CN104749160B - 一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,具体包括以下步骤:⑴该对金属扫描探针与水平面呈夹角设置组成并列双针尖探针,调节探针微位移调节台使并列双针尖探针的针尖接触样品;⑵开启激光器,激光器发出的激光束通过第二显微物镜的光斑汇聚在并列双针尖探针的针尖上;⑶调节金属扫描探针在样品的扫描区域中各点的停留时间与拉曼光谱单元的拉曼光谱仪的每个光谱的曝光时间相匹配;⑷耦合拉曼信号进入拉曼光谱仪,控制样品微位移台带动样品扫描;⑸从拉曼光谱仪获得拉曼光谱成像。本发明可将拉曼信号增强至原来的10 11倍,理论上可达到单针尖增强拉曼光谱扫描成像技术100倍以上,因此可适用于细胞膜表面的分子检测与成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法。
背景技术
针尖增强拉曼光谱(Tip-enhance Raman Spectroscopy)是一种基于扫描探针显微镜改进得到的具有超高灵敏度物性检测能力的拉曼光谱扫描探针成像技术。通过在扫描探针显微镜上增加拉曼光谱探测系统,利用金属扫描探针可以对针尖周围的拉曼信号增强的原理,使用拉曼光谱仪探测针尖周围被放大的微弱的拉曼信号,继而实现拉曼信号的扫描成像,可以分辨出在空间分布的不同分子,广泛应用于光学表面检测、化学单个分子检测、生物细胞膜表面分子检测等领域。
通常的针尖拉曼增强即指单针拉曼增强,它是利用金属扫描探针针尖的局域等离子激元效应增强距离针尖13~50nm范围的拉曼信号至原来的10 9倍。单针拉曼增强具有能够实现纳米精度的成像、实现纳米精度的物性检测。但是还存在缺点:由于拉曼信号的强度还不是特别理想,因此在检测单个化学键时,就需要金属扫描探针针尖与金属基底近距离相互作用,这样就会对测量范围产生很大限制,目前的具体做法是把单个化学分子铺在金属基底表面,金属扫描探针与金属基底之间的距离必须保持为几个纳米,利用金属扫描探针、金属基底与入射光之间的等离子增强作用,进行单个化学分子的拉曼探测。因此这种方法只局限与微小的化学分子的检测,并不适用于具有一定高度的物体表面的分子检测,例如细胞膜表面的生物单分子检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、操作方便、可实现细胞膜表面的单分子检测的并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法。
本发明的目的通过以下的技术措施来实现:一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于具体包括以下步骤:
⑴采用扫描探针显微镜单元和拉曼光谱单元,安装在扫描探针显微镜单元的探针微位移调节台上的金属扫描探针为一对,该对金属扫描探针分别与水平面呈夹角设置组成并列双针尖探针,调节探针微位移调节台使并列双针尖探针的针尖接触样品;
⑵开启拉曼光谱单元的激光器,使激光器发出的激光束通过扫描探针显微镜单元的第二显微物镜的光斑汇聚在并列双针尖探针的针尖上,使得金属扫描探针之间发生等离子杂化效应以激发拉曼信号;
⑶调节金属扫描探针在样品的扫描区域中各点的停留时间与拉曼光谱单元的拉曼光谱仪的每个光谱的曝光时间相匹配,使拉曼光谱仪连续记录光谱数据;
⑷耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口,控制扫描探针显微镜单元的样品微位移台带动样品进行扫描;
⑸从拉曼光谱仪上获得拉曼光谱成像,从而实现样品表面单分子的拉曼光谱探测。
本发明利用两个金属扫描探针构建成满足条件的结构,构成具有等离子杂化效应增强作用的并列双针尖拉曼光谱扫描成像技术。可用于物体(样品)表面单分子拉曼光谱检测,具体是采用金属扫描探针之间产生的等离子杂化效应代替现有技术中金属扫描探针和金属基底之间的等离子增强效应,继而实现物体表面单分子的拉曼信号的检测,能够将拉曼信号增强至原来的10 11倍,理论上可以达到单针尖增强拉曼光谱扫描成像技术的100倍以上。因此能够适用于细胞膜表面的分子检测与成像。与现有的单针尖增强拉曼光谱技术相比,本发明具有更高的拉曼信号的信噪比。
作为本发明的一种改进,根据金属针尖的等离子杂化效应的特性,为了得到更好的增强效果,各金属扫描探针的材料为金(Au),且各金属扫描探针针尖之间的距离为0~3nm,各金属扫描探针与水平面的夹角是45~60°。
