CN104745585A - 甲基苯丙胺核酸适体、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了甲基苯丙胺核酸适体、检测试剂盒及其应用。具体地，本发明人采用SELEX技术，基于特殊结构的ssDNA文库，成功地筛选得到对甲基苯丙胺有高亲和力和特异性的核酸适体。本发明的适体可应用于现场快速、灵敏地检测甲基苯丙胺。

Description

甲基苯丙胺核酸适体、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域和刑事鉴定技术领域。具体地，本发明提供了甲基苯丙胺核酸适体、检测试剂盒及其应用，尤其在毒物检测中的应用。

背景技术

毒品已经成为愈来愈严重的社会问题。针对缉毒工作的实际需求，需要开发灵敏度高、选择性好、便携式、能耗低、易操作的毒品快速检测技术，以便能够在现场实现灵敏、快速的检测。

目前国内外正对吸毒人员快速现场筛查和液体中毒品检测的主要技术是各种基于免疫反应的产品，主要有酶免疫分析和免疫胶体金技术。

酶免疫分析涉及酶反应，检测步骤繁琐，稳定性差。

免疫胶体金技术虽然检测简便，快速，但灵敏度低、误判率较高，往往只能进行定性测试。此外，受制于抗体的特性，质量控制难度较大，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)俗称冰毒，是一种依赖性极高的精神活性物质，是国家严控的一类精神药品和麻醉药品。目前，国际上苯丙胺类物质的滥用呈不断上升趋势。专家们预测，苯丙胺类兴奋剂将成为21世纪最广泛滥用的药物之一。

随着与甲基苯丙胺相关的刑事案件逐年上升和国家对甲基苯丙胺管理的日趋严格，本领域对甲基苯丙胺和滥用毒品者生物标本中甲基苯丙胺的检测提出了更高的要求。

目前，甲基苯丙胺的检测主要是基于色谱分析方法，例如气质联用色谱分析(GC-MS)和高效液相色谱分析(HPLC)。这些色谱方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要昂贵的仪器设备，且耗时长。

特定的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。其中，胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一种独特的免疫诊断技术，具有免疫反应和色谱层析的特定，与GC-MS比较，胶体金层析技术具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读、无需任何仪器设备等优点。

相对于抗体，适体近年来成为关注的焦点。适体(aptamer)是一类功能性生物分子。目前，大多数适体是从至少约10¹⁴个随机序列的DNA或RNA库中，通过指数富集的系统分子进化方法(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，简称SELEX)筛选出来的。

适体能够特异性地与靶标分子结合，从而特异性地识别靶标分子。理论上，适体可用于各自不同物质的检测，其中包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒，因此具有极大的应用前景。

综上所述，目前甲基苯丙胺的检测技术尚难以令人满意，因此，本领域迫切需要开发新的可现场快速检测甲基苯丙胺的技术。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种可靠方便、操作简单、成本低廉、快速灵敏的甲基苯丙胺检测技术、相关物质及其应用。

在本发明第一方面，提供了一种核酸适体，所述的适体特异性结合于甲基苯丙胺。

在另一优选例中，所述的特异性结合指所述适体结合于甲基苯丙胺但不结合于以下任何一种物质：苯丙胺、可卡因、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、氯胺酮、去甲基氯胺酮、美沙酮、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。

在另一优选例中，所述的适体是通过SELEX技术，从ssDNA文库中筛选获得的单链核酸分子。

在另一优选例中，所述的适体包括DNA、RNA、或DNA/RNA杂合分子。

在另一优选例中，所述的适体的长度为30-100个碱基。

在另一优选例中，所述的适体为单链或双链。

在另一优选例中，所述的适体带有可检测标记物。

在另一优选例中，所述的适体是分离的或纯化的。

在另一优选例中，所述的适体的纯度≥90%，较佳地≥95%，更佳地≥99%。

在另一优选例中，所述的适体的序列如SEQ ID NO.:1、2、3、4或5所示。

在本发明的第二方面，提供了一种偶联物，所述偶联物包括本发明第一方面所述的核酸适体以及与所述核酸适体相连的可检测标记物。

在另一优选例中，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种复合物，所述的复合物是(a)本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物与(b)甲基苯丙胺所形成的复合物。

