CN104745539A - 羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法。传统的羊口疮病毒都是从结痂和患病羊的口唇皮屑中分离的，分离周期长，需要盲传5代后才会有病变，同时，病料来源范围小，限制的羊口疮病毒的研究工作。本发明使用特有的Virus holder 溶液对唾液、乳汁、内脏等样品进行离心过滤处理后，接种于牛睾丸原代细胞中培养后弃去毒液；加细胞维持液培养后收毒；反复冻融收集细胞培养物，从第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。本发明使用特有的Virus holder溶液处理样品，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒，取材范围大，病毒分离周期短，稳定性高，能够很好的保持病毒的完整性和活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒分离方法，具体涉及一种羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法。
背景技术
羊传染性脓疱俗称羊口疮（Orf），是一种由口疮病毒所致的人兽共患传染病，多发与绵羊和山羊，世界卫生组织（IOE）将该病列为需要申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病几乎分布于世界所有养羊的国家，自然情况下主要侵染山羊和绵羊，山羊较为易感。本病常呈群发性流行，3-6月龄羔羊最易感，成年羊发病较少，病羊和带毒羊是本病的主要传染源。病毒可随病羊的唾液、脓疱和水疱分泌物以及脱落的痂皮排出，其传播途径主要是经损伤的皮肤或粘膜而感染。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的饲槽、饲料、饮水、用具、垫草、牧场及厩舍等而感染。
传统的羊口疮病毒分离方法仅限于从具有明显病变特征的发病羊的结痂样品中分离羊口疮病毒。我们在实际调查中发现，很多羊只虽然不发病，外观上没有出现相应病变特征，但其体内却携带有羊口疮病毒。传统的分离方法无法从此类带毒羊的组织样品中分离出羊口疮病毒，极大地限制了科研人员快速及时广泛地获取各地羊口疮野毒株；另外，传统的病毒分离方法需要将病毒盲传5代才会出现病变，比较费时。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，能够从病毒含量极低的唾液、乳汁、肝脏、肾脏等样品中分离羊口疮病毒，为羊口疮病毒的分离、研究提供便利。
本发明所采用的技术方案是：
羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
12000～16000r/min离心5～10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗2～3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000～5000r/min离心5～10min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%～90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1～1.5h后弃去毒液；
加5～10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2～3天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基
本发明具有以下优点：
本发明使用特有的Virus holder溶液处理样品，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒，同时具有以下优势：
1）取材范围大，采集的病料可以是病毒含量极低的唾液、乳汁、肝脏、肾脏等样品，这是传统的羊口疮病毒分离方法所不能实现的；
2）省时，病毒分离周期短，只需盲传3代就可观察到病变；
3）稳定性高，Virus holder 溶液能够很好的保持病毒的完整性和活性。
附图说明
图1为未接种羊口疮病毒的牛睾丸细胞图。
图2为盲传至第3代羊口疮病毒接种牛睾丸细胞48h后病变图，细胞变圆，脱落。
图3为盲传至第3代羊口疮病毒接种牛睾丸细胞72h后病变图，大量细胞变圆，出现空斑。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
Virus holder 溶液为一种等渗溶液，与常规样品处理时使用的PBS、D-Hanks液相比，Virus holder 溶液中的Tris提供了一个良好的细胞裂解环境，EDTA能够抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对病毒核酸的破坏，NaCl则起到维持病毒核酸结构稳定性的作用。Virus holder溶液可以很好的保持病毒的完整性和活性，提供了一个可高效提高病毒分离率的处理方法。本发明中，Virus holder 溶液各组分的含量专一适用于羊口疮病毒分离使用，使用该Virus holder溶液处理样品后，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒。
本发明涉及的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，由以下步骤实现：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
12000～16000r/min离心5～10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
肝脏、肾脏等内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗2～3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000～5000r/min离心5～10min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%～90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1～1.5h后弃去毒液；
加5～10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
配制500 mL Virus holder 溶液的方法为：
先称量0.605g Tris放入洗净的烧杯中，再称取4.38g NaCl 放入烧杯中，然后加入0.73g EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整PH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2～3天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
实施例1：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
12000r/min离心10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
肝脏、肾脏等内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗2次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，5000r/min离心5min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1h后弃去毒液；
加10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
配制500 mL Virus holder 溶液的方法为：
先称量0.605g Tris放入洗净的烧杯中，再称取4.38g NaCl 放入烧杯中，然后加入0.73g EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整PH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
实施例2：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
14000r/min离心7min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
肝脏、肾脏等内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗2次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，4000r/min离心7min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底85%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1h后弃去毒液；
加7mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
配制500 mL Virus holder 溶液的方法为：
先称量0.605g Tris放入洗净的烧杯中，再称取4.38g NaCl 放入烧杯中，然后加入0.73g EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整PH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
实施例3：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
16000r/min离心5min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
肝脏、肾脏等内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000r/min离心10min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1.5h后弃去毒液；
加5mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
配制500 mL Virus holder 溶液的方法为：
先称量0.605g Tris放入洗净的烧杯中，再称取4.38g NaCl 放入烧杯中，然后加入0.73g EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整PH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养3天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
实施例4：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
14000r/min离心10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
肝脏、肾脏等内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次， 3000r/min离心10min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后弃去毒液；
加10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
配制500 mL Virus holder 溶液的方法为：
先称量0.605g Tris放入洗净的烧杯中，再称取4.38g NaCl 放入烧杯中，然后加入0.73g EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整PH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2-3天待用。
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
本发明各取羊口疮病原阳性肝肾样品20份、唾液样5份、乳样5份，都成功分离出羊口疮病毒，分离率100%。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (4)
1.羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：材料的处理：
唾液、乳汁样品的处理方法：
12000～16000r/min离心5～10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
内脏样品处理方法：
取0.5g样品，用无菌PBS洗2～3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000～5000r/min离心5～10min后取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；
步骤二：病毒分离：
取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%～90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1～1.5h后弃去毒液；
加5～10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；
反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。
2.根据权利要求1所述的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：
步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；
Virus holder 溶液的配置方法为：
先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22μm滤膜过滤后，4℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：
步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO2培养2～3天待用。
4.根据权利要求3所述的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：
步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。
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2015
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533660A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| JOSEPH ESPOSITO ET AL: "The preparation of orthopoxvirus DNA", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| 高晶晖等: "羊口疮病毒威海株的分离鉴定", 《动物医学进展》 * |
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