本发明在所述步骤⑴中,由扫描探针显微镜单元的控制装置开启照明光源并利用成像装置辅助,配合扫描探针显微镜的电脑控件,对探针微位移调节台实施调节以调节并列双针尖探针针尖与样品的距离,且关闭照明光源后,控制样品微位移台带动样品进行扫描,同时控制金属扫描探针在扫描区域中各点的停留时间。
作为本发明的一种实施方式,所述探针微位移调节台包括水平的环形安装板与沿着环形安装板的上板面圆周分布的一对探针微位移台,每个金属扫描探针安装在一个探针微位移台上,所述样品微位移台位于环形安装板的中心;在所述步骤⑴中,在扫描探针显微镜单元的第一显微物镜、分光镜和成像装置的协同配合下,先控制其中一个探针微位移台以调整其上的第一金属扫描探针的针尖接触样品,再控制另一个探针微位移台以调整其上的第二金属扫描探针,使两个金属扫描探针的针尖重合,然后通过反复检测拉曼信号的强度来调整第一金属扫描探针的位置,直至拉曼信号达到最大值,从而完成金属扫描探针位置的调整。
作为本发明的另一种实施方式,所述探针微位移调节台包括水平的环形安装板与设于环形安装板的上板面的探针微位移台,所述金属扫描探针成对安装在该探针微位移台上,所述样品微位移台位于环形安装板的中心。
本发明在所述步骤⑷中,关闭照明光源,放入拉曼光谱单元的第一反射镜,且使第一反射镜倾斜放置,并与拉曼光谱仪的信号接收端口相对以使耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口。
本发明所述扫描探针显微镜单元主要由用于对样品进行显微放大的第一显微物镜、用于将拉曼光源耦合到样品的第二显微物镜、金属扫描探针、用于安装并微调金属扫描探针位置的探针微位移调节台和用于放置样品台并带动样品进行扫描的样品微位移台组成,所述探针微位移调节台设于样品微位移台的外围,所述拉曼光谱单元主要由拉曼光谱仪、激光器和设于拉曼光谱仪的信号接收端口用于过滤激发光波长的滤光片组成,所述第一显微物镜位于第二显微物镜的上方,所述样品微位移台处于第一、第二显微物镜之间,所述金属扫描探针为一对且均朝向样品微位移台的中心伸出以便接触在由样品台承托的样品上。
实现本发明的系统组成结构简单、容易实现、操作方便,可在现有的扫描探针显微镜上改进得到,改造成本较低,进而降低了总体成本。
本发明所述拉曼光谱单元还包括倾斜设置的第一反射镜和第二反射镜,所述第一反射镜与拉曼光谱仪的信号接收端口相对,所述第一反射镜位于所述第一显微物镜的上方且相配合使耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口;所述第二反射镜与激光器的发射端口相对,所述第二反射镜位于第二显微物镜的下方且相配合将拉曼光源耦合到样品。
与现有技术相比,本发明具有如下显著的效果:
⑴本发明可用于物体表面单分子拉曼光谱检测,具体是采用金属扫描探针之间产生的等离子杂化效应代替现有技术中金属扫描探针和金属基底之间的等离子增强效应,继而实现单分子的拉曼信号的检测,能够将拉曼信号增强至原来的10 11倍,理论上可以达到单针尖增强拉曼光谱扫描成像技术的100倍以上。因此能够适用于细胞膜的表面的分子检测与成像,与现有的单针尖增强拉曼光谱技术相比,本发明具有更高的拉曼信号的信噪比。
⑵实现本发明的系统的组成结构简单、容易实现、操作方便,可在现有的扫描探针显微镜上改进获得,改造成本较低,进而降低了总体成本。
⑶本发明的操作过程简单方便,可实现物质表面单分子拉曼光谱检测,尤其适用于具有一定高度的物体的表面的分子检测,也可适用于其它与之类似的场合。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明实施例1的整体结构示意图;
图2是本发明实施例1安装有金属扫描探针的探针微位移调节台和样品微位移台的结构示意图;
图3是双针之间角度和距离的示意图;
图4是本发明实施例2的整体结构示意图;
图5是本发明实施例2安装有金属扫描探针的探针微位移调节台和样品微位移台的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
如图1~3所示,一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,具体包括以下步骤:
⑴采用扫描探针显微镜单元和拉曼光谱单元,安装在扫描探针显微镜单元的探针微位移调节台上的金属扫描探针为一对,该对金属扫描探针分别与水平面呈夹角设置组成并列双针尖探针,调节探针微位移调节台使并列双针尖探针的针尖接触样品,两个金属扫描探针针尖之间的距离d=0~3 nm,且两个金属扫描探针与水平面的夹角是45~60°。
在实施例中,探针微位移调节台包括水平的环形安装板4-7和沿着环形安装板上板面的圆周分布的一对探针微位移台4-1、4-3,探针微位移台4-1、4-3和金属扫描探针4-2、4-4均为一对,金属扫描探针4-2、4-4分别安装在探针微位移台4-1、4-3上,样品台4-6位于样品微位移台4-5的中心;利用扫描探针显微镜单元的控制装置,打开照明光源1,并利用CCD成像系统的辅助,配合扫描探针显微镜的电脑控件,控制扫描探针显微镜的探针微位移台4-1、4-3,分别把金属扫描探针4-2、4-4从两个方向控制接触样品,具体是在扫描探针显微镜单元的第一显微物镜2-1、分光镜9和成像装置3的协同配合下,先控制微位移台4-1以调整其上的金属扫描探针4-2的针尖接触样品,再控制微位移台4-3以调整其上的金属扫描探针4-4,使两个金属扫描探针的针尖重合,然后通过反复检测拉曼信号的强度来调整金属扫描探针4-2的位置,直至拉曼信号达到最大值,从而完成金属扫描探针位置的调整。如图3所示,本实施例中,金属扫描探针4-2、4-4之间的夹角Ψ=60°。
⑵开启拉曼光谱单元的激光器,使激光器发出的激光束由反射镜8-2反射到第二显微物镜上,激光束通过第二显微物镜的光斑汇聚在并列双针尖探针的针尖上,使得金属扫描探针之间发生等离子杂化效应以激发拉曼信号;
⑶扫描探针显微镜单元的控制装置调节金属扫描探针在样品的扫描区域中各点的停留时间与拉曼光谱单元的拉曼光谱仪的每个光谱的曝光时间相匹配,使光谱仪连续记录光谱数据;
⑷关闭照明光源1,放入第一反射镜8-1,且使第一反射镜8-1倾斜放置,并与拉曼光谱仪5的信号接收端口相对以使耦合拉曼信号通过滤光片7进入拉曼光谱仪5的信号接收端口;扫描探针显微镜单元的控制装置控制样品微位移台带动样品进行扫描,使用样品台扫描模式,同时控制金属扫描探针在扫描区域中各点的停留时间;
⑸从拉曼光谱仪上获得拉曼光谱成像,拉曼光谱成像以不同像素点的拉曼光谱信号中的特征峰的强度来表征,从而实现样品表面单分子的拉曼光谱探测。
实现本发明的成像系统是:它包括扫描探针显微镜单元和拉曼光谱单元,扫描探针显微镜单元主要由用于对样品进行显微放大的第一显微物镜2-1、第一反射镜8-1、用于将拉曼光源耦合到样品的第二显微物镜2-2、第二反射镜8-2、分光镜9、成像装置3、金属扫描探针、用于安装并微调金属扫描探针位置的探针微位移调节台4、用于承托样品的样品台4-6和用于放置样品台4-6并带动样品进行扫描的样品微位移台4-5组成,探针微位移调节台设于样品微位移台4-5的外围,拉曼光谱单元主要由拉曼光谱仪5、激光器6和设于拉曼光谱仪5的信号接收端口用于过滤激发光波长的滤光片7组成,第一显微物镜2-1位于第二显微物镜2-2的上方,样品微位移台4-5处于第一、第二显微物镜之间,激光器6发出的激光束与第一显微物镜2-1、第二显微物镜2-2中心轴同轴心,第一反射镜8-1、第二反射镜8-2和分光镜9均倾斜设置,其中,第二反射镜8-2与激光器6的发射端口相对,第二反射镜8-2位于第二显微物镜的下方且相配合将拉曼光源耦合到样品,第一反射镜8-1与拉曼光谱仪5的信号接收端口相对,第一反射镜8-1位于第一显微物镜2-1的上方且相配合使耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪5的信号接收端口;在本实施例中,金属扫描探针为一对,即金属扫描探针4-2、4-4,金属扫描探针4-2、4-4均朝向样品微位移台4-5的中心伸出以便接触在由样品台4-6承托的样品上,金属扫描探针4-2、4-4的针尖之间的距离为0~3 nm,激光器6发出的激光束通过第二显微物镜2-2的光斑汇聚在金属扫描探针4-2、4-4的针尖上,使得金属扫描探针4-2、4-4之间发生等离子杂化效应以激发拉曼信号,拉曼光谱仪收集通过滤光片的样品的耦合拉曼信号,同时样品微位移台带动样品进行扫描,获得拉曼光谱成像,该拉曼光谱成像以不同像素点的拉曼信号中的特征峰的强度来表征,从而实现物体表面单分子拉曼光谱探测。
在本实施例中,成像装置3采用CCD,成像装置3的镜头与分光镜9对准,分光镜9位于第一显微物镜2-1的上方,分光镜9和成像装置3相配合对第一显微物镜2-1放大的样品进行成像。
实施例2
如图4、5所示,本实施例与实施例1的区别之处在于:探针微位移调节台包括水平的环形安装板与设于环形安装板的上板面的探针微位移台,探针微位移台4-8为一个,金属扫描探针为一对4-9、4-10且共同安装在探针微位移台4-8上,样品微位移台4-5位于环形安装板4-7的中心。
在本实施例中,由于金属扫描探针事先按照距离和角度要求做好而安装在探针微位移台上,因此,在进行调节时只需将金属扫描探针调节接近于样品即可,省去了实施例1中调节金属扫描探针之间距离的步骤,因此操作过程更为简单。
本发明的探测原理是:激光器发出的激光束通过第二显微物镜的光斑汇聚在金属扫描探针的针尖上,使得金属扫描探针之间发生等离子杂化效应以激发拉曼信号,即采用金属扫描探针之间产生的等离子杂化效应代替现有技术中金属扫描探针和金属基底之间的等离子增强效应,拉曼光谱仪收集通过滤光片的样品的耦合拉曼信号,同时样品微位移台带动样品进行扫描,获得拉曼光谱成像,继而实现单分子的拉曼信号的检测,因此能够适用于具有一定高度的物体的表面的分子检测。
本发明的实施方式不限于此,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,本发明各金属扫描探针与水平面的夹角是45~60°;实现本发明的系统还具有其它实施方式;因此,本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更,均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (5)
1.一种并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于具体包括以下步骤:
⑴采用扫描探针显微镜单元和拉曼光谱单元,安装在扫描探针显微镜单元的探针微位移调节台上的金属扫描探针为一对,该对金属扫描探针分别与水平面呈夹角设置组成并列双针尖探针,调节探针微位移调节台使并列双针尖探针的针尖接触样品;两个金属扫描探针针尖之间的距离为0~3nm,且两个金属扫描探针与水平面的夹角均是45~60°;所述探针微位移调节台包括水平的环形安装板与设于环形安装板的上板面探针微位移台,所述金属扫描探针成对安装在该探针微位移台上,所述样品微位移台位于环形安装板的中心;
⑵开启拉曼光谱单元的激光器,使激光器发出的激光束通过扫描探针显微镜单元的第二显微物镜的光斑汇聚在并列双针尖探针的针尖上,使得金属扫描探针之间发生等离子杂化效应以激发拉曼信号;
⑶调节金属扫描探针在样品的扫描区域中各点的停留时间与拉曼光谱单元的拉曼光谱仪的每个光谱的曝光时间相匹配,使拉曼光谱仪连续记录光谱数据;
⑷耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口,控制扫描探针显微镜单元的样品微位移台带动样品进行扫描;
⑸从拉曼光谱仪上获得拉曼光谱成像,从而实现样品表面单分子的拉曼光谱探测。
2.根据权利要求1所述的并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于:在所述步骤⑴中,由扫描探针显微镜单元的控制装置开启照明光源并利用成像装置辅助,配合扫描探针显微镜的电脑控件,对探针微位移调节台实施调节以调节并列双针尖探针针尖与样品的距离,且关闭照明光源后,控制样品微位移台带动样品进行扫描,同时控制金属扫描探针在扫描区域中各点的停留时间。
3.根据权利要求2所述的并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于:在所述步骤⑷中,关闭照明光源,放入拉曼光谱单元的第一反射镜,且使第一反射镜倾斜放置,并与拉曼光谱仪的信号接收端口相对以使耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口。
4.根据权利要求3所述的并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于:所述扫描探针显微镜单元主要由用于对样品进行显微放大的第一显微物镜、用于将拉曼光源耦合到样品的第二显微物镜、金属扫描探针、用于安装并微调金属扫描探针位置的探针微位移调节台和用于放置样品台并带动样品进行扫描的样品微位移台组成,所述探针微位移调节台设于样品微位移台的外围,所述拉曼光谱单元主要由拉曼光谱仪、激光器和设于拉曼光谱仪的信号接收端口用于过滤激发光波长的滤光片组成,所述第一显微物镜位于第二显微物镜的上方,所述样品微位移台处于第一、第二显微物镜之间,所述金属扫描探针为一对且均朝向样品微位移台的中心伸出以便接触在由样品台承托的样品上。
5.根据权利要求4所述的并列双针尖增强的拉曼光谱扫描成像方法,其特征在于:所述拉曼光谱单元还包括倾斜设置的第一反射镜和第二反射镜,所述第一反射镜与拉曼光谱仪的信号接收端口相对,所述第一反射镜位于所述第一显微物镜的上方且相配合使耦合拉曼信号通过滤光片进入拉曼光谱仪的信号接收端口;所述第二反射镜与激光器的发射端口相对,所述第二反射镜位于第二显微物镜的下方且相配合将拉曼光源耦合到样品。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |