CN104774834A

CN104774834A - 采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法

Info

Publication number: CN104774834A
Application number: CN201510172274.3A
Authority: CN
Inventors: 俞岩青; 王昆蓉; 田敏; 曾志刚; 雷叶明; 陈林
Original assignee: Sichuan Industrial Institute of Antibiotics
Current assignee: Sichuan Industrial Institute of Antibiotics
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2015-07-15

Abstract

本发明为采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法，解决巳有方法培养基原料来源少，成本高，达托霉素正突变株的几率小的问题。包括如下步骤：（1）初筛：将诱变处理的单孢子悬浮液稀释后涂布于含有谷氨酸钠耐受量为150—200g/L的分离培养基上培养，挑选耐谷氨酸钠的单菌落接种于斜面培养基上培养，斜面产孢后接种于种子培养基中培养后接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基培养168h挑选出效价高的菌株；（2）复筛：将初筛挑选出来的菌株进行复筛，挑选出效价高的菌株即成；（3）发酵培养基试验：将效价较高的菌株进行发酵培养基试验，以确定适合该突变菌株的最佳发酵培养基配方。

Description

采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氨基酸耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法。

背景技术：

被称为“超级病菌” 的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,

(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)在各国的传播越来越迅速,已经严重威胁到人类的健康和生命。临床上只有万古霉素(Vancomycin)对MRSA有抑制作用, 随着万古霉素在MRSA感染中应用的增加,临床上已出现了感染的金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感度减为中度敏感的现象。

达托霉素(Daptomycin)被公认为在万古霉素之后的最佳备用抗生素,是美国礼莱公司20世纪80年代发现的新型脂肽类抗生素,对MRSA有明显的抑制作用, 除抗MRSA之外,达托霉素还对绝大多数的革兰氏阳性菌有抑制作用。据报道,达托霉素对2002 ～ 2005年从美国和加拿大各医院收集的19615株临床革兰氏阳性菌中的99%存在抑制作用。达托霉素在生物膜中的扩散速度远远超过一般药物，因此作用速度快且具浓度依赖性，可产生抗生素后效应，不易与其它抗生素产生交叉耐药性。自从2003年9月FDA(美国食品与药物管理局)首次批准Cubicin(Daptomycin 注射剂)用于治疗复杂皮肤和皮肤结构感染以来, 达托霉素在临床上应用越来越多, 市场上对达托霉素的需求量越来越大。达托霉素由13个氨基酸组成，其中左侧10个氨基酸形成一个肽环，位于右侧的3个氨基酸组成了环外的尾巴。13个氨基酸有两个属于非天然氨基酸：犬尿氨酸(Kyn)和3-甲基谷氨酸(3mGlu)，它们仅存在于达托霉素中。目前由于3-甲基谷氨酸原料的缺乏，用化学合成或化学与酶结合催化的方法改造达托霉素母核很困难。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种培养基原料来源广，成本低，出发菌株正突变株的几率高、突变株达托霉素效价高的谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法。

本发明是这样实现的：

采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法，包括如下步骤：

（1）初筛：将诱变处理的玫瑰孢链霉菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有谷氨酸钠耐受量为150—200 g/L的分离培养基上，在30℃培养箱中培养7—10天，挑选耐谷氨酸钠的玫瑰孢链霉菌单菌落接种于斜面培养基上，30℃培养7—10天，斜面产孢后接种于种子培养基中，30℃培养48h后接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的玫瑰孢链霉菌菌株；

（2）复筛：将效价较高的玫瑰孢链霉菌菌株接种于种子培养基中，30℃培养48h后，挑选菌丝生长良好的菌株接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基中，30℃培养168h后测定效价；

（3）发酵培养基试验：将效价较高的玫瑰孢链霉菌菌株进行发酵培养基试验，将（2）中培养好的玫瑰孢链霉菌种子接到含谷氨酸钠量不同的的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的玫瑰孢链霉菌菌株即成，或者将（2）中培养好的玫瑰孢链霉菌种子接到含谷氨酸钠量为3或5或10或15 g/L的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后即成。