在本发明的第四方面，提供了一种检测制品，所述检测制品含有本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物。

在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在另一优选例中，所述的检测制品用于检测甲基苯丙胺。

在本发明的第五方面，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明第一方面所述的核酸适体，本发明第二方面所述的偶联物和/或本发明第四方面所述的检测制品。

在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述偶联物的用途，用于制备检测甲基苯丙胺的检测制品或试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在本发明的第七方面，提供了一种检测甲基苯丙胺的方法，包括以下步骤：

(a)提供待检测的样品；

(b)将该样品与本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物混合，形成混合物；

(c)检测所述混合物中“甲基苯丙胺-核酸适体复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在甲基苯丙胺；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在甲基苯丙胺。

在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。

在另一优选例中，在步骤(c)中，包括与标准品或标准曲线进行比较，从而确定在所述混合物中是否存在复合物，和/或所述复合物的数量。

在另一优选例中，所述方法用于毒品检测、药物检测或食品安全检测，更优选的，所述方法用于毒品检测。

在本发明的第八方面，提供了一种核酸序列，所述核酸序列是序列如SEQ IDNO.:1-5所示序列的反义序列。

在本发明的第九方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有(i)载体以及(ii)本发明第一方面所述的核酸适体、本发明第二方面所述的偶联物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示了PCR条件优化产物2%琼脂糖凝胶电泳图谱。其中各泳道如下：泳道M：间隔为50bp的分子量标准；泳道1-5：退火温度为53℃、55℃、57℃、59℃、61℃的扩增产物。

图2显示了第1-10轮PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳图谱。其中各泳道如下：泳道M：间隔为50bp的分子量标准；泳道1-10:第1-10轮的PCR产物。

图3显示了SPR测定的每轮ssDNA和甲基苯丙胺完全抗原的结合率。

图4显示了本发明部分甲基苯丙胺适体的二级结构。

图5显示了本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了特异性针对甲基苯丙胺的核酸适体。本发明人采用SELEX技术，基于特殊结构的ssDNA文库，成功地筛选得到对甲基苯丙胺有高亲和力和高特异性的核酸适体。本发明的适体可应用于现场快速灵敏地检测甲基苯丙胺。在此基础上完成本发明。

具体地，本发明人先在体外构建了全长为76bp的ssDNA文库，以溴化氰活化琼脂糖为固相载体，甲基苯丙胺完全抗原为靶分子，进行SELEX筛选；并利用SPR测定每轮ssDNA文库和甲基苯丙胺的结合亲和力，通过MFOLD分析软件对适体进行二级结构预测和结合位点分分析。通过多次试验，本发明人获得了特异性适体得到逐步富集的文库。经过进一步测序、分析和验证，本发明人确定了多个具有茎-环结构的、与甲基苯丙胺存在有效结合的核酸适体。

试验表明，本发明的甲基苯丙胺核酸适体可特异性结合于甲基苯丙胺并用于检测甲基苯丙胺，与其它药物、毒品不发生任何交叉反应，证实了本发明核酸适体具有高度的特异性。在鉴别不同的毒品和类似物方面，具有重大的使用价值。在灵敏度方面，本发明结果显示，基于核酸适体的甲基苯丙胺检测比单克隆抗体的检测方法灵敏度要高出2倍以上。

本发明的核酸适体本身是一段单链DNA或RNA，可以耐受高温，pH值得变化，比抗体具有更高的稳定性，易于长期保存。核酸适体还具有可体外人工化学合成、精确性高、重复性好、无批次间差异等特点，在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。

术语

如本文所用，术语“甲基苯丙胺”指Methamphtamine，又称甲基安非他明。

如本文所用，术语“含有”或“包括”可以是开放式的或封闭式的，即包括了“由……构成”。

SPR

SPR（表面等离子共振，Surface Plasmon Resonance）是利用金属膜/液面界面光的全反射连接引起的一种物理光学现象来分析生物分子间相互作用的仪器。

