CN104774916A - 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 - Google Patents
一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774916A CN104774916A CN201410794712.5A CN201410794712A CN104774916A CN 104774916 A CN104774916 A CN 104774916A CN 201410794712 A CN201410794712 A CN 201410794712A CN 104774916 A CN104774916 A CN 104774916A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- metastatic colorectal
- taqman probe
- prognosis
- colorectal cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 title abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 15
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 79
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 54
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 29
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 29
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims description 17
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 28
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 abstract description 3
- 108091026375 miR-135b stem-loop Proteins 0.000 abstract description 2
- 108091086065 miR-135b-2 stem-loop Proteins 0.000 abstract description 2
- 108091047268 miR-208b stem-loop Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 abstract 1
- YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-5-formyl-4-oxo-1,6,7,8-tetrahydropteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid;(1r,2r)-1,2-dimethanidylcyclohexane;5-fluoro-1h-pyrimidine-2,4-dione;oxalic acid;platinum(2+) Chemical compound [Pt+2].OC(=O)C(O)=O.[CH2-][C@@H]1CCCC[C@H]1[CH2-].FC1=CNC(=O)NC1=O.C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 4
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 206010000077 Abdominal mass Diseases 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011226 adjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 208000003243 intestinal obstruction Diseases 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011255 standard chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用。所述miRNA组合包括:miR-135b、miR-208b。所述试剂盒包括上述miRNA的TaqMan探针组合。在本发明中,血清较易获得,无需其它组织,属于无创性检查;血清miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况,以其作为化疗疗效和预后标志物可以提高检测的准确性;所述试剂盒简化了TaqMan探针库,减少制作成本和生产时间,增加了针对性和实用性,提高了检测的灵敏度和特异性;所述组合、方法、试剂盒不仅能够用于转移性结直肠癌化疗疗效判断,还能用于转移性结直肠癌化疗的预后判断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用。
背景技术
结直肠癌是一种原发于大肠的恶性肿瘤,包括结肠癌和直肠癌。结直肠癌因其发部位不同而表现出不同的临床症状及体征,主要有腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等,伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。在我国,结直肠癌作为第三大肿瘤,其发病率及死亡率近年来逐年上升。由于诊断技术的不断提高,使新发结直肠癌病例中非转移性疾病的比例大大增加,对于这部分患者,外科手术及辅助化疗是主要治疗手段。但是目前尚缺乏有效的预后判断及化疗疗效评价指标。目前临床上主要依据基于临床病理指标(如肿瘤大小、淋巴结转移数目、远处转移、组织分级等)的TNM分期作为疾病预后的判断及指导临床治疗,但根据此分期判断患者预后存在较大的异质性,亦不能预测肿瘤患者对化疗的反应。
研究表明Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者经过标准治疗后仍有20%‐30%出现复发,其中40‐50%复发发生在原发灶切除后一年内,80%复发发生在原发灶切除三年内,复发后5年生存率低于1%。约有50%结直肠癌患者最终会进展为转移性疾病而死亡。转移性结直肠癌患者仅有极少数可以经手术及化疗而得到治愈,全身化疗是这类患者的主要治疗方法,以氟尿嘧啶药物为基础联合奥沙利铂或者伊立替康方案已成为晚期结直肠癌的标准治疗方案。此外,近年来抗血管生成药物(贝伐珠单抗)或表皮生长因子单抗(西妥昔单抗或帕尼单抗)联合标准化疗使有效率进一步提高,但有相当一部分病人在治疗时出现化疗药物耐药甚至开始即出现不敏感最终因疾病进展而死亡。因此,筛选出对化疗敏感的人群在临床实践中显得尤为重要,可使化疗无效人群避免不必要的毒副作用及承担巨大的经济负担,但至今尚没有有效的手段用于化疗药物敏感人群的选择,寻求有效的标志物用于化疗敏感性指标具有极大的应用前景。
