮在制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物中的应用，所述紫景天总黄酮是由下列方法制得的：

紫景天鲜茎叶捣碎轧炸取汁，取轧炸汁用石油醚脱脂后，用正丁醇1～3倍，提取2～4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浓缩蒸干、干燥后得总黄酮。