SELEX筛选

SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集配体系统进化技术)技术，指由Tuerk和Gold等人开发研究的一种新的组合化学技术。它应用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，可获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适体(aptamer)。

SELEX筛选具有库容量大、靶分子范围广等优点。

在本发明中，基于本发明人特殊构建的一个ssDNA文库，通过SELEX技术，并经过多次和多轮筛选，成功获得了多个特异性针对甲基苯丙胺的核酸适体。

本发明所用的ssDNA文库中，ssDNA的全长76bp，中间为40bp的随机核苷酸序列，由A、G、C、T密码子随机组合。这样，在理论上，可提供4⁴⁰个序列组合，即理论库容量为10¹⁵，因此可以很好地满足筛选适体的需求。

适体

如本文所用，“适体”、“适配体”、“适配子”和“aptamer”可以互换使用，指能够与特定的靶分子(如甲基苯丙胺)结合的核酸序列，包括DNA适体、RNA适体、杂合类型的适体、或其他类型的适体。此外，在本发明中，适体还包括单链和双链形式，尤其是单链形式的适体。

如本文所用，“核酸适体”和“寡核苷酸适体”可以互换使用。核酸适体是通过SELEX技术筛选得到的一类寡核苷酸分子，能与靶分子强特异、高亲和力地结合。通常，核酸适体是一种小的(通常约40-100碱基对)的合成寡核苷酸。

如本文所用，术语“本发明的适体”、“本发明的核酸适体”可互换使用，指能够特异性地和高亲和力地与甲基苯丙胺结合的核酸适体。

在本发明中，一类优选的适体是通过SELEX筛选获得的，序列如SEQ ID NO.:1－5所示的核酸适体。

本发明的核酸适体的分子质量小、免疫原性低，且可进行化学合成、改造与标记。

如本文所用，术语“特异性”是指本发明的适体能结合于甲基苯丙胺，较佳地，指那些能与甲基苯丙胺结合但不识别和结合于其它毒物的适体。

本发明的适体可以用常规方法进行制备，例如人工全合成或PCR方法。

本发明核酸适体(Aptamer)是可以折叠成三维结构的、通过空间构型互补与靶分子结合的一段短的单链寡核苷酸序列,即单链DNA(ssDNA)或RNA。

另外,本发明适体可体外人工化学合成，具有精确性高、重复性好、无批次间差异、变性与复性可逆、稳定性好并易于长期保存等优点。

此外，在本发明中，还可将多功能的分子或可检测标记物准确、有效地连接到适配体特定位点，从而使得适体更适合对靶分子进行检测。

研究表明，适体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但本发明适体对靶分子(甲基苯丙胺)具有极高的特异性和亲和力，并且易于进行功能化修饰，故非常适合制备灵敏、快速、可靠的现场检测制剂和测试片。

本发明的核酸适体是从随机的序列库中筛选出来，具有广泛的适用性和高效率。

本发明还提供了基于本发明高亲和性和特异性核酸适体的传感器。胶体金纳米颗粒(GNPs)具有独特的电子、光电和催化特征，使得它的应用十分引人注目。在以往的研究中，用胶体金来开发核酸适体生物传感器，胶体金通常用来作为重要的显色物质，因为胶体金颗粒具有很强的可见颜色特征。

在本发明中，可通过胶体金交联的核酸适体与互补序列杂交的原理，来检测靶分子(甲基苯丙胺)。

检测制品

本发明还提供了可用于检测甲基苯丙胺的检测制品。

在本发明中，代表性的检测制品包括(但并不限于)：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在本发明中，检测试剂的形式没有特别限制，可以是固态、或液体，也可以是微球、胶体等形式。

一类特别有用的检测试剂是本发明适体与可检测标记物形成的偶联物。

在本发明中，可检测标记物的种类没有特别限制，代表性的可检测标记物包括(但并不限于)：生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的化学荧光基团包括Eva Green、罗丹明、FITC、TRITC、或其组合。

在另一优选例中，放射性同位素包括³²P、¹²⁵I、³⁶S等。

在另一优选例中，所述的化学发光基团包括鲁米诺等。

在本发明中，一类特别优选的检测制品是核酸芯片。在所述核酸芯片上，通常特定有多种探针，其中，所述芯片包括本发明的特异性针对甲基苯丙胺的核酸适体，利用本发明适体与甲基苯丙胺可形成“适体－甲基苯丙胺”二元复合物的原理，可检测样本中所含甲基苯丙胺的存在与否以及含量。

一种优选的检测甲基苯丙胺的芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸，所述的寡核苷酸的序列SEQ ID NO:1-5所示的序列。其中，所述固相载体没有特别限制，可采用基因芯片领域的各种常用材料，代表性的固相载体包括但不限于：尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

层析侧流片

一种优选的便于现场快速检测的检测制品是利用本发明适体所制备的层析侧流片。

在本发明中，一种优选的检测试剂是利用侧流原理的层析侧流片(板)或层析试纸条。

本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构如图5所示，其中包括：1样品垫，2适体释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。

在本发明中，所述侧流片的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

为了便于理解本发明，给出本发明层析侧流片的检测原理。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。

如果待测样品中含有甲基苯丙胺，则甲基苯丙胺将与本发明核酸适体结合形成“核酸适体－甲基苯丙胺”复合物，一起沿硝酸纤维膜向前流动，到达检测线位置时，被固定在膜上的捕获剂捕获(例如可将适体带有生物素标记物，而检测线带有亲和素)，形成有色的条带，则为阳性，反之，则为阴性。此外，对照线(或质控线)用于说明检测系统工作正常。

当然，也可以采用其他方式来检测“核酸适体－甲基苯丙胺”复合物的形成与否和/或数量。

本发明的检测板结构简单、轻便，易于携带，可以现场检测，而且不需要昂贵的设备。使用本发明的检测板检测甲基苯丙胺，整个测试可在3-5分钟内完成，检测的灵敏度可达约5-10ng(例如5ng/ml)，与其他常见药物、毒品(尤其是麻黄碱或伪麻黄碱)没有交叉反应。

检测时，可平放检测板，将试样滴在滤样纸上，适量试样(通常约120μl)，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果，

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

如果检测线较浅于质控线说明被测者吸食过此毒品但已代谢到末尾或用量较小，所以质控线也是检测板判别吸毒状况的标准。

检测试剂盒

本发明还提供了可用于检测甲基苯丙胺的检测试剂盒。

在本发明中，检测试剂盒中可含有本发明的核酸适体、偶联物、复合物(作为对照品)、检测试剂、和/或检测芯片。

所述的试剂盒可用于检测本发明的核酸适配体－甲基苯丙胺复合物，从而用于检测甲基苯丙胺这类小分子毒物。

此外，所述的试剂盒中还可包括任选的用于检测的其他试剂，例如用于显色等所需的各种试剂，包括但不限于：酶、对照液、显色液等。

所述的试剂盒中还可包括使用说明书。优选地，所述说明书中可包括标准曲线等信息。

本发明的主要优点包括：

1.高特异性。本发明适体对甲基苯丙胺有高特异性，而与其他常见毒物无结合力。试验检测了与50多种毒品或药品，结果仅甲基苯丙胺为阳性，其它均为阴性。

2.高灵敏度。本发明的适体可用于测试尿样等多种样品中含有的甲基苯丙胺，进行灵敏度测试，甲基苯丙胺的最低检测量可达到5ng/ml。

3.稳定性高。本发明适体比蛋白抗体更稳定，容易长时间保存，因此有效期大大延长。

4.检测时间短。通常，只要常温放置3-5分钟获得检测结果。

5.生产成本低。适体及其核酸结合物只要通过相对简单的化学合成和PCR扩增等方法制备，成本远低于蛋白抗体等检测试剂。

6.检测操作简便，无需昂贵的仪器和复杂的操作，可现场进行。

7.本发明适体的质量易于控制，不同批次产品质量几乎完全相同。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料和仪器

1材料

体外设计和合成76bp的随机ssDNA文库：5'-GCG GAT GAA GAC TGGTCT-N40-GCC CTA AAT ACG AGC AAC-3'(SEQ ID NO.:6)，上游引物F：5'-FAM-GCGGATGAAGACTGGTCT-3'(SEQ ID NO.:7)，下游引物R：5'-Biotin-GTTGCTCGTATTTAGGGC-3'(SEQ ID NO.:8)。

其中，N40代表随机序列。

文库和引物均有上海英骏生物技术有限公司合成；试剂中所用胶纯化试剂盒、链霉亲和素磁珠、溴化氰活化琼脂糖、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-乙基-N-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)都购于Sigma公司；2×PCR mix购自于天根；甲基苯丙胺完全抗原购自杭州隆基生物技术有限公司。

2仪器

PCR仪(AB)、全自动凝胶成像分析仪(Syngene)、电泳仪(Tanon)、培养箱(Shel Lab)、BI-300型表面等离子体共振仪(Biosensor Instrument)

实施例1

甲基苯丙胺完全抗原与溴化氰活化琼脂糖偶联

称2g溴化氰活化琼脂糖，活化后与5mg甲基苯丙胺完全抗原孵育过夜，用0.1M NaHCO₃(含0.5M NaCl)洗涤，离心弃上清。用0.2M甘氨酸进行封闭过夜。封闭后用Binding buffer(20mmol/L Tris-HCl，137mmol/L NaCl5mmol/LKCl，2mmol/L CaCl₂，1mol/l MgCl₂)洗涤，洗涤完装入亲和层析柱中。按如上方法制备含BSA的亲和层析柱作为阴性柱。

实施例2

SELEX筛选

方法如下：

(1)结合：将200pmol/L的ssDNA库95℃热变性10min，迅速冷却到0℃，5min之后将ssDNA文库先加入阴性柱进行反筛选，收集液体再加入含甲基苯丙胺的柱子，用Binding Buffer洗3次。

(2)洗脱：加入100μg/ml甲基苯丙胺进行洗脱，收集洗脱液进行PCR。

(3)PCR反应：PCR反应体系：ssDNA模板23μl，上游引物1μl，下游引物1μl，10×PCR缓冲液25μl。PCR反应条件：95℃预变性3min，25个循环的95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min。(其中，优化试验的结果如图1所示。)

(4)纯化：将PCR产物走2%的琼脂糖胶，把相应的胶切下并纯化。

(5)ssDNA次级库的合成：将ssDNA用生物素化引物P C R扩增，PCR产物与链亲和素磁珠在1×B&W缓冲液(pH7.5，10mM Tris-HCL，1mM EDTA，2M NaCl)室温条件下结合30min左右。用1×B&W缓冲液洗涤2～3次，加入150mM NaOH37℃孵育15min，使dsDNA解链，用磁力架分离，使含生物素的一条ssDNA留在链霉亲和素磁珠(市售)上，而另一条不带生物素的ssDNA用于下一轮筛选的次级文库。

(6)重复以上步骤10轮。

结果，各筛选过程中的PCR检测结果如图2所示。

实施例3

SPR检测每轮ssDNA文库与甲基苯丙胺完全抗原的结合率

(1)CM5传感片的包被：2mM Cys1ml滴在金膜上孵育12h，再将15mM NHS和75mM EDC(新鲜配制)与6mg/ml CM-dextran进行混合并滴在金膜表面3h。

(2)结合率的测定：将流速控制在40μl/min，先通过一段连续的BindingBuffer缓冲液直至基线稳定。当基线稳定后，注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶联试剂200μl，活化CM5传感片上的羧基。将甲基苯丙胺完全抗原用Binding Buffer稀释至5mg/ml，注射该溶液200μl，由于BSA上的氨基与传感片上活化的酯基发生氨基偶联反应而使甲基苯丙胺被固定在传感片上。注射200μl的1M乙醇胺溶液，用来封闭金膜上尚未发生偶联反应的酯基。最后注入200μl的Binding Buffer除去非特异吸附的乙醇胺。将第1轮到第10轮的ssDNA分别注入仪器中，与金膜表面上的甲基苯丙胺作用一段时间，用20mM的NaOH再生液使基线恢复，实时采集响应信号。重复以上相同步骤来检测BSA(阴性对照)是否结合适体。

结果

每轮筛选产物与甲基苯丙胺完全抗原亲和力测定结果如下：

运用SPR检测每轮ssDNA文库与甲基苯丙胺完全抗原的亲和力，阴性对照使用BSA检测每轮ssDNA文库，图3可见，RU值从第1轮的88.3上升到第8轮的110.9，呈上升趋势。自第8轮之后的两轮的RU值无明显变化，说明适体与甲基苯丙胺完全抗原的结合亲和力达到饱和。BSA的阴性对照显示每轮ssDNA文库与BSA完全没有响应。这说明，本发明所筛选出的适体只和甲基苯丙胺结合，不和BSA结合。

经过10轮筛选后，本发明人出乎意料地发现亲和力由88.3RU上升到113.7RU，表明特异性适体得到逐步富集。

实施例4

克隆、测序以及适体结构预测与分析

最后一轮筛选的产物经PCR扩增纯化后，连接到市售的pUC-T载体(购自Canada Sangon Ltd.)上，在转化到感受态细胞中，通过培养、蓝白斑筛选，挑出10个白色菌落，摇菌，对菌液提取质粒进行电泳验证，挑出10个阳性克隆送去上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

将测序获得的适体序列用Clustal X和MFOLD软件分析适体一级结构的同源性，并进行二级结构的预测。

结果：

经分析，有10个克隆子测序成功。如表1所示，A05、B09-891、E06-924和H11的序列是一致的，B03和F07-937的序列是一致的，G06和G11的序列是一致的。

表1.适体测序结果

通过软件预测了5个有活性的适体的二级结构，即A05，B03，E08，E01，G06(图4)，发现这些预测的结构图都含有茎-环结构。可分为两类：第一类为A05，B03和E08，主要是5'端和3'端的固定序列形成了一个大的环状结构，中间随机序列形成了茎-环结构。第二类为E01和G06，主要是5'端和3'端的固定序列分别和随机序列形成了茎-环结构。

值得注意的是，所述10个序列在二级结构上都具有茎-环结构，这提示这些茎-环结构是适体和甲基苯丙胺结合的基础。

讨论

适体是通过SELEX技术筛选出来的一段寡核苷酸序列。它的稳定性，亲和力和特异性都优于抗体；通过体外筛选，减少动物的使用；变性与复性可逆无批间差异，可修饰并易于长期保存和室温运输等。大分子物质如蛋白、细胞等适体的筛选采用离心、沉淀的方法就可以筛选得到，而小分子物质首先必须将其固定或包被在固相载体上，制成亲和介质后方可进行SELEX筛选。本研究采用小分子的完全抗原进行筛选，利用BSA将小分子固定在亲和层析柱上，克服了小分子难以固定在固相介质的难题，为了去除与固相介质结合和BSA的非特异性反应，本发明人在每2轮筛选后进行一次反筛选，即用次级文库先与偶联BSA的亲和层析柱结合反应一定时间后，再与偶联甲基苯丙胺完全抗原的亲和层析柱进行筛选，反筛对于从复杂的核酸序列中筛选针对靶分子的特异的适体价值较大，即降低了筛选背景，又增加SELEX筛选的严谨性，所以进行反筛选是必不可少的。

SELEX筛选第一轮使用的文库为合成的随机寡核苷酸文库，次级文库主要来源于：(1)生物素-链霉亲和素磁珠分离法。(2)不对称PCR法。有报道称^[11]，随着筛选轮数增加，不对称PCR得到的产物非特异性明显增加，该法得到的ssDNA文库不够稳定。所以本发明人采用了生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备次级文库。

经过10轮的筛选，用2%的琼脂糖凝胶电泳验证发现，随着轮数的增加，条带越来越清晰明亮，说明适体的特异性也在逐步提高。通过用SPR测定每轮ssDNA文库和甲基苯丙胺完全抗原的结合率显示，结合率从88.3RU上升到113.7RU，说明了与甲基苯丙胺特异结合的适体得到明显的富集。

本研究利用SELEX技术已初步筛选出了针对甲基苯丙胺的核酸适体，为建立毒品毒物现场快速检测奠定了基础。

实施例5

核酸适体的特异性

选用的交叉反应物质为苯丙胺、可卡因、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、氯胺酮、去甲基氯胺酮、美沙酮、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺共64种药品和毒品。

将上述检测物质配制成一定浓度的溶液，用实施例4所述的试剂盒进行检测。

结果表明：核酸适体检测试剂(SEQ ID NO.:1－5)都仅与甲基苯丙胺发生反应，与其他物质没有交叉反应，甲基苯丙胺核酸适体检测试剂盒具有特异性强、准确可靠的性能。

实施例6

核酸适体的灵敏度

灵敏度测试：在空白尿样中添加甲基苯丙胺，分别配制成一系列梯度浓度(1.0～2000.0ng/mL)的溶液来测试甲基苯丙胺试剂盒。

结果表明，本发明核酸适体(SEQ ID NO.:1-3)的甲基苯丙胺的最低检测灵敏度均为50ng/mL以下。与胶体金标记甲基苯丙胺单克隆抗体的免疫检测试剂盒相比，其灵敏度高出至少2倍以上。

实施例7

核酸适体检测的准确性

将本发明的核酸适体(SEQ ID NO.:1、2或3)的检测结果与GC-MS检测结果的对比。

结果表明，本发明试剂盒的准确性达到100%(其中，阈值设定为200ng/ml)。

实施例8

检测试剂盒的稳定性

将胶体金标记的甲基苯丙胺检测试剂盒密封后置于烘箱45℃温度下破坏性试验一个月，然后用200.0ng/mL的甲基苯丙胺以及阴性样本进行测试，与未烘烤过的试剂盒检测结果一致。表明该核酸适体甲基苯丙胺检测试剂盒具有良好的稳定性。

讨论

本发明的核酸适体作为特异性识别甲基苯丙胺的有效手段，在检测试剂盒的研究中具有广阔的应用前景。例如，可以开发成“DNA适体探针现场快速定性、定量检测甲基苯丙胺毒品试剂盒”产品。

本发明的核酸适体可以在体外合成，免去了免疫动物，制备抗体的繁琐工序，可以大批量生产，具有高度的一致性。利用核酸适体制备的试剂盒也具有很好的质量控制，具备极高的产品稳定性。同时，核酸适体技术可以制备高特异性的探针，从而有效区分出分子结构相似的小分子物质(包括将甲基苯丙胺与其他毒品区别开)，这一点在鉴别不同的毒品过程中尤为重要。

由于本发明具有重复性好、无批次间差异等特点，因此在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种核酸适体，其特征在于，所述的适体特异性结合于甲基苯丙胺，其中所述的特异性结合指所述适体结合于甲基苯丙胺但不结合于以下任何一种物质：

苯丙胺、可卡因、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、氯胺酮、去甲基氯胺酮、美沙酮、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。

2.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述的适体的序列如SEQ IDNO.:1、2、3、4或5所示。

3.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求1所述的核酸适体以及与所述核酸适体相连的可检测标记物。

4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

5.一种复合物，其特征在于，所述的复合物是(a)权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述的偶联物与(b)甲基苯丙胺所形成的复合物。

6.一种检测制品，其特征在于，所述检测制品含有权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述的偶联物。

7.如权利要求6所述的检测制品，其特征在于，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1所述的核酸适体，权利要求3所述的偶联物和/或权利要求6所述的检测制品。

9.如权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述偶联物的用途，其特征在于，用于制备检测甲基苯丙胺的检测制品或试剂盒。

10.一种检测甲基苯丙胺的方法，包括以下步骤：

(a)提供待检测的样品；

(b)将该样品与权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述的偶联物混合，形成混合物；

(c)检测所述混合物中“甲基苯丙胺-核酸适体复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在甲基苯丙胺；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在甲基苯丙胺。