微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子,其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA通过与靶mRNA 3’端非翻译序列完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表达。miRNA参与1/3人类蛋白编码基因调控,它与多种生理活动有关,如生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等;也与许多疾病的发生发展密切相关,如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等。最近的研究显示[1-3],miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。已证实,肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些miRNA表达水平发生了变化,相对于正常组织,一些miRNA表达量显著上升或下降。许多癌组织如肺癌、乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特异性miRNA的表达,提示miRNA有肿瘤组织特异性。另外,miRNA的表达也与肿瘤分化程度以及预后有关。最近,大量的研究结果揭示,miRNA在血清中能长期稳定存在,耐RNA酶的降解,一些肿瘤包括非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表达谱与正常人有显著差异,均有各自特异的表达谱,同时这种变化还可见于早期癌中。这种稳定存在于血清中的循环miRNA因其用于肿瘤等疾病的早期诊断、预后及疗效判断从而指导个体化治疗显示出潜在的临床应用前景。
目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测与转移性结直肠癌化疗疗效及预后生物标志物相关的特异性miRNA组合及检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的就在于通过对患者接受化疗前的血清样本miRNA进行检测和比对,分析miRNA表达水平与化疗敏感性的关系,联系患者的生存资料及治疗效果,筛选一组与转移性结直肠癌化疗疗效及预后相关的血清miRNA,并利用这些miRNA的TaqMan探针制备出适用于临床诊疗用途的试剂盒,为预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性提供特异性的以及迅速的无创伤性检测手段。
以下是对本发明的进一步描述:
一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA组合,其包括下列miRNA:miR‐135b及miR‐208b。
上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤(见图1):
(1)分别收集12例对奥沙利铂(FOLFOX)敏感和不敏感患者化疗前混合血清样本,提取总RNA;
(2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的低密度芯片技术(TaqMan low density Arraytechnology)进行miRNAs检测,筛选在化疗敏感组(PR+SD)及不敏感组(PD)间稳定差异表达的一组miRNA;
(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组标本进行逐个检测,从低密度芯片方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著miRNA;
(4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证,筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNA。
具体来说,上述筛选方法包括以下步骤:(1)收集接受奥沙利铂(FOLFOX)患者化疗前混合血清或血浆样本,提取总RNA;(2)运用低密度芯片技术对上述RNA进行检测,初筛出在化疗敏感组(PR+SD)及不敏感组(PD)间稳定差异表达的一组miRNA;(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA,采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)对初筛出的miRNA进行复筛和验证,挑选出稳定、特异表达的一组miRNA。
本发明使用的检测方法可以选自:RT‐PCR方法、低密度芯片技术(TaqMan low densityArray technology)、Real‐time PCR方法中的一种或几种。例如,血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤:
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA;
(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA;
(3)利用TaqMan探针法进行PCR反应;
(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳;
(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。
本发明还提供了一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA TaqMan探针组合物,包括miR‐135b和miR‐208b的TaqMan探针。
上述TaqMan探针组合物优选包括以下序列所示的TaqMan探针中的一种或多种:
此外,本发明提供了上述miRNA组合或上述TaqMan探针组合在制备预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂或工具中的用途。
本发明提供了上述miRNA组合或上述TaqMan探针组合在制备检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂或工具中的应用。
本发明还提供一种用于预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性或检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂或工具中的应用。的试剂盒:
作为本发明的一种优选实施方式,上述试剂盒包括Taq酶和dNTP,氯化镁、10×PCR缓冲液(不含Mg2+)和包括miR‐135b和miR‐208b中任意一种或多种miRNA的TaqMan探针(ABI公司提供,专用于miRNA荧光定量)。
上述试剂盒可以进一步优选以下TaqMan探针中的一种或多种:
本发明所述转移性结直肠癌患者接受的标准治疗方案包括以氟尿嘧啶药物为基础,联合奥沙利铂(FOLFOX)方案。
本发明所述的miRNA组合及其对应的TaqMan探针组合,以及含有所述TaqMan探针组合的试剂盒可应用于预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性。
本发明的有益效果:
首先,血清相对其它组织较易获得,与食管组织活检相比,属于无创性检查,极大地方便了医疗人员的使用,更减轻了患者的痛苦;
其次,血清中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况,其检测结果具有精确而详细的指导意义;
第三,所筛选出的miRNA组合对预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA(癌胚抗原),大大提高了诊断的准确性。此外,血清miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态,并为转移性结直肠癌的治疗提供了潜在靶点。
第四,本发明的试剂盒所包含的TaqMan探针同样是基于低密度芯片技术、定量PCR技术筛选出的在筛选在化疗敏感组及不敏感组间稳定差异表达的一组血清miRNA TaqMan探针,这样可以增加检测的灵敏度和特异性,提高检测水平。
综上所述,本发明提供的特异的miRNA组合表达量定量检测结果作为预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的中间结果,有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行转移性结直肠癌患者的诊断。检测血清中的miRNA简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清miRNA的试剂盒投入实践使用,仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通过最精简的TaqMan探针库来检测血清miRNA水平能拓展转移性结直肠癌的检测指标,提高检测的灵敏度,丰富转移性结直肠癌化疗疗效及预后生物标志物,这些血清miRNA有望成为预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性重要标志分子,具有极重要的临床应用潜力和价值。
附图说明
图1为本发明的主要流程图。
图2miR‐135b和miR‐208b在FOLFOX敏感和不敏感组之间的表达差异。
图3miR‐135b和miR‐208b预测FOLFOX化疗敏感性的ROC曲线分析。
图4miR-135b和miR-208b作为预测FOLFOX化疗患者预后指标。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1标本的收集
我们共收集了69例对FOLFOX化疗敏感和47例对FOLFOX化疗不敏感患者化疗前的血清,具体信息见下:
表1样本信息表
P1:student‐t test;P2:two‐sidedχ2test.
实施例2敏感组和不敏感组化疗前差异表达的miRNA表达谱初筛
最初筛选阶段,通过分别对12例对FOLFOX化疗敏感和12例对FOLFOX化疗不敏感患者化疗前的混合血清进行低密度芯片检测,初筛出一组在对FOLFOX化疗敏感和不敏感患者血清中差异表达的miRNA。结果发现,共有28种miRNA存在表达差异的miRNAs(详见表1)。
表2低密度芯片初筛出的对FOLFOX化疗敏感和不敏感患者化疗前血清中表达差异的miRNAs
实施例3血清中miRNA的实时荧光定量PCR实验(TaqMan探针法)
采用定量PCR方法对批量标本逐个验证,从低密度芯片测序方法初筛出的miRNA中筛选出对FOLFOX化疗敏感和12例对FOLFOX化疗不敏感患者表达差异显著miRNA。
定量PCR(real‐time PCR)的实验原理及实验步骤同RT‐PCR一样。仪器使用的是ABI Prism7300荧光定量PCR仪。
(1)酚/氯仿法提取血清总RNA
a)取100ul样品加入到300ul水中,充分混匀后加入200ul(PH=4.7‐5.5)酸性酚,剧烈震荡混匀,室温静置2min后加入200ul氯仿,再次充分震荡,室温静置5min后12000g室温离心15min
b)小心吸取上清液(约400ul)加入到800ul异丙醇中,再加入PH=5.2的3M醋酸钠40ul,充分混匀后‐20℃静置30min,16000g,4℃离心20min
c)充分弃上清后,加入75%DEPC‐乙醇1ml,轻柔颠倒数次,16000g,4℃离心10min
d)充分弃上清,室温干燥后,加入40ul DEPC水溶解沉淀,得到RNA样品
(2)制备cDNA样品:将上一步得到的RNA样品通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括2μl 5×AMV buffer、1μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μlAMV(Takara公司)、4ulDEPC水、0.5μl反向引物(ABI公司)以及2ul RNA样品。反应步骤为16℃孵育30min,42℃反应30min,85℃孵育5分钟
(3)qRT‐PCR:用20ul体系进行qRT‐PCR,体系包括14.77ul H2O,2μl 10×PCR buffer(Takara公司),1.2μl 25mM MgCl2(Takara公司),0.4μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司),0.3ulTaq酶(Takara公司),0.33ul TaqMan探针(ABI公司),1ul cDNA。所用的仪器是ABI Prism7300荧光定量PCR仪,PCR的反应条件是:95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒,60℃、1分钟进行40个循环。
(4)标准曲线的制备:将合成的10nM miR‐16的成熟体RNA(Takara公司)按(2)中相同的逆转录体系逆转录成cDNA。将所得miR‐16的cDNA用水按10倍梯度稀释100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍,得到一组cDNA。将这组cDNA按(3)中相同的qRT‐PCR体系并且与(3)中的cDNA在同一块PCR板上进行荧光定量PCR
(5)数据分析与处理:扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值,然后根据标准品miR‐16的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线,并根据此标准曲线及待测样本的CT值计算出该样本所需测定的miRNA的绝对含量。
实施例4定量PCR方法对初筛出的血清miRNA进行验证
用定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组受试者标本进行逐个检测,从低密度芯片方法初筛出的28种miRNA中筛选出69例对FOLFOX化疗敏感与47例对FOLFOX化疗不敏感患者之间表达差异显著的miRNA(具体步骤参见实施例3)。结果发现,初筛出的28种miRNA中有4种miRNA在2组样本间存在差异(绝对含量表示方法为均值±标准差,p<0.001),而其中仅有miR‐135b和miR‐208b变化倍数大于1(见表3和图2)。
表3定量PCR方法复筛出的miRNA
实施例5筛选出的miRNA临床价值评估
我们从miRNA的角度通过对患者接受化疗前的血清样本进行比对,分析miRNA表达水平与化疗敏感性的关系。我们发现在接受FOFLOX化疗患者中,化疗前高水平的miR‐135b及miR‐208b预示着患者对随后的化疗不敏感,可有效将FOLFOX耐药人群和敏感人群分开(图2),诊断准确性远高于CEA(miR‐135b,AUC 0.877;miR‐208b,AUC 0.771;CEA AUC 0.493)(图3),此外高水平血清miR‐135b及miR‐208中位PFS明显低于低水平患者(P<0.0001)。中位总生存期分别为9.9和3.0个月,预后明显较低水平患者差(图4)。
实施例6用于检测血清miRNA的试剂盒
用于检测食管癌的血清miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程是基于低密度芯片技术和定量PCR技术所测结果,将下述TaqMan探针组合:SEQ ID NO:1和2分别收集到PCR试剂盒(RT‐PCR或Real‐time PCR)中制备特定TaqMan探针组合的结直肠癌检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成(每份标本)如下:
所制备试剂盒的具体操作流程如下:
(1)收集受试者的血清样本,提取RNA后逆转录制备cDNA样品;
(2)按照上述配方加样;
(3)进行PCR反应,条件为95℃ 5min,95℃ 15s,60℃ 1min,40个循环。
首先通过低密度芯片技术初筛,然后通过定量PCR技术进一步筛选在疾病及正常生理状态下表达量差异程度大的一组血清miRNA,作为检测结直肠癌的TaqMan探针。该试剂盒包括本发明所提供的血清miRNA TaqMan探针,Taq酶以及dNTP等试剂。所述试剂盒的价值在于以特定的TaqMan探针组合检测血清miRNA表达量,不仅可提高结直肠癌检测的特异性、准确性,有助于该病的早期发现,还可以用于结直肠癌生存期和治疗预后的判断。因此,该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治疗推上一个新高度。
Claims (10)
1.一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA组合,其特征在于该miRNA组合包括下列miRNA:miR‐135b和miR‐208b。
2.一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA TaqMan探针组合物,其特征在于该TaqMan探针组合物包括权利要求1所述miRNA的TaqMan探针。
3.根据权利要求2所述的TaqMan探针组合物,其特征在于所述miRNA的TaqMan探针序列为:SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
4.权利要求1所述的miRNA组合在制备检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂或工具中的应用。
5.权利要求1所述的miRNA组合在制备预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂或工具中的应用。
6.权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物在制备检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂或工具中的应用。
7.权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物在制备预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂或工具中的应用。
8.一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯化镁和不含Mg2+的10×PCR缓冲液PCR缓冲液。
10.一种用于预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410794712.5A CN104774916B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410794712.5A CN104774916B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104774916A true CN104774916A (zh) | 2015-07-15 |
CN104774916B CN104774916B (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=53616683
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410794712.5A Expired - Fee Related CN104774916B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104774916B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108486247A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-09-04 | 中山大学 | piRNA-54265在结直肠癌的诊治和预后评价方面的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2354246A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | febit holding GmbH | miRNA in the diagnosis of ovarian cancer |
CN102985563A (zh) * | 2010-06-23 | 2013-03-20 | 香港中文大学 | 结肠直肠癌的微rna标志物 |
-
2014
- 2014-12-18 CN CN201410794712.5A patent/CN104774916B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2354246A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | febit holding GmbH | miRNA in the diagnosis of ovarian cancer |
CN102985563A (zh) * | 2010-06-23 | 2013-03-20 | 香港中文大学 | 结肠直肠癌的微rna标志物 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NICOLA VALERI等: "MicroRNA-135b Promotes Cancer Progression", 《CANCER CELL》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108486247A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-09-04 | 中山大学 | piRNA-54265在结直肠癌的诊治和预后评价方面的应用 |
CN108486247B (zh) * | 2018-02-12 | 2021-01-15 | 中山大学 | piRNA-54265在结直肠癌的诊治和预后评价方面的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104774916B (zh) | 2017-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Filella et al. | Emerging biomarkers in the diagnosis of prostate cancer | |
Rivera et al. | Prognostic biomarkers in oral squamous cell carcinoma: a systematic review | |
Abbas et al. | The relevance of gastric cancer biomarkers in prognosis and pre-and post-chemotherapy in clinical practice | |
CN101851682B (zh) | 一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用 | |
CN106148529B (zh) | 与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用 | |
CN109897899A (zh) | 一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物及其应用 | |
Jia et al. | Identification and validation of immune-related gene signature for predicting lymph node metastasis and prognosis in lung adenocarcinoma | |
CN104140967A (zh) | 与结直肠癌肝转移相关的长链非编码rna clmat1及其应用 | |
CN106350600A (zh) | Loc80054在胰腺癌诊断或预后中的用途 | |
Zhou et al. | Plasma circRNAs as biomarkers in cancer | |
CN116113712A (zh) | 用于癌症的预后生物标志物 | |
Alkan et al. | Biomarkers and cell-based models to predict the outcome of neoadjuvant therapy for rectal cancer patients | |
Li et al. | Screening and validating the core biomarkers in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma | |
CN103074431B (zh) | 检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法 | |
US20190316205A1 (en) | Mmp1 gene transcript for use as a marker for diagnosis of ovarian cancer prognosis, and test method | |
CN105624271A (zh) | 一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用 | |
Zhang et al. | Circulating tumour cell isolation, analysis and clinical application | |
Huang et al. | Poor prognostic impact of FGF4 amplification in patients with esophageal squamous cell carcinoma | |
CN110257514A (zh) | 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用 | |
CN104911248A (zh) | 一种用于ii、iii期结直肠癌诊断及预后的微小核糖核酸组合及其应用 | |
CN104774916A (zh) | 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用 | |
CN103911436A (zh) | 一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物及其应用 | |
CN106636440A (zh) | 血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途 | |
Zhang et al. | Identification of potential biomarkers for digestive system cancers from serum-derived extracellular vesicle RNA | |
Bae et al. | Dissemination of circulating tumor cells in breast and prostate cancer: Implications for early detection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170510 Termination date: 20171218 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |