CN104774924A - 用玻璃覆盖的生物学试剂的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备干燥的试剂制剂的方法,该方法包括步骤:提供至少一种经缓冲的生物学试剂的水溶液;将形成玻璃的填充材料与经缓冲的试剂溶液混合来形成其中填充材料的浓度足以促进玻璃状多孔组合物形成的混合物;将混合物以基本上均匀的滴的形式分配入多孔容器的孔中,其中单个滴分配入各个孔;干燥容器中的滴来形成试剂制剂。试剂制剂是水溶性的且具有对于室温稳定性是足够的Tg。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日为2007年9月13日,申请号为200780034507.7(PCT/US2007/078376),发明名称为“用玻璃覆盖的生物学试剂的制备”。
交叉参考相关申请
本申请要求2006年9月18日提交的美国临时专利申请号60/845,307和2007年1月31日提交的60/887,364(其公开内容以其全文并入本文作为参考)的优先权。
发明领域
本发明涉及生物学材料和试剂以玻璃状、多孔状态长期贮存。特别地,其涉及使用多孔板制备这些材料和试剂和其贮存的方法。
发明背景
少数生物学活性材料足够稳定,从而它们可在室温下进行分离、纯化且然后在溶液中贮存。一般地,将生物学试剂贮存在保持在4℃、-20℃或-70℃的甘油溶液中。可将它们散装(in bulk)贮存,然后在使用前与其他试剂组合。
在制备用于生物学样品的便利和有效的测试的试剂中,经常重要的是获得均匀、预估量(discreet amount)的干燥的化学掺合物。用于稳定生物学试剂的载体或填充物的一种类型是形成玻璃的填充材料。将生物学试剂溶液并入形成玻璃的填充材料(所述材料是水溶性或水溶胀性物质)。然后将它们干燥以产生固定和稳定生物学试剂的玻璃状组合物。关于用于稳定生物学试剂的形成玻璃的填充材料参见US 5,098,893、US5,200,399和US 5,240,843。
碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽三糖是重要的形成玻璃的物质组。可使用其他多羟基化合物例如碳水化合物衍生物如山梨糖醇和经化学修饰的碳水化合物。另一类重要的形成玻璃的物质是合成的聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺。
形成玻璃的物质的另外的实例包括糖类共聚物例如由GEHealthcare在注册商标FICOLLTM下销售的那些糖类共聚物。FICOLLTM具有5,000至1,000,000的分子量且包含通过醚桥键与双功能基团连接的蔗糖残基(US 3,300,474)。此种基团可以是2、3或更多个碳原子但通常不超过10个碳原子的亚烷基。双功能基团用于将糖残基连接在一起。此种聚合物可以例如通过糖与卤代醇或双环氧(bis-epoxy)化合物的反应来制备。
碳水化合物聚合物的玻璃状基质中的经稳定的生物学材料可以通过冷冻干燥(Treml等人US 5,593,824;Franks和Hatley US 5,098,893)或通过真空干燥(Walker等人US 5,565,318)来制备。这些水溶性试剂方便地用于复杂的分子生物学应用。该方法具体用于由以单次使用的等分试样分配的酶、核苷酸和其他组分组成的试剂系统。玻璃状基质的重建递送用于应用(包括DNA扩增和DNA测序)的经缓冲的酶。
目前在市场上存在许多干燥的分子生物学产品。然而,这些产品中的一些通过相当麻烦且包括大量的手工劳动的方法来制备。其他产品当干燥时需要冷冻。存在对用于产生环境温度干燥的试剂的改进方法的需要。
发明概述
在本发明的第一方面,提供了产生干燥的试剂制剂的方法。该方法包括步骤:提供至少一种经缓冲的生物学试剂的水溶液;将形成玻璃的填充材料与经缓冲的试剂溶液混合来形成其中填充材料的浓度足以促进玻璃状多孔组合物形成的混合物;将预先确定量的混合物分配入多孔容器的孔;将容器中的混合物干燥以形成干燥的试剂制剂;其中所述试剂制剂是水溶性的且具有对于室温稳定性是足够的Tg。混合物优选是均一的溶液。
在本发明的一个实施方案中,将干燥的试剂制剂收集入试剂瓶中以用于延长的室温贮存。
在本发明的另一个实施方案中,将干燥的试剂贮存于多孔容器中以进行延长的贮存,用密封带密封容器的顶部。任选地,密封带是热激活的。
根据本发明的多孔容器可以是二氧化硅塑模(silica mould)或聚苯乙烯板。当多孔容器是聚苯乙烯板时,本发明还包括在冻干前将聚苯乙烯板置于金属塑模上,从而各聚苯乙烯板孔的外壁与所述金属塑模的孔紧密接触以进行有效的热传递。我们发现这改进了干燥方法且产生了具有提高的完整性的干燥的试剂。
在本发明的另一个方面,本发明提供了根据上述方法制备的干燥的生物学试剂组合物。
根据本发明制备的试剂组合物是水溶性的且具有对于持室温稳定性是足够的Tg。优选地,试剂组合物具有结构完整性。
生物学试剂组合物能够在短于1分钟,优选30秒内完全溶解在25μl水溶液中。试剂组合物优选具有低于10%的含湿量。
试剂组合物可具有至少一种当于室温下在水溶液中单独存在时不稳定的试剂。试剂组合物还可包含多种当在室温下于水溶液中存在时相互之间可以反应或可以不反应的试剂。
因此,本发明的目的和优点是提供干燥的生物学试剂组合物和产生所述组合物的方法。
根据下列描述,本发明的这些和其他目的以及优点将变得显而易见。然而,该描述仅仅是优选实施方案。因此,应当依赖权利要求来估计本发明的整个范围。
附图描述
图1显示用于按照本发明的实施方案制备干燥的试剂制剂的方法的方法工作流程。
图2显示,从左上角开始:用于按照本发明的实施方案制备干燥的试剂制剂的方法的384孔聚苯乙烯板;右上角:显示具有1千万拷贝至1000拷贝的起始浓度的不同量的λDNA作为模板的标准曲线,包括无模板对照;左下角:从384孔聚苯乙烯板制备的贮存在塑料瓶中的干燥的试剂制剂饼/立方块(cube);右下角:显示干燥的试剂制剂成功地用于λDNA实时qPCR扩增反应的扩增图。
图3显示,从左上角开始:用于按照本发明的实施方案制备干燥的试剂制剂的方法的96孔二氧化硅塑模;右上角:显示具有1千万个拷贝至1000个拷贝的起始浓度的不同量的λDNA作为模板的标准曲线,包括无模板的对照;左下角:从96孔二氧化硅塑模制备的贮存在塑料瓶中的干燥的试剂片剂;右下角:显示干燥的试剂制剂成功地用于λDNA实时qPCR扩增反应的扩增图。
图4显示包含PCR制剂的96孔PCR板在冻干前进入金属支架(metal holder)。
图5显示不同形式的按照本发明的的实施方案制备的室温稳定的PCR试剂。左上角:瓶中的干燥的PCR混合物。右上角:96孔板中的干燥的PCR混合物。左下角:384孔板中的干燥的PCR混合物。右下角:96孔穿孔板(perforated plate)中的干燥的PCR混合物。
图6显示按照本发明的实施方案制备的干燥的PCR试剂的稳定性。干燥的PCR混合物用于λDNA的qPCR。对于(1)‘湿’制剂珠混合物(左上方)、(2)使用当前规程制备的干燥的饼(右上方)和(3)来自GEHealthcare的puRe taq Ready-To-GoTM(RTG)PCR珠(左下方),注意到相似的性能。右下方:一式三份进行的上述三个反应的Ct值和PCR效率。新形式和pure Taq珠的Ct值和PCR效率值是相当的。
图7显示按照本发明的实施方案制备的干燥的PCR试剂的稳定性。将干燥的PCR混合物于40℃和室温(RT)下贮存8天。将干燥的试剂用于λDNA的qPCR,具有相似的性能。左上角:于RT下贮存的干燥的PCR试剂饼(reagent cake)。右上角:于40℃下贮存的干燥的PCR试剂饼。左下角:于RT下贮存的puRe Taq珠(GE Healthcare)。右下角:于40℃下贮存的puRe Taq珠。
图8显示一式两份进行的上述四个反应的Ct值和PCR效率。当前形式和pure Taq珠的Ct值和PCR效率值在40℃和室温下是相当的。
图9显示按照本发明的一个实施例的实时PCR反应的结果。左上图:使用冻干的试剂包括TaqMan引物和探针的实时PCR。左下图:冻干的试剂对照(TaqMan引物和探针未冻干,其他试剂如实施例1中一样进行冻干)。右上图:商业puRe Taq RTG珠对照(所有其他试剂未进行冻干)。当puRe Taq RTG反应用于产生标准曲线而将其他反应视为未知的时,具有等量的模板DNA的反应落在标准曲线上(右下图,“X”表示“未知的”)。
图10显示Phi29DNA聚合酶以冻干的形式是稳定的。进行使用冻干的试剂或“湿”混合物进行的全基因组扩增测定。在即使使用已在40℃下贮存35天的冻干的试剂的情况下,检测到强烈的扩增。
图11显示与常规的“湿”试剂盒(Roche IVT)相比,使用冻干的IVT试剂(A、B、C)进行的DNA模板的成功转录。ntc:无模板对照。
发明详述
生物学试剂
许多生物学试剂适合通过本发明的方法来贮存。本发明的生物学试剂组合物特别适合用于进行许多种有益地或必需地对血浆或稀释的血浆进行的分析程序。分析程序通常需要将血浆与一种或多种试剂球(reagent sphere)组合,从而在血浆中发生可与血浆的特定组分或特征的测量相关的一些光学上可检测的变化。优选,血浆将经历导致可通过常规分光光度计、荧光计、光检测器等测量的改变的颜色、荧光、发光等的反应或其他变化。在一些情况下,可进行免疫测定和其他特异性结合测定。
可对其应用本发明的其他类别的生物学试剂是蛋白质和肽,包括其衍生物例如糖蛋白。此种蛋白质和肽可以是任何酶、转运蛋白(transportprotein)(例如血红蛋白、免疫球蛋白、激素、血液凝固因子(blood clottingfactor)和药理活性蛋白或肽)。
可对其应用本发明的另一种类别的生物学试剂包括核苷、核苷酸(例如脱氧核苷酸、核糖核苷酸和双脱氧核苷酸)、二核苷酸、寡核苷酸和还有酶辅因子,无论这些是否是核苷酸。酶底物通常也是可对其应用本发明的生物学试剂。
用于在贮存中稳定的生物学试剂可从天然来源,动物、植物、真菌或细菌分离,或可通过从通过发酵和人工培养生长的细胞产生和从其分离。此种细胞可以是或可以不是遗传转化的细胞。
本发明的另一个发展是在玻璃试剂球中贮存反应系统的超过一种试剂。这可用于将需要在例如测定或诊断试剂盒中一起使用的材料。
在单个玻璃状制剂中贮存试剂以对于最终的用途方便的形式提供它们。例如,如果测定需要底物或辅因子和酶的组合,那么可将两种或所有这三种物质以需要的浓度比贮存在玻璃状试剂球中和准备好用于测定。
如果贮存多种试剂,则可将它们在水性乳剂中混合在一起,然后一起并入玻璃中。备选地,可单个地将它们并入分开的玻璃中,所述分开的玻璃之后被混合在一起。
当作为单个组合物(其可以是混合在一起的两种玻璃)贮存多种试剂时,一种或多种试剂可以是蛋白质、肽、核苷、核苷酸或酶辅因子。试剂还可能可以是更简单的种类。例如,标准测定程序可能需要丙酮酸盐和NADH存在于一起。两者都可以以可接受的稳定性单独贮存。然而,当一起置于水溶液中时,它们开始反应。如果以需要的比例一起置于玻璃状试剂球中时,它们不反应,且玻璃可被贮存。关于反应,我们是指任何生物化学反应。
本发明的优选生物学试剂是提供试剂系统以检测、扩增、修饰或测序核酸的酶和辅因子。此种酶包括但不限于DNA聚合酶(例如克列诺(Klenow))、T7DNA聚合酶或各种热稳定性DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶;AMV或鼠逆转录酶、T4DNA连接酶、T7、T3、SP6RNA聚合酶、噬菌体Phi29DNA聚合酶和限制性内切酶。辅因子包括核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、对于酶活性必需的盐(例如镁、钾和钠)以及缓冲能力所需要的盐。缓冲盐提供了正确的pH范围且有助于稳定性。可使用的一些缓冲剂包括Tris pH 7.6-8.3。
可使用根据下文中的实施例1的规程估计任何潜在的生物学试剂。因此,使得合适的生物学试剂在试剂球中稳定,如通过功能性测试如实施例1中的功能性测试所确定的。
形成玻璃的填充材料
可用于本发明的形成玻璃的填充材料的实例包括碳水化合物例如FICOLLTM、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、DEXTRANTM和甘露糖醇;蛋白质例如BSA、明胶和胶原;以及聚合物例如PEG和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。形成玻璃的填充材料优选是FICOLLTM聚合物、BSA、蔗糖、DEXTRANTM或其组合。用于本发明的最优选形成玻璃的填充材料是FICOLLTM聚合物。
制剂
通过迭代法(iterative process)确定生物学试剂、形成玻璃的填充材料和水的高粘性混合物的制剂。首先,人们确定系统希望的终使用浓度。浓度通常以体积摩尔浓度来表示。各生物学试剂可具有不同的配方。第二,将这些浓度转变成重量/剂量基础(basis)(对于固体)和体积/剂量基础(对于液体)。
第三,选择高粘性混合物的百分比固体浓度和希望的混合物体积的初始值。55%的固体浓度已显示表现良好。高于62%的固体浓度,混合物太粘以至不能分配。如果乳剂是希望的,低于52%的固体浓度,混合物太稀,且干燥为透明和硬的。如果半乳剂是希望的,且允许10%的更低限度。关于“%的固体”,我们是指(固体重量乘以100)除以(液体重量+固体重量)。
如果允许形成玻璃的材料进入溶液,则混合物将干燥为硬的和玻璃状的。因此,希望的混合物是乳剂而非溶液。关于乳剂,我们是指饱和的混合物,从而存在两相,固相和液相。例如,本发明是生物学试剂/缓冲液中的形成玻璃的填充材料的半乳剂。固体的存在给乳剂提供了不透明至白色。当干燥时,高粘性乳剂仍然形成玻璃,但可在表面获得小孔以便水通过,且加速干燥的试剂制剂的溶解。乳剂应当具有白色。如果其是透明的,其最可能将干燥为硬的和玻璃状的,且从而,将是无孔的。关于孔隙度,我们是指干燥的制剂试剂包含帮助所述制剂溶解的气泡的袋。优选孔隙度允许制剂在大约2分钟或更少的时间内溶解。
本发明的另一种形式提供了特征在于为半乳剂的形成玻璃的填充材料和生物学试剂/缓冲液的混合物。关于该混合物,我们是指具有至少一些乳剂性质的混合物。本发明的半乳剂可通过使用上述迭代法使固体浓度达到大约10%至大约50%来形成。然后分配和干燥半乳剂来形成干燥的试剂制剂。
第四,人们计算可使用来自第二步骤的每剂量形成玻璃的材料的克数可产生的剂量的数目。
第五,使用剂量的数目和来自第二步骤的重量/剂量比,人们确定其他组分的重量/体积。最后,使用在第五步骤中确定的重量和体积,人们计算终混合物的百分比固体。如果混合物的终百分比固体在希望的范围外,则人们使用另一个初始值重复第三至第六步骤直至终值在正确的范围内。
可使用根据上述的迭代法的规程估计任何潜在的形成玻璃的材料。因此,合适的形成玻璃的材料产生了具有可接受的硬度、大小、形状、Tg、孔隙度、溶解性和稳定性的试剂制剂。
多孔容器
用于制备干燥的试剂制剂的多孔容器的实例包括聚苯乙烯板、二氧化硅塑模等。优选,多孔板是具有使得能够使用用于应用例如PCR的标准热循环仪的标准尺寸和版面设计的多孔板。
通常,多孔容器包括两个区域,孔区和边界。边界可以是任何大小、形状或厚度,但优选形成具有与标准96孔或384孔商业微量滴定板的外部大小相似的外部大小的多孔平台,其大小为宽度大约85.5mm乘长度127.75mm。
通常,板包括许多排列在网格中的空洞。这些空洞称为孔且用作个别反应的反应容器,或用于个别样品的贮存容器。孔将以二维线性阵列排列在多孔平台上。然而,孔可以以任何类型的阵列例如几何或非几何阵列提供。孔的数目可以是在这些范围内的96的倍数,优选是乘以96的整数的平方。
商业板中的孔通常经设计具有标准的间隔。96孔板具有12列和8行,相邻的孔的中心之间间隔9mm。384孔板具有24列和16行,相邻的孔的中心之间间隔4.5mm。1536孔板具有48列和32行,相邻的孔的中心之间间隔为2.25mm。也使用构成上述格式的一半的微量滴定板。还可获得的是在相邻的孔的中心之间具有相似间隔的孔带。具有这些尺寸的多孔容器可与自动机器学(robotics)和仪器例如多孔平台转位器(translocator)和读数器(如它们在本领域内所称呼的)相容。
用于制备多孔平台的材料将通常为聚合物,因为这些材料使它们适合于大多数制备技术。优选,选择已知具有低荧光或其他性质的聚合物。本领域内的各种方法可用于确认选择的聚合物具有希望的性质。聚合物材料可以显著地促进通过本领域内已知的和将来开发的模塑法例如镶嵌造型或注模法来进行板的制备。
聚合物板的备选是96孔和384孔形式的二氧化硅塑模。如下文中的实施例所显示的,96孔穿孔二氧化硅模塑的板可用于分配和冻干试剂。此处的优点是在冻干后应当可容易地从塑模取出干燥的试剂。
混合和分配
如下制备一般制剂(与实施例一样使用DNA标记制剂):
在使用前,通常对所使用的所有试剂进行高压灭菌或过滤灭菌(优选0.25μm的滤器)。制备制剂,且将其在冰上贮存直至分配。对于200ml(足以用于20,000个单剂制剂)DNA标记制剂,将各15g的Ficoll 400和Ficoll 70和20g松三糖加入大约90ml无菌水,且在搅拌板上混合直至溶解。
将50ml 20X浓缩DNA标记缓冲液(200mM Tris pH 7.5、200mMMgCl2、1M NaCl)与10ml 10mg/ml BSA溶液一起加入。加入各1ml的100mM ATP、GTP和TTP。一旦所有试剂存在于溶液中,就将制剂在冰上或在冷冻的条件下贮存直至其用于分配。紧在使用前,加入400Ku克列诺片段DNA聚合酶(原液的最低浓度应当为100Ku/ml以使甘油浓度在终制剂中保持低于1%)。同样紧在使用前,加入1200A 260个单位的d(N)9引物。在向制剂中加入前,引物应当在65℃下加热7分钟,且快速在冰上冷却。在加入酶和引物后,终体积应当使用无菌水调至200ml。终溶液的密度将为1.14g/ml。
试剂均一溶液的每分配的剂量的终体积通常小,例如5-30μl,优选10μl,以当试剂制剂溶解于工作溶液中时允许产生10-100μl的工作体积。
将预先确定量的均一溶液分配入多孔容器的各个孔,通常使用液体分配自动装置(robot)(96孔/384孔针)。以4μl至20μl,但优选10μl的体积分配溶液。
干燥方法
可通过冷冻干燥或冻干干燥分配的样品。合适的干燥程序产生具有可接受的硬度、大小、形状、Tg、孔隙度、溶解性和稳定性的试剂制剂。
一般的成功的冷冻干燥的概况在下面示于表1中。
表1
干燥的优选方法是经由冻干。分配的试剂在96或384孔聚苯乙烯板中进行了成功的干燥。令人惊讶地,当将聚苯乙烯薄壁板置于配备的金属板支架且与其直接接触时,干燥方法更好地进行且与在无金属支架的情况下干燥的板相比,没有观察到干燥的试剂的泡沫或絮片(图1和4)。聚苯乙烯孔(管)的外壁与金属板支架的金属孔的直接接触间接地增加了金属架子的接触面积,这反过来获得了至样品的更好的热传递。在另一方面,对于各孔,二氧化硅塑模具有厚壁和平底,且二氧化硅塑模中的冻干法在不使用金属支架的情况下合理地良好进行。这可能归因于塑模与冷冻干燥器架子的更好的接触以及二氧化硅的热传递性质。优选冻干的概况在下面示于表2中。注意,在进行下列程序前,将样品在-46℃下于冷冻干燥器中冷冻1小时。
表2
加热后:
贮存
我们成功地在基于聚苯乙烯和二氧化硅的板或塑模中制备了片剂、圆柱体和立方体形式的稳定的生物学试剂。我们的技术允许温度敏感性蛋白质和核酸分子稳定化成在环境温度下稳定的单剂形式。单剂形式(珠或饼)可包含预先分配的特异性测定所需的缓冲剂、盐、去污剂和核苷酸等,在所述测定中使用所述分子。这些酶和组合可用于许多种分子生物学应用,包括但不限于PCR、RT-PCR、实时PCR、全基因组扩增、体外转录和cDNA合成应用。
我们的方法消除了对将试剂混合物冷冻滴入液氮中或冷冻滴至冷表面上的需要,然而干燥的试剂保持良好的结构完整性。方法在制备过程中具有更少的步骤。当正确密封时,干燥的试剂制剂可直接贮存在板或塑模中,且这显著地减少了制备和包装成本。备选地,可以作为片剂从二氧化硅塑模和作为立方块从polyfiltronics 96孔板取出干燥的试剂,然后将其贮存在密封的容器即加盖的瓶子。
板或塑模的密封可通过下述实现:帽、带、热激活带等。在本发明的一个实施方案中,板的密封通过使用AbGene’s Thermo-Seal和Easy-Peel片的热激活密封来实现。
本发明的试剂制剂是室温稳定的。关于“室温稳定的”,我们是指制剂可在22℃下贮存超过6个月,其与在第一次干燥试剂后测量的活性相比,有少于20%的酶活性丢失。
本发明的试剂制剂具有至少10℃的玻璃化转变温度(Tg)。试剂制剂一般的Tg是40℃。至少40℃的Tg将保证在室温(22℃)下的稳定性。优选Tg是45℃。玻璃化转变温度是这样的温度,即高于该温度,玻璃状材料的粘性快速降低且玻璃状材料转变成橡胶,然后转变成在甚至更高的温度下转变成流体的可变形的塑料。
玻璃化转变温度用作制剂的稳定性的重要指标。在低于Tg的温度或接近其时,样品保持为稳定的玻璃。当温度上升高于Tg时,样品成为橡胶且较不稳定。Tg使用差示扫描量热法来进行测量。将2-5mg(1-2个粉碎的球)样品置于铝锅中。通过以10℃/分钟的速率使样品经历从0℃至100℃的受控温度程序来确定样品的Tg。测量流至样品和从样品流出的热并且将其表示为基线中的变动(shift)。Tg表示为在该基线变动的中点的温度。
一般的孔隙度允许球在1分钟或更短的时间内溶解在20μl水中。优选孔隙度将允许在30秒或更短的时间内溶解。
我们制备用玻璃覆盖的(glassified)生物学试剂制剂的方法提供了几个优点。制备方法大大简化。将试剂混合物直接分配入多孔板的孔,所述多孔板具有与商业微量滴定板相同的标准版式。这消除了对在液氮中或在冷表面上冷冻试剂滴的需要。然后冷冻分配的混合物,在孔中冻干,且也可将其贮存在孔中。这消除了对将珠或饼从干燥锅转移至贮存容器的需要。因为可将干燥的组合物贮存在多孔板中,所以所述组合物可用于自动化的随后工作流程中。自动机器学系统可用于处理板。
此外,制备的组合物在环境温度下是稳定的。这节省了运输成本(无干冰运输),消除了对冷藏箱贮存的需要和缩短了试剂制备时间(无融化)。其为随后的用户提供了方便。可将大多数测定相关性组分预先分配和稳定入单剂形式。其节省了用户时间和用于制备试剂的主混合物(master mix)的塑料消费品成本。其还提供了增加的再现性和可靠性,因为其减少了污染的危险和误差。使用预先分配的反应物制备组合物。这使样品处理和移液步骤减少至最少,从而减少了由用户产生的污染的危险和移液误差。
实施例
本实施例仅提供用于举例说明的目的,且不应当解释为限定由所附权利要求限定的本发明的范围。在本说明书的下面和其他地方提供的所有参考文献都并入本文作为参考。
实施例1:于384孔聚苯乙烯板中进行的干燥的PCR混合物的制备
按照标准规程制备生物学试剂制剂,在本情形中为用于PCR的试剂混合物。简而言之,10μl球的制剂包含25mM Tris-HCl(pH 9.0于室温下)、125mM KCl、3.75mM MgCl2、0.5mM dNTP、0.6mg/ml BSA、3.5个单位的rTaq DNA聚合酶以及包括合成的聚合物Ficoll 400(6.25%)、Ficoll 70(6.25%)和第二碳水化合物松三糖(10%)的形成玻璃的填充材料。在使用前通常将所有试剂高压灭菌或过滤灭菌。制备试剂并且将其在冰上贮存直至混合和分配入聚苯乙烯板或二氧化硅塑模。终制剂由形成玻璃的填充材料、BSA、dNTP和rTaq DNA聚合酶以及上述盐组成。
试剂均一溶液的每剂量终体积为10μl。这允许25μl的PCR工作体积。使用自动移液器将试剂分配入384板聚苯乙烯板。
将384孔板置于预先冷却(-46℃)的Vertis冷冻干燥器的顶部进行大约60分钟来冷冻试剂。然后按照前述表2中描述的方法,使冷冻的试剂经历第一和随后的第二干燥过程。
通过简单地用粘合盖或帽或热密封装置(thermo seal)覆盖板来将包含干燥的试剂的板贮存在作为完整包装的包含干燥剂的可再密封袋中。备选地,将干燥的试剂作为干燥的试剂片剂或立方块从板取出,然后将其贮存在瓶中,且将瓶贮存在包含干燥剂的可再密封的袋中。
通过λDNA的实时PCR扩增和将扩增概况与商业产品(puRe TaqRTG珠(beads);GE Healthcare)的扩增概况比较来测试干燥的试剂组合物的稳定性。用于测试的引物是SEQ ID NO:1(5′-GGT TAT CGA AATCAG CCA CAG CGC C-3′)和SEQ ID NO:2(5′-GAT GAG TTC GTGTCC GTA CAA CTG G-3′)。实时PCR扩增的结果示于图2。
在图2中,384孔聚苯乙烯板示于左上侧,其用于制备干燥的试剂组合物。将干燥的试剂片剂贮存在塑料瓶(左下侧)和于室温下于包含干燥剂的可再密封的袋中贮存大约1周。包含干燥的试剂的384孔板示于左上侧,其用粘合密封装置覆盖。λDNA模板的不同稀度的标准曲线示于右上侧。λDNA的不同稀度的实时扩增曲线示于右下侧。最后,实时PCR扩增反应的成功证明干燥的试剂组合物是稳定的。
实施例2:于96孔二氧化硅塑模中进行的干燥的PCR混合物的制备
按照实施例1制备生物学试剂制剂和形成玻璃的填充材料并且将它们混合在一起。使用自动移液器将大约20μl试剂混合物分配入96孔二氧化硅塑模(图3,左上侧)。将二氧化硅塑模置于预先冷却的(-46℃)Vertis冷冻干燥器中进行大约60分钟来冷冻试剂。然后按照前述表2中所描述的方法使冷冻的试剂经历第一和随后的第二干燥过程。
可通过简单地用粘合密封装置覆盖和通过将板置于包含干燥剂的铝袋中来将干燥的试剂贮存在作为完整包装的塑模中。备选地,作为干燥的试剂饼从塑模取出干燥的试剂,然后将其贮存在包含干燥剂的瓶中。
通过根据实施例1的λDNA的实时PCR扩增和将扩增概况与商业产品(puRe Taq RTG珠;GE Healthcare)的扩增概况比较来测试干燥的试剂组合物的稳定性。结果示于图3。
在图3中,96孔二氧化硅塑模示于左上侧,其用于制备干燥的试剂组合物。在进行λDNA功能测试前在包含干燥剂的可再密封的袋中将干燥的试剂立方块贮存在塑料瓶(左下侧)中进行1周。λDNA模板的不同稀度的标准曲线示于右上侧。λ的不同稀度的实时PCR扩增图示于右下侧。总之,实时PCR扩增反应的成功证明干燥的试剂组合物是稳定的。
实施例3:于96孔聚苯乙板中进行的干燥的PCR混合物的制备
按照实施例1制备生物学试剂制剂和形成玻璃的填充材料并且将它们混合在一起。使用液体分配自动装置分配10μl试剂混合物(图1,左下侧)。将96孔板置于96孔金属支架上(图4)。将与金属支架一起的96孔板置于预先冷却的(-46℃)Vertis冷冻干燥器中进行大约60分钟来冷冻试剂。然后按照前述表2中所描述的方法使冷冻的试剂经历第一和随后的第二干燥过程。
可通过简单地用粘合密封装置或帽或热密封装置在热封机的帮助下覆盖板来将干燥的试剂贮存在作为完整包装的96孔板中。使用新制备的“湿”制剂和与puRe Taq RTG珠一起的干燥的试剂进行λDNA实时PCR功能测试。将密封的板在室温下或在40℃的培养箱中于包含干燥剂的袋中贮存8天。通过λDNA的实时PCR扩增(根据实施例1)和将扩增概况与商业产品(puRe Taq RTG珠;GE Healthcare)的扩增概况比较来测试干燥的试剂组合物的稳定性。结果示于图6、7和8。
图6显示使用96孔干燥的PCR饼进行的λqPCR和与“湿”制剂和pure Taq RTG珠的比较。该图显示按照本发明的实施方案制备的干燥的PCR试剂的稳定性。使用始于1千万个拷贝至10个拷贝的不同浓度的λDNA作为模板连同无模板的对照进行实时PCR扩增。对于当前形式(右上方)、puRe Taq RTG珠(左下方)和‘湿’制剂(左上方),在Ct值和PCR效率(右下方的表)方面注意到相似的性能。
图7显示按照本发明的实施方案制备的干燥的PCR试剂的稳定性。将干燥的PCR混合物在40℃或室温(RT)下贮存8天,然后用于λDNA的qPCR。按照本发明制备的试剂,与商业puRe Taq RTG珠相比,获得相似的性能。左上角:于RT下贮存的干燥的PCR试剂饼。右上角:于40℃下贮存的干燥的PCR试剂饼。左下角:于RT下贮存的puRe TaqRTG珠。右下角:于40℃下贮存的puRe Taq RTG珠。图8显示当前形式试剂和pure Taq RTG珠在室温和40℃下的Ct值和PCR效率。
实施例4:用于实时PCR测定的干燥的试剂的制备
实时PCR成为日益普遍的用于基因表达分析的测定平台。用于检测实时PCR中扩增的产物的一个方法使用与模板的特定部分同源的双标记单链(ss)DNA探针。该探针上的荧光修饰用作报道分子(reporter)(FAM)和猝灭剂(TAMRA)。在单链模板存在的情况下,探针与模板退火,但由于报道分子染料与猝灭剂染料的紧密相邻而不发出荧光信号。当Taq DNA聚合酶从模板扩增DNA时,酶的5’-3’外切核酸酶活性切割与模板退火的标记的探针,从而释放猝灭剂染料,从而允许报道分子发荧光。然后通过实时仪器记录荧光信号。
我们在本文中证明PCR引物和TaqMan探针一起可在赋形剂存在的情况下进行冻干,并且与其中引物和探针未进行冻干的反应相比可用于实时PCR而无功能损失。用于制备用于测定β-肌动蛋白的2.5x浓缩制剂的制剂包括:25mM Tris pH 9、125mM KCl、3.75mM MgCl2、0.6mg/ml BSA、0.5mM dNTPs、0.25U/μl rTaq、0.05%Tween 20、0.05%NP-40、1.5μMβ-肌动蛋白正向引物(SEQ ID NO:3:5’-TCA CCC ACACTG TGC CCA TCT ACG A-3’)、1.5μMβ-肌动蛋白反向引物(SEQ IDNO:4:5’-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3’)、1μMβ-肌动蛋白探针(SEQ ID NO:5:5’-FAM-ATG CCC-N(TAMRA)CCC CCATGC CAT C CTG CGT p-3’)、6.25%Ficoll 70、6.25%Ficoll 400和10%松三糖。
将10微升等分试样的制剂移液入96孔板,然后进行冻干。将单一干燥的饼和变化的量的人基因组DNA模板在25μl的终体积中进行再水化。使用ABI 7900Fast Real Time仪进行实时PCR反应。将反应与上述不包含引物和探针的相似制剂进行比较。对于这些在后的反应,在PCR反应设置期间加入了引物和探针。此外,可商购获得的puReTaq RTG珠用作另外的对照。
图9显示这些反应的结果。左上图:使用冻干的试剂(包括TaqMan引物和探针)的实时PCR。左下图:冻干的试剂对照(引物和探针不包括在冻干的制剂中,但在实时PCR反应之前加入)。右上图:商业puReTaq RTG珠对照(所有其他试剂未进行冻干)。所有反应产生等价的扩增概况、R2值和斜率。当puReTaq RTG反应用于产生标准曲线而将其他反应视为未知的时,具有等量的模板DNA的反应落在标准曲线上(右下图)。我们的结果证明TaqMan引物和探针易于进行RTG整合。
实施例5:包含Phi29DNA聚合酶的干燥的试剂的制备
Phi29DNA聚合酶广泛地用于全基因组扩增以及滚环扩增。我们将该酶在使得能够进行全基因组扩增的制剂中进行冻干。我们的分析证明冻干的制剂在进行全基因组扩增中具有与“湿”制剂相同的活性。
GenomiPhi HY(High Yield)DNA扩增试剂盒(GE Healthcare)包括通过等温链置换扩增进行全基因组扩增所必需的所有组分。用于GenomiPhi反应的原材料可以是纯化的DNA或非纯化的细胞裂解物。DNA的微克量可以在仅仅少数小时内从纳克量的原材料产生。来自GenomiPhi HY反应的一般DNA产量为每50μl反应40-50μg,平均产物长度大于10kb。由于酶的校对3’-5’外切核酸酶活性,DNA复制极其精确。
将包含Phi29DNA聚合酶、随机六聚体、dNTP和GenomiPhi HY反应缓冲剂以及稳定剂Ficoll 70、Ficoll 400、松三糖和BSA的GenomiPhi反应混合物作为2X混合物制备。将10μl体积等分试样的混合物分配入12孔PCR带管(strip tube)。使用VirTis冷冻干燥器将分配的产物冻干成饼。将干燥的产物在室温或40℃下贮存35天。使用低至10ng的人基因组DNA,用这些产物成功地进行全基因组扩增。在第0时间和在RT或40℃下贮存35天后,将这与使用新制备的混合物进行的全基因组扩增进行比较。
图10显示使用冻干试剂或“湿”混合物进行的全基因组扩增测定的结果。将10ng的人基因组DNA用作模板材料,在30℃下进行90分钟的扩增反应。预期应当在90分钟内产生大于4μg的DNA。使用Pico Green测定,即使用已在40℃下贮存35天的冻干的试剂也检测到强烈的扩增。Phi29DNA聚合酶以冻干的形式被成功地稳定化。
实施例6:用于体外转录的干燥的试剂的制备
转录是由所有类型的细胞常规进行的至关重要的生物学过程,在该过程中使用DNA模板,利用依赖DNA的RNA聚合酶例如T7RNA聚合酶制备RNA。体外转录(IVT)是在试管中在细胞外进行的产生由终端用户选择的转录物的该相同过程。然后可将所得的RNA分子用于蛋白质的体外翻译或杂交反应例如RNA印迹、DNA印迹、微阵列分析和显微注射。
我们成功地产生了冻干的环境温度稳定的IVT试剂,其中将除去模板的RNA生产所需要的所有组分在赋形剂存在的情况下进行冻干。这极大地简化了IVT反应,从而使终端用户只需要加入模板DNA和水来起始反应。
用于产生冻干的试剂的IVT制剂包括40mM Tris pH 8.0、10mMMgCl2、4mM亚精胺、10mM DTT、50μg/ml BSA、10mM NaCl、0.5mMATP、0.5mM CTP、0.5mM GTP、0.5mM UTP、2U RNA Guard、10UT7 RNA聚合酶(GE Healthcare)、6.25%Ficoll 400、6.25%Ficoll 70、10%松三糖。将制备的制剂以25μl的等分试样分配入8孔带管,然后按照实施例1和表2进行冻干。使用来自Roche SP6/T7IVT试剂盒的对照DNA测试干燥的试剂饼。使用Roche SP6/T7IVT试剂盒平行进行IVT反应。
如所预期的,使用冻干的试剂以及Roche试剂盒产生大约1000个碱基对的转录物(图11)。因此,转录所必需的试剂在赋形剂存在的情况下被成功地冻干,且其可在DNA模板存在的情况下在正确的反应体积中进行再水化来产生RNA转录物。
尽管已显示和描述了本发明的优选实施方案,但在本领域内很显然的是,可在不背离本发明的教导的情况下,进行变化和修饰。上述描述和附图中所示的物质仅通过举例说明的方式提供而不是作为限定。当基于现有技术在它们的正确的观点中考虑时,本发明的实际范围意欲在下列权利要求中进行限定。
Claims (21)
1.制备干燥的试剂制剂的方法,其包括步骤:
(a) 提供至少一种经缓冲的生物学试剂的水溶液;
(b) 将形成玻璃的填充材料与经缓冲的试剂溶液混合来形成其中填充材料的浓度足以促进玻璃状多孔组合物形成的混合物;
(c) 将混合物以基本上均匀的滴的形式分配入多孔容器的各个孔中,其中所述多孔容器是聚苯乙烯板,并且其中单个滴分配入各个孔;
(d) 将所述聚苯乙烯板置于金属塑模上,其中所述多孔聚苯乙烯板的每一个孔的外壁与所述金属塑模的孔紧密接触;
(e) 在步骤(d)之后,干燥所述容器中的滴以形成试剂制剂;
(f) 将干燥的滴收集入试剂瓶中以用于干燥的试剂的室温贮存;
其中所述试剂制剂是水溶性的,且具有对于室温稳定性是足够的Tg。
2.权利要求1的方法,其中所述聚苯乙烯板是96孔板。
3.权利要求1的方法,其中所述聚苯乙烯板是384孔板。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述干燥步骤通过冻干来实现。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述至少一种经缓冲的生物学试剂是用于生物学测定的测定混合物。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其还包括在所述干燥步骤之前冷冻所述分配的混合物。
7.权利要求5的方法,其中所述测定混合物包括除了扩增模板和引物外的用于PCR所必需的所有试剂。
8.权利要求5的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于体外转录所必需的所有试剂。
9.权利要求5的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于全基因组扩增所必需的所有试剂。
10.权利要求5的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于实时PCR测定所必需的所有试剂。
11.制备干燥的试剂制剂的方法,其包括步骤:
(a) 提供至少一种经缓冲的生物学试剂的水溶液;
(b) 将形成玻璃的填充材料与经缓冲的试剂溶液混合来形成其中填充材料的浓度足以促进玻璃状多孔组合物形成的混合物;
(c) 将混合物以基本上均匀的滴的形式分配入多孔容器的各个孔中,其中所述多孔容器是聚苯乙烯板,并且其中单个滴分配入各个孔;
(d) 将所述聚苯乙烯板置于金属塑模上,其中所述多孔聚苯乙烯板的每一个孔的外壁与所述金属塑模的孔紧密接触;
(e) 在步骤(d)之后,干燥所述容器中的滴以形成试剂制剂;
(f) 用密封带或热密封装置密封多孔容器以进行干燥的试剂的室温贮存;
其中所述试剂制剂是水溶性的,且具有对于室温稳定性是足够的Tg。
12.权利要求11的方法,其中所述密封带是热激活的。
13.权利要求11或12的方法,其中所述聚苯乙烯板是96孔板。
14.权利要求11或12的方法,其中所述聚苯乙烯板是384孔板。
15.权利要求11-14中任一项的方法,其中所述干燥步骤通过冻干来实现。
16.权利要求11-15中任一项的方法,其中所述至少一种经缓冲的生物学试剂是用于生物学测定的测定混合物。
17.权利要求11-16中任一项的方法,其还包括在所述干燥步骤之前冷冻所述分配的混合物。
18.权利要求16的方法,其中所述测定混合物包括除了扩增模板和引物外的用于PCR所必需的所有试剂。
19.权利要求16的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于体外转录所必需的所有试剂。
20.权利要求16的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于全基因组扩增所必需的所有试剂。
21.权利要求16的方法,其中所述测定混合物包括除了模板外的用于实时PCR测定所必需的所有试剂。
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