所述的（1）步骤中所用分离培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，谷氨酸钠150 g/L，琼脂15.0 g/L ，pH7.2-7.4。

所述的（1）步骤中所用斜面培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂15.0 g/L， pH7.2-7.4。

所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的种子培养基成分和含量为：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。

所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的含谷氨酸钠量不同的发酵培养基含谷氨酸钠分别为3.0 —15 g/L中之一，其他成分和含量均为：糊精35 g/L，葡萄糖5 g/L ，黄豆饼粉22 g/L，硫酸钾5 g/L， pH7.5。

含谷氨酸钠量不同的发酵培养基含谷氨酸钠分别为5.0 —15 g/L中之一。

所述诱变处理为将出发菌株玫瑰孢链霉菌成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml于无菌培养皿中，使其孢子的终浓度达到10⁶-10⁷ 个/ml，紫外功率30W，灯距35cm照射60s。

所述诱变处理为将出发菌株玫瑰孢链霉菌成熟斜面用PH7.0的磷酸钾缓冲液成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml，使其孢子的终浓度达到10⁶-10⁷ 个/ml，加入烷化剂甲基磺酸乙酯EMS，终浓度为5% ，振荡处理45min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡10min。

利用达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌可能作为前体的物质或前体的结构类似物（谷氨酸钠）加入到分离培养基中，观察出发菌株玫瑰孢链霉菌对谷氨酸钠的耐受情况，确定其最低耐受谷氨酸钠剂量，选用出发菌株玫瑰孢链霉菌在高浓度下不能生长的谷氨酸钠，作为筛选模型。

经过诱变后的玫瑰孢链霉菌菌种，用本发明所建立的筛选模型进行筛选，对出发菌株因不能耐受高浓度谷氨酸钠而不能生长的模型，如果在诱变后能生长，说明玫瑰孢链霉菌对这种浓度的谷氨酸钠能耐受，玫瑰孢链霉菌代谢途径和代谢流一定发生了变化，就有可能筛选得到达托霉素高产的玫瑰孢链霉菌突变株。

利用达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌可能作为前体的物质或前体的结构类似物（谷氨酸钠）进行抗性筛选是可行的方法。将谷氨酸钠加入到分离培养基中进行筛选发现：能耐受谷氨酸钠的玫瑰孢链霉菌突变株其产生正突变株的几率最高。因此选用谷氨酸钠作为筛选模型来进行玫瑰孢链霉菌高产菌株的筛选。观察玫瑰孢链霉菌菌株对谷氨酸钠的耐受情况（即观察平板上有无菌落生长），确定其最低耐受剂量。其耐受剂量的确定采用如下方法：将经过诱变后的玫瑰孢链霉菌单孢子悬液经适当稀释后分别涂布在含有不同浓度谷氨酸钠的分离培养基上进行培养，出发菌株作为对照品同时培养。观察不同浓度平板上菌落的生长情况，如果某个浓度的平板上无菌落生长，就可确定该浓度为谷氨酸钠的最低抑制浓度。选用出发菌株玫瑰孢链霉菌在高浓度下不能生长的谷氨酸钠，作为筛选模型。

本发明就是基于以上的原理而进行的方法。经长期大量的试验证明，在本发明的诱变条件下，玫瑰孢链霉菌经过诱变并采用本发明的谷氨酸钠耐受性模型筛选，必然得到达托霉素效价高的即达托霉素高产的玫瑰孢链霉菌突变菌株。

本发明所提供的筛选方法操作简便易行，所涉及的培养基原料来源广，成本低，非常适合工业生产的需要。在本发明能有效地提高获得玫瑰孢链霉菌正突变株的几率，玫瑰孢链霉菌正突变株的达托霉素效价高，本发明为达托霉素发酵生产提供高产玫瑰孢链霉菌菌株，从而提高达托霉素发酵生产水平。

具体实施方式：

实施例1

诱变：将玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)单孢子悬液通过紫外（UV）诱变。

初筛：按照如下配方配制分离培养基2L：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，谷氨酸钠150 g/L，琼脂15.0 g/L ，pH7.3。准备无菌培养皿50个，培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。将出发菌株成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml于无菌培养皿中（使其孢子的终浓度达到10⁶-10⁷ 个/ml），紫外（功率30W，灯距35cm）照射60s。将诱变处理后的单孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，30℃培养箱中培养7天。按照如下配方配制斜面培养基2.5L：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂15.0 g/L， pH7.2。准备试管120支，制成斜面备用。在含有高浓度谷氨酸钠平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面上，在30℃培养箱中培养7天。斜面成熟后挖块种入种子培养基中。种子培养基成分和含量为：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。 30℃培养48h后种入发酵培养基中，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价较高的菌株18支进行复筛。

复筛：将挑选出的效价较高的18支玫瑰孢链霉菌菌株接种到种子培养基，摇床转速为230rpm，30℃培养48h后种入发酵培养基中，摇床转速为230rpm，30℃培养168h后测定效价。挑选出效价最高的玫瑰孢链霉菌菌株1支，保存，备用。

表1 玫瑰孢链霉菌突变株相对效价分布

从表1可知：采用该模型进行筛选，获得玫瑰孢链霉菌正突变株的比例较高，达到35%。

发酵培养基试验：将效价最高的玫瑰孢链霉菌菌株进行发酵培养基试验。按如下配方配制种子培养基400ml ：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。将培养基装入3个750ml三角瓶中，每瓶100ml。灭菌后挖块种入种子培养基中，30℃培养48h，将生长良好且无杂菌的种子分别种入含有不同浓度谷氨酸钠的发酵培养基中进行发酵试验。按照如下配方配制发酵培养基 1 .5L：糊精35 g/L，葡萄糖5 g/L ，黄豆饼粉22 g/L，硫酸钾5 g/L，谷氨酸钠3.0 、5.0、10.0、15.0 g/L，pH7.5。接种量5%（V/V）。摇床转速为230rpm，30℃培养168h后测定效价，所对应的测定结果见表1。HPLC方法：

流动相:采用乙腈(含0.1％三氟乙酸) ：0．1％三氟乙酸水溶液=41:59，色谱柱：采用 HanBon C₁₈ 柱(4．6 mm×150 mm，3 um)，流速1.0 ml／min，检测波长为223nm，柱温35℃。对含有不同谷氨酸钠浓度的培养基进行综合比较，筛选出最佳发酵配方。

表2 实验测定结果

从表2中可以知道配方中谷氨酸钠的浓度在5.0—15.0 g/L时，达托霉素效价较高，10.0 g/L时达托霉素效价最高。

实施例2：

诱变：将玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)单孢子悬液通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变。

初筛：按照如下配方配制分离培养基2L：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，谷氨酸钠200 g/L，琼脂15.0 g/L ，pH7.4。准备无菌培养皿60个，培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。将出发菌株成熟斜面用PH7.0的磷酸钾缓冲液制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml（使其孢子的终浓度达到10⁶—10⁷ 个/ml），加入烷化剂EMS，终浓度为5% ，振荡处理45min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡10min。将诱变处理后的单孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，30℃培养箱中培养7天。按照如下配方配制斜面培养基3L：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂15.0 g/L， pH7.2—7.4。准备试管150支，制成斜面备用。在含有高浓度谷氨酸钠平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面上，在30℃培养箱中培养7天。斜面成熟后挖块种入种子培养基中。种子培养基成分和含量为：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。 30℃培养48h后种入发酵培养基中，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价较高的菌株20支进行复筛。

复筛：将挑选出的效价较高的20支菌株接种到入种子培养基，摇床转速为230rpm，30℃培养48h后种入发酵培养基中，摇床转速为230rpm，30℃培养168h后测定效价。挑选出效价最高的菌株1支，保存，备用。

表3玫瑰孢链霉菌突变株相对效价分布

从表3可知：采用该模型进行筛选，获得玫瑰孢链霉菌正突变株的比例较高，达到44.1%。

发酵培养基试验：将效价最高的玫瑰孢链霉菌菌株进行发酵培养基试验。按如下配方配制种子培养基400ml ：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。将培养基装入3个750ml三角瓶中，每瓶100ml。灭菌后挖块种入种子培养基中，30℃培养48h，将生长良好且无杂菌的玫瑰孢链霉菌种子分别种入含有不同浓度谷氨酸钠的发酵培养基中进行发酵试验。按照如下配方配制发酵培养基 1 .5L：糊精35 g/L，葡萄糖5 g/L ，黄豆饼粉22 g/L，硫酸钾5 g/L，谷氨酸钠3.0 、5.0、10.0、15.0 g/L，pH7.5。接种量5%（V/V）。摇床转速为230rpm，30℃培养168h后测定效价，所对应的测定结果见表1。HPLC方法：

流动相:采用乙腈(含0.1％三氟乙酸) ：0.1％三氟乙酸水溶液=41:59，色谱柱：采用 HanBon C₁₈ 柱(4．6 mm×150 mm，3um)，流速1.0 ml／min，检测波长为223nm，柱温35℃。对含有不同谷氨酸钠浓度的培养基进行综合比较，筛选出最佳发酵配方。

表4 实验测定结果

从表4中可以知道配方中谷氨酸钠的浓度在5.0—15.0 g/L时，达托霉素效价较高，10.0 g/L时达托霉素效价最高。

Claims

1.采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法，包括如下步骤：

（1）初筛：将诱变处理的玫瑰孢链霉菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有谷氨酸钠耐受量为150—200 g/L的分离培养基上，在30℃培养箱中培养7—10天，挑选耐谷氨酸钠的单菌落接种于斜面培养基上，30℃培养7—10天，斜面产孢后接种于种子培养基中，30℃培养48h后接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的菌株；

（2）复筛：将效价较高的菌株接种于种子培养基中，30℃培养48h后，挑选菌丝生长良好的菌株接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基中，30℃培养168h后测定效价；

（3）发酵培养基试验：将效价较高的菌株进行发酵培养基试验，将（2）中培养好的种子接到含谷氨酸钠量不同的的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的菌株即成，或者将（2）中培养好的种子接到含谷氨酸钠量为3或5或10或15 g/L的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后即成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1）步骤中所用分离培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，谷氨酸钠150 g/L，琼脂15.0 g/L ，pH7.2—7.4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1）步骤中所用斜面培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂15.0 g/L， pH7.2—7.4。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的种子培养基成分和含量为：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的含谷氨酸钠量不同的发酵培养基含谷氨酸钠分别为3.0 —15 g/L中之一，其他成分和含量均为：糊精35 g/L，葡萄糖5 g/L ，黄豆饼粉22 g/L，硫酸钾5 g/L， pH7.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基含谷氨酸钠分别为5.0 —15 g/L中之一。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱变处理为将出发菌株玫瑰孢链霉菌成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml于无菌培养皿中，使其孢子的终浓度达到10⁶—10⁷ 个/ml，紫外功率30W，灯距35cm照射60s。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱变处理为将出发菌株玫瑰孢链霉菌成熟斜面用PH7.0的磷酸钾缓冲液制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散15min，无菌过滤收集单孢子悬液约5ml，使其孢子的终浓度达到10⁶—10⁷ 个/ml，加入烷化剂甲基磺酸乙酯EMS，终浓度为5% ，振荡处理45min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